Luận án phát hiện một số đột biến gen và đối chiếu kiểu gen với kiểu hình của bệnh nhi thalassemia tại bệnh viện trẻ em hải phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ẠI BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG ĐỖ THỊ QUỲNH MAI Ỗ THỊ QUỲNH MAI PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN VÀ ĐỐI CHIẾU KIỂU GEN VỚI KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHI THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRẺ EM HẢI PHÒNG Chuyên ngành : Nhi khoa Mã số : 97.20.106 TểM TT LUN N TIN S hụ TS Phạm Văn Träng HẢI PHỊNG - 2022 i CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Ngọc Sáng TS Bạch Thị Như Quỳnh Phản biện 1: GS TS Phản biện 2: PGS TS Phản biện 3: PGS TS Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Vào hồi 00 phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Y Dược Hải Phòng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia nhóm bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh đột biến gen globin gây thiếu hụt tổng hợp phần hay toàn mạch polypeptid Hiện có khoảng 7% dân số giới mang gen bệnh Bệnh ảnh hưởng đến hầu hết quốc gia, có khác biệt đáng kể khu vực địa lý nhỏ Việt Nam nằm “vành đai Thalassemia” Theo thống kê, nước ta quốc gia có tỷ lệ người mắc bệnh Thalassemia cao giới Tại Hải Phịng, vấn đề chẩn đốn quản lý bệnh Thalassemia thực song chưa thực khống chế kiểm sốt bệnh Từ dẫn đến việc lan truyền nguồn gen gây bệnh từ hệ sang hệ khác, làm suy thối giống nịi mang lại nhiều hậu nặng nề cho gia đình xã hội Từ thực tế trên, chúng tơi băn khoăn rằng: Đột biến gen bệnh nhi Thalassemia Hải Phòng nào? Việc quản lý nguồn gen bệnh đem lại hiệu sao? Đây việc cần thiết tối quan trọng, góp phần tạo móng cho việc phịng ngừa chủ động, lấy giải pháp phòng bệnh làm chiến lược giải vấn đề Thalassemia, tiến tới bước đầu loại bỏ giảm nguồn gen gây bệnh Vì vậy, thực đề tài: “Phát số đột biến gen đối chiếu kiểu gen với kiểu hình bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng” với mục tiêu sau: 1, Xác định số đột biến gen bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng từ 01/01/2016 đến 31/12/2020 2, Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phịng 3, Mơ tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng theo gen đột biến bước đầu xây dựng số phả hệ bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phịng NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu xác định tỷ lệ kiểu đột biến gen gây bệnh đặc điểm di truyền bệnh thông qua nghiên cứu số phả hệ bệnh nhân Thalassemia điều trị BVTEHP Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định loại đột biến xét nghiệm khác (tổng phân tích tế bào máu, sinh hóa máu,…) để đánh giá góp phần sàng lọc bệnh Thalassemia Phát đột biến gặp giới nói chung Việt Nam nói chung Nghiên cứu toàn diện bệnh Thalassemia: Nguyên nhân bệnh (kiểu đột biến), di truyền qua hệ, triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị theo dõi kết điều trị CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Phần luận án dài 139 trang, bao gồm phần sau: Đặt vấn đề: trang; Chương 1- Tổng quan: 36 trang; Chương - Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 16 trang; Chương - Kết nghiên cứu: 39 trang; Chương - Bàn luận: 37 trang; Kết luận: trang; Những đóng góp mới: trang; Hạn chế: trang; Khuyến nghị: trang; Hướng nghiên cứu tiếp theo: trang Luận án có 148 tài liệu tham khảo, 60 tài liệu tiếng Việt 88 tài liệu tiếng Anh Luận án có 40 bảng, 24 hình, sơ đồ Chương TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh Thalassemia 1.1.1 Dịch tễ học Thalassemia bệnh rối loạn di truyền phổ biến giới, bệnh có liên quan đến nguồn gốc dân tộc Bệnh phân bố tồn cầu, song có tính địa dư, thường gặp vùng Địa Trung Hải, khu vực Trung Đông, Đông Nam Á Bắc Phi Theo báo cáo Liên đoàn Thalassemia quốc tế, số người mang gen bệnh Thalassemia chiếm khoảng 7% dân số tồn cầu Ở Đơng Nam Á nói chung Việt Nam nói riêng, tỷ lệ người mang gen Thalassemia cao Hiện nay, tượng giao thoa dân tộc dịch chuyển địa lý khiến gen bệnh lan rộng gia tăng đáng kể khắp nước Tại thành phố lớn xuất nhiều người mang gen bệnh 1.1.2 Cơ chế di truyền bệnh Thalassemia Bệnh α-Thalassemia đột biến gen mã hóa tổng hợp chuỗi α globin làm giảm khơng có chuỗi α globin phân tử hemoglobin Sự suy giảm tổng hợp dẫn đến tăng tổng hợp mức chuỗi β globin tạo phân tử γ4-gọi Hb Bart’s (trong thời kỳ bào thai) β4- gọi HbH (trong thời kỳ trưởng thành) Chuỗi α globin tổng hợp từ gen, có gen HBA1 gen HBA2 Số lượng chuỗi α-globin phụ thuộc vào số gen hoạt động Vùng gen gây bệnh α-Thalassemia nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3), nhiễm sắc thể có gen HBA1 (gen alpha 1) gen HBA2 (gen alpha 2) Gen HBA1 có chiều dài 840bp bao gồm exon intron Gen HBA2 có chiều dài 830bp bao gồm exon intron Mất đoạn lớn dạng SEA chiếm khoảng 90% Bệnh β-Thalassemia xảy đột biến điểm locus tạo chuỗi β làm giảm chức gen mã hóa cho việc tổng hợp β globin, dẫn đến giảm không tổng hợp chuỗi β globin Vùng gen HBB quy định tổng hợp chuỗi beta globin nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) dài 1600bp, gồm exon intron Khi có đột biến gen HBB gây giảm không sản xuất chuỗi β globin hemoglobin Ngày có 300 đột biến tìm thấy gen HBB gồm nhóm: nhóm làm hồn tồn chức gen HBB dẫn đến không sản xuất chuỗi β globin nhóm làm giảm sản xuất chuỗi β globin 1.2 Đặc điểm lâm sàng xét nghiệm Phân loại Thalassemia: Phụ thuộc vào thiếu hụt tổng hợp chuỗi α, β hay thiếu hụt chuỗi β δ mà phân loại αThalassemia, β-Thalassemia, δβ-Thalassemia 1.2.1 α-Thalassemia Tùy vào kết hợp khác hai dạng allen đột biến α α+-thalassemia, tạo kiểu hình α-thalassmia khác Bệnh α-thalassemia chia thành thể tùy số lượng gen α globin bị đột biến, với biểu lâm sàng phong phú - Thể α+-Thalassemia người gen NST (-α/αα), không triệu chứng lâm sàng Phân tích gen α globin để chẩn đốn xác định - Thể α0-Thalassemia có dạng: Thể Cis đoạn hai gen NST ( /αα) Thể Trans hai đoạn gen hai NST tương đồng (-α/-α) Biểu nhẹ, thường không triệu chứng lâm sàng, phát qua xét nghiệm công thức máu - Bệnh HbH thể α-Thalassemia có triệu chứng (dị hợp tử kép α 0-α+thal) bao gồm đột biến đoạn hai gen đột biến đoạn gen Lâm sàng thiếu máu, HbH 0,8-40% (đơi có Hb Bart’s), lách to, vàng da tùy mức độ, chậm lớn, biểu thừa sắt - Hội chứng phù thai Hb Bart’s thể bệnh nặng nhất, gen α globin, gây suy giảm hoàn toàn khả sản xuất chuỗi α globin Hầu hết Hb Bart’s tử vong giai đoạn thai hay sau sinh 1.2.2 Bệnh β-Thalassemia - β-Thalassemia thể nặng kiểu gen đờng hợp tử, lâm sàng có triệu chứng thiếu máu tan máu mạn tính nặng (Chỉ số hồng cầu thấy thiếu máu nặng, hồng cầu nhỏ nhược sắc, biến dạng nặng nề Thay đổi thành phần Hb điện di đặc hiệu (HbF tăng, HbA1 giảm nặng/khơng cịn, HbA2 tăng) - β-Thalassemia thể trung gian thừa hưởng hai đột biến β + nhẹ hay có phối hợp với α-Thalassemia Lâm sàng có thiếu máu vừa nhẹ, lách to, vàng da, biểu biến dạng xương chậm phát triển thể chất ít, biểu nhiễm sắt muộn Xét nghiệm có thiếu máu mức độ vừa Biến đổi hồng cầu thể nặng Thành phần Hb điện di thấy HbF tăng từ 20-100%, HbA1 chiếm từ 0-80%, HbA2 khoảng 7% - β-Thalassemia thể nhẹ β-Thalassemia dị hợp tử, kiểu gen β+/β hay β0/β Thể bệnh thể bệnh nhân phát triển bình thường, khơng có biến dạng xương, thiếu máu thường nhẹ Thành phần Hb điện di hay gặp HbF tăng từ 1-10%, HbA1 chiếm > 80%, HbA2 khoảng 3,5% - 8% 1.2.3 Tổng quan phương pháp phát đột biến gen gây bệnh Thalassemia - RE-PCR dựa nguyên lý đột biến tạo hình thành làm vị trí cắt enzyme cắt giới hạn Trong thực nghiệm, sản phẩm sau khuếch đại phản ứng PCR cắt enzyme cắt giới hạn - MLPA kỹ thuật để định lượng thay đổi số DNA nhiễm sắc thể Phương pháp dựa phản ứng multiplex-PCR phối hợp với đầu dò thiết kế trước cho gene đích để phát đoạn thay đổi số copy gen - Lai DNA kỹ thuật phối hợp multiplex-PCR với lai DNA để phát lúc nhiều đột biến khác - Realtime PCR dựa sở phản ứng huỳnh quang gia tăng số lượng DNA tương ứng với tăng tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại chu kỳ Dựa vào đặc điểm xác định số DNA đích có mẫu nghiên cứu dựa mẫu chuẩn biết rõ số lượng DNA đích ban đầu - Giải trình tự DNA phương pháp đọc tồn trình tự đoạn gene quan tâm, từ thay đổi xảy đoạn gene xác định Tùy hệ thống phân tích khác nhau, đoạn đọc có độ dài từ 50-600 nucleotide (máy hệ 2-NextSeq) 800-900 nucleotide (máy hệ 1-dựa nguyên tắc Sanger) - Gap-PCR cho phép xác định đột biến đoạn xếp lại trật tự đoạn phân tử DNA cách sử dụng mồi (2 mồi xi mồi ngược), cặp mồi thứ phân bố hai đầu đoạn DNA bị mất, mồi lại thiết kế bổ sung vùng đoạn - ARMS dựa nguyên lý phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu allel Mồi sử dụng phản ứng thiết kế cho đầu 3’ mồi bắt cặp vị trí xuất đột biến điểm - Multiplex-PCR kỹ thuật PCR cải biến, có tham gia nhiều cặp mồi phản ứng nhằm khuếch đại nhiều trình tự gen đích Mỗi phản ứng dùng mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu gồm 85 bệnh nhân chẩn đoán xác định Thalassemia (27 trẻ α-Thalassemia 56 trẻ β-Thalassemia, 02 trẻ mang đồng thời đột biến α β-Thalassemia) khoảng thời gian nghiên cứu từ 01/01/2016 đến 31/12/2020 khoa Thận Máu - Nội tiết Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Chẩn đoán Thalassemia: Lâm sàng: Có đầy đủ triệu chứng thiếu máu tan máu mạn tính (thiếu máu, vàng da, gan lách to, biến dạng xương…), chậm phát triển thể chất nhiễm sắt (gan to, suy gan, tim to, suy tim…) Xét nghiệm: Thay đổi thành phần Hb đặc thù theo thể bệnh: điện di Hb có bất thường + β-thal thể nặng: HbF tăng, HbA1 giảm 0, HbA2 bình thường tăng • β0-thal: HbA1 0, HbF tăng cao > 90%, HbA2 > 4% • β+-thal: HbF, HbA2 > 4%, HbA1 giảm nặng + Bệnh HbE/β-thal: HbF tăng 10%, HbE >10%, HbA1 giảm, • HbE/β0-thal: HbA1 0, điện di Hb có HbF HbE • HbE/β+-thal: HbF tăng, HbA1 giảm, HbE >10%, + Bệnh HbH có HbH, HbA1 thường giảm, HbA2 giảm bình thường 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Gia đình bệnh nhi khơng đồng thuận tham gia vào nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Theo phương pháp nghiên cứu mô tả tiến cứu mộtloạt ca bệnh 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu: Toàn 85 bệnh nhân chẩn đoán xác định Thalassemia điều trị khoa Thận – Máu – Nội tiết Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng gia đình bệnh nhân thời gian nghiên cứu, phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ nhóm bệnh trình bày Phương pháp chọn mẫu tiện ích 2.2.3 Các số, biến số nghiên cứu 2.2.3.1 Mục tiêu 1: Xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia bệnh nhi Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng Tuổi nhập viện, tuổi khởi phát bệnh, thời gian mắc bệnh tính đến thời điểm nghiên cứu, giới tính, địa dư (thành thị/nơng thơn), xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia 2.2.3.2 Mục tiêu 2: Đối chiếu kiểu gen với kiểu hình bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng Lý vào viện, triệu chứng lâm sàng (thiếu máu, vàng da, biểu nhiễm sắt, gan lách to, biến dạng xương, mặt Thalassemia), số lần truyền máu/năm, phụ thuộc truyền máu Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, định lượng ferritin, sắt huyết thanh, GOT, GPT, ure, creatinin 2.2.3.3 Mục tiêu 3: Mô tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng theo gen đột biến bước đầu xây dựng số phả hệ bệnh nhi Thalassemia Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng Mô tả đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng theo gen đột biến Lập phả hệ 12 gia đình phân tích 2.2.4 Quy trình kỹ thuật sinh học phân tử phát ĐBG globin 2.2.4.1 Quy trình phát ĐBG α-globin gây bệnh α-Thalassemia -Kỹ thuật GAP-PCR phát đột biến: SEA, 3.7, 4.2, FIL, THAI Bằng kỹ thuật GAP-PCR đa mồi, với việc sử dụng năm cặp mồi khác nhau, để phát đột biến kích thước tương ứng 1349bp, 1166bp, 1024bp, 2022bp, 1628bp Bảng 2.1 Trình tự mồi kích thước đột biến thường gặp Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước α2/3.7-F CCCCTCGCCAAGTCCACCC 2022bp 3.7-R AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG D2/3.7-F CCCCTCGCCAAGTCCACCC 1800bp D2-R AGACCAGGAAGGGCCGGTG 4.2-F GGTTTACCCATGTGGTGCCTC 1628bp 4.2-R CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC SEA-F CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 1349bp SEA-R AGCCCACGTTGTGTTCATGGC FIL-F TGCAAATATGTTTCTCTCATTCTGT FIL-R G 1166bp ATAACCTTTATCTGCCACATGTAG C THAI-F GGCACTGAGAGCCCTTCACG 1024bp THAI-R CAAGTGGGCTGAGCCCTTGAG Kỹ thuật ARMS-PCR phát đột biến điểm HbCs HbQs Kỹ thuật ARMS-PCR phát đột biến điểm biết, dựa nguyên lý kỹ thuật PCR cổ điển Bảng 2.2 Trình tự mồi kích thước đột biến điểm Tên Trình tự mồi Kích thước CS-1 5’-CCT-GGGCCGCACTGACCCTATT-3’ CS-M 5’-AGGAG183 bp GAACGGCTACCGAGGCTCCAGATTGQS-M 3’ 5’CGGTGCTCACAGAAGCCAGGAACTT- GGCCG-3’ 5’-AGGAGGAACGGCTACCGAGGCTCCAGATTA-3’ 138bp QS-N 5’-CGGTGCTCACAGAAGCCAGGAACTTGGCCA-3’ 2.2.4.2 Quy trình phát ĐBG β-globin gây bệnh β-Thalassemia Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR kỹ thuật thiết lập để xác định đột biến điểm gen β-globin Chúng chọn đột biến điểm thường gặp khu vực ĐNA để sàng lọc: CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG→TAG), IVS 1-1(G-T), -28(A→G), IVS2.654 (C-T), CD71/72 (+A), IVS 1-5 (G-C), CD95 (+A) HbE-CD26 (AAG – GAG) 2.3 Công cụ thu thập thông tin xử lý kết Sử dụng phần mềm SPSS version 26.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois) để xử lý kết thống kê 2.4 Đạo đức nghiên cứu Đề tài nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu Y học Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong 85 bệnh nhân, có bệnh nhân mang gen đột biến alpha beta thalassemia Vì nghiên cúu triệu chứng lâm sàng, nghiên cúu thực 83 bệnh nhân 3.1 Đột biến gen gây bệnh Thalassemia bệnh nhi Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng 3.1.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu - Tuổi vào viện trung bình 6,93 ± 5,00 tuổi, - Tuổi phát bệnh trung bình 1,86 ± 2,52 tuổi - Tỷ lệ nam/ nữ mắc bệnh 43/40 (tương đương 1,075 : 1) - Chủ yếu bệnh nhân Thalassemia sống khu vực nông thôn p>0,05 Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhi Thalassemia theo nhóm tuổi vào viện Nhóm α-Thalassemia β-Thalassemia Chung p tuổi n=27 n=56 n=83 (test 2) 10(12,0% 0-