Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus

Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Võ Thị Tuyết PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA SULFATE POLYSACCHARIDE (CARRAGEENAN) TỪ LOÀI RONG ĐỎ BETAPHYCUS GELATINUS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Võ Thị Tuyết PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA SULFATE POLYSACCHARIDE (CARRAGEENAN) TỪ LOÀI RONG ĐỎ BETAPHYCUS GELATINUS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS Võ Mai Như Hiếu Hướng dẫn 2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Hà Nội – 2022 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Phân tích đặc điểm cấu trúc sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus” cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, TS Võ Mai Như Hiếu giúp đỡ cán phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Nha Trang - 2022 Tác giả Võ Thị Tuyết Lời cảm ơn Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận quan tâm giúp đỡ quý báu Ban lãnh đạo, thầy cô, bạn bè Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Trần Thị Thanh Vân TS Võ Mai Như Hiếu, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt giúp hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành học phần luận văn thủ tục cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha Trang, Trường Đại học Khánh Hịa tận tình cung cấp nhiều kiến thức bổ ích tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Mai Đức, ThS Đinh Thành Trung, TS Võ Thành Trung, anh chị học viên cao học lớp CHE17, CHE18 CHE19 công tác, học tập Viện Nghiên cứu Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang tận tình giúp đỡ, động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn Sở Giáo dục Đào tạo Khánh Hòa, Ban lãnh đạo trường THPT Huỳnh Thúc Kháng, tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học sau đại học hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân quan tâm, giúp đỡ suốt trình học tập hồn thành luận văn Nha Trang - 2022 Tác giả Luận văn Võ Thị Tuyết Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Viết tắt Thuật ngữ đầy đủ Thuật ngữ tiếng Việt ANOVA Analysis of variance Phân tích phương sai B gelatinus Betaphycus gelatinus Rong Hồng Vân BSA Bovine serium albumin Albumin huyết bò Car Carrageenan Carrageenan Carbon 13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance spectroscopy carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác chiều đồng hạt nhân 1H-1H DA 3,6-anhydro- D- galactose 3,6-anhydro- D- galactose DG D-galactose D-galactose DSS 4,4-dimethyl-4-silapentane-1sulfonic acid Axit 4,4-đimetyl-4-silapentan1-sulfonic FAB-MS Fast Atomic Bomb Mass Spectroscopy Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Gal Galactose Đường galactose Galp Galactopyranose Đường galactopyranose Glc Glucose Glucose GP 4’,6’-O-(1-carboxyethylidine)-βD-galactose 4’,6’-O-(1carboxyethylidine)-β-Dgalactose G4S D-galactose-4- sulfate D-galactose-4- sulfate 13 C-NMR G6S D-galactose-6-sulfate D-galactose-6-sulfate HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch người HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Cohence Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HSQC Heteronuclear single-quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua coherence liên kết (Phổ tương quan hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) Nồng độ ức chế 50% tăng trưởng đối tượng thử IC50 Inhibitory Concentration 50% IR InfraredSpectroscopy Phổ hồng ngoại MeOH Methanol Metanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân RSM Response Surface Methodology Phương pháp đáp ứng bề mặt SP Sulfate polysaccharide Sulfat polysaccharit TCA Trichloroacetic acid Axit Triclorua acetic UV-VIS Ultraviolet and Visible Phổ tử ngoại khả kiến Danh mục bảng Bảng 1.1 Tổng số taxon rong biển Việt Nam Bảng 1.2 Thành phần hóa học số lồi rong ngành rong 11 Bảng 1.3 Sản lượng rong biển nuôi trồng Trung Quốc từ 2009–2015 15 Bảng 1.4 Sản lượng rong biển Indonesia từ 2010–2015 15 Bảng 1.5 Xuất rong biển (carrageenan) Philippines từ 2013– 2016 .16 Bảng 1.6 Đặc điểm carrageenan 20 Bảng 1.7 Độ dịch chuyển hóa học dạng glucose galactose từ sở liệu SUGABASE 28 Bảng 2.1 Bảng quy đổi biến mã biến thực .33 Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm theo biến mã sử dụng mơ hình BoxBehnken 34 Bảng 3.1 Thành phần hóa học rong nguyên liệu 42 Bảng 3.2 Thiết kế thí nghiệm kết theo mơ hình Box-Behnken 43 Bảng 3.3 Kết phân tích phương sai xác định mức độ phù hợp mơ hình 45 Bảng 3.4 Hệ số mơ hình hồi quy phân tích ANOVA mơ hình hồi quy 47 Bảng 3.5 Giá trị mật độ quang Oy tương ứng với nồng độ D-glucose 49 Bảng 3.6 Giá trị mật độ quang Oy tương ứng với nồng độ D-glucose 50 Bảng 3.7 Giá trị mật độ quang Oy tương ứng với nồng độ K 2SO4 51 Bảng 3.8 Thành phần hóa học polysaccharide chiết từ rong Betaphycus gelatinus .52 Bảng 3.9 Hiệu suất thành phần hóa học sulfate polysaccharide chiết từ lồi rong Betaphycus gelatinus 52 Bảng 3.10 Kết phân tích phổ hồng ngoại mẫu sulfate polysaccharide vùng 800-1250 cm-1 55 Bảng 3.11 Các tín hiệu proton mẫu vùng anomeric .65 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ 1H 13C-NMR mẫu .70 Bảng 3.13 Tương quan rút từ phổ HSQC 73 Bảng 3.14 Tương quan rút từ phổ COSY 75 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Hình ảnh số loài rong nâu Hình 1.2 Hình ảnh số lồi rong lục Hình 1.3 Hình ảnh số lồi rong đỏ 10 Hình 1.4 Rong Betaphycus gelatinus Ninh Thuận 12 Hình 1.5 Bản đồ vị trí khu vực phân bố carrageenophytes Việt Nam 16 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học dạng carrageenan 18 Hình 1.7 Cơ chế tạo gel κ-carrageenan có mặt ion kali 19 Hình 1.8 Sự chuyển hóa cấu trúc carrageenan 21 Hình 2.1 Rong Betaphycus gelatinus 31 Hình 2.2 Bột rong Betaphycus gelatinus 31 Hình 2.3 Sơ đồ thu, xử lý nguyên liệu, lưu trữ mẫu, nghiên cứu 32 Hình 2.4 Quy trình chiết tách (a, b, c) 38 Hình 3.1.Tần suất phân bố hiệu suất chiết .44 Hình 3.2 Bề mặt đáp ứng 3D hiệu suất chiết (A, B, C), bề mặt đáp ứng tối ưu trùng lắp dạng 2D (D) 46 Hình 3.3 Mối tương quan mơ hình lý thuyết thực nghiệm mô tả ảnh hưởng yếu tố .48 Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng 3,6 – anhydrogalactose 49 Hình 3.5 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate tổng 50 Hình 3.6 Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng sulfate 51 Hình 3.7 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh) 56 Hình 3.8 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) 57 Hình 3.9 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN3 (chiết kiềm lạnh) 58 Hình 3.10 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) 59 Hình 3.11 Phổ 1H NMR mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh) .61 Hình 3.12 Phổ 1H NMR mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) 62 Hình 3.13 Phổ 1H NMR mẫu TN3 (chiết kiềm lạnh……………………63 Hình 3.14 Phổ 1H NMR mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) 64 Hình 3.15 Phổ 13C NMR mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) .67 Hình 3.16 Phổ 13C NMR mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) 68 Hình 3.17 Phổ HSQC mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) 71 Hình 3.18 Phổ COSY mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) 74 Hình 3.19 Phổ HMBC mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) 76 Lấy xác 0,5 ml dung dịch chứa protein với nồng độ khác cho vào ống nghiệm, thêm vào 2,5 ml dung dịch C, lắc để yên 10 phút lâu Sau đó, thêm vào hỗn hợp ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin pha loãng lần, lắc để yên 30 phút lâu - Đem so màu hỗn hợp máy so màu quang điện bước sóng 𝜆 = 750nm Đối với dung dịch màu mạnh hơn, số đọc phạm vi khả thi cách đọc gần 500nm Thực thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy Kết xử lý theo phương pháp thống kê thông thường Kết hàm lượng protein tính tốn từ đường chuẩn BSA xây dựng (Bảng 1, hình 1, phụ lục B1) Sau xây dựng đường chuẩn: Mẫu thí nghiệm chuẩn bị tương tự nêu Sau đó, đem so màu bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein mẫu - Hàm lượng nitơ mẫu khơ xác định máy phân tích ngun tố CHNS /O elemental analyzer (Perkin-Elmer PE2400, Norwalk) 2.3.3 Xác định hàm lượng Lipid *Tách lipid từ mẫu: Cân g mẫu xay nhuyễn trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20 mL Cho thêm 600 μl nước cất, mL methanol, 10 mL chloroform 200 μL BHT (Butylated hydroxy toluen) Ngâm mẫu dung mơi khoảng 10 phút Đồng hóa mẫu máy phút Đổ vào ống xilanh có lót giấy lọc GF/C đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn Cho thêm 5mL methanol 10 mL chloroform vào vial đồng hóa mẫu 20 giây Đổ dung dịch vào xilanh, cho mẫu lọc hết hoàn toàn Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch lại xilanh xuống phễu chiết 100 mL Cho thêm 7,5 mL NaCl 0,9 % vào phễu chiết chứa dịch mẫu Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần giữ mẫu 5oC khoảng để dịch mẫu phân chia thành lớp * Chiết rút dung dịch lipid Tách lớp (chứa hàm lượng lipid hịa tan dung mơi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml Loại bỏ lớp dịch phía (chứa phần hỗn hợp gồm tạp chất loại nước, muối, protein….) Xác định thể tích chiết (V) X = V (mL) Cho thêm mL MeOH 50 % vào mẫu phễu chiết 100 mL Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần Cho phân chia tách thành lớp lắng qua đêm 5oC * Định lượng lipid Lớp rút chảy xuống bình cầu 100 mL Cơ quay chân khơng làm bay dung mơi bình cầu 37oC đến cịn lại thể tích khoảng mL Hòa tan mẫu lại lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc nhỏ lượng mẫu làm khơ với khơng khí) Chuyển lượng mẫu qua bình định mức mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần định mức chloroform vừa đủ mL Sau xử lý xong, dung dịch mang xác định hàm lượng lipid tổng Dung dịch lưu giữ tủ đông –20 oC * Xác định hàm lượng lipid tổng Lấy xác mL dung dịch mẫu xử lý cho vào ống thuỷ tinh có nắp mL sấy chân không cân với lượng khơng đổi, làm khơ khí nitơ Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: % Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm % Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi mẫu Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khơ mẫu m1: Trọng lượng cân ống vial mẫu sau sấy (g) m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g) m: Trọng lượng cân mẫu (g) Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL) T: thành phần khô mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm mẫu (%) 2.3.4 Xác định sulfate Xây dựng đường chuẩn K2SO4 sau: Cho 20 μL chuẩn K2SO4 nồng độ khoảng 0,25-1 μg/μL vào ống nghiệm Thêm vào 3,8 TCA 3%, mL dung dịch gelatin 0,5%, mL dung dịch BaCl 0,5% Để yên 15 phút, đo UV-VIS bước sóng 360 nm Thủy phân 5mg SP ống nghiệm có nút vặn mL HCl 1N nhiệt độ 100oC, thời gian Cho 20μL SP thủy phân nồng độ khoảng μg/μL vào ống nghiệm Thêm vào 3,8 TCA 3%, 1mL dung dịch gelatin 0,5 %, 1mL dung dịch BaCl2 0,5% Để yên 15 phút, đo UV-VIS bước sóng 360 nm Tính tốn hàm lượng sulfate carrageenan dựa vào đường chuẩn sulfate xây dựng Hình PLA2.7 Hình ảnh Xác định sulfate từ rong Đỏ B.gelatinus phịng thí nghiệm Hóa phân tích –Đại học Khánh Hòa Nha Trang 2.3.5 Xác định Carbohydrate Xác định hàm lượng Carbohydrate phương pháp Phenol-Sulfuric: Lấy mL dung dịch cần xác định có nồng độ khoảng 40-100 µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc suốt Thêm 10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc để nguội, sau đun cách thủy nhiệt độ 60oC 10 phút, để nguội, đo UV bước sóng 484,5 nm 2.3.6 Xác định 3,6-Anhydrogalactose theo phương pháp Yaphe CS * Chuẩn bị dung dịch gốc: a) Resorcinal (1,36 mmol): cân 150 mg hòa tan 100 mL nước cất Bảo quản chai màu, giữ tủ lạnh b) 1,1-Diethoxyethane (acetal): Lấy 100μL (695μmol) hòa tan 10 mL nước cất Giữ chai màu, bảo quản tủ lạnh Lấy mL pha loãng với nước cất thành 25 mL trước trộn với thuốc thử c) Dung dịch gốc D-fructose chuẩn: cân 27 mg hòa tan 50 mL nước cất cho bảo hòa acid benzoic Bảo quản tủ lạnh * Chuẩn bị dung dịch làm việc: a) Thuốc thử resorcinol-acetal: thêm 100 mL HCl đậm đặc vào mL dung dịch gốc resorcinol thêm mL dung dịch gốc acetal pha loãng, trộn Chuẩn bị dung dịch trước phân tích b) Chuẩn D-fructose: hịa tan mL dung dịch gốc chuẩn fructose thành 100 mL nước cất, tương ứng với nồng độ fructose 16,2 μg/mL c) Chuẩn bị mẫu: cân 10 mg carrageenan hòa tan 100 mL nước cất nóng, tương ứng với 100 μg/mL * Tiến hành phân tích: Coi fructose chất chuẩn, lấy mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ đến 0,25 µmol/mL Thêm 10 mL thuốc thử resorcinal-acetal 20oC, lắc phút, sau đun 80oC 10 phút Làm lạnh ống nghiệm chậu đá 1,5 phút đo độ hấp thụ máy UV-VIS bước sóng 555 nm khoảng thời gian 15 phút Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh Hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactose xác định so với chuẩn D-fructose nhân với giá trị 1,087 Mẫu phân tích lần để tính giá trị trung bình PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM PHỤ LỤC B1: Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry Bảng B1 Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ BSA OD750 OD1 OD2 OD3 OD 20 0,094 0,099 0,097 0,097 40 0,164 0,161 0,165 0,163 60 0,225 0,229 0,226 0,227 80 0,264 0,265 0,261 0,263 100 0,325 0,321 0,321 0,322 120 0,383 0,385 0,384 0,384 (µg/mL) Hình PLB1 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry PHỤ LỤC B2: PHỔ IR Hình PLB2.1 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh ) Hình PLB2.2 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB2.3 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN3 (chiết kiềm lạnh) Hình PLB2.4 Phổ hồng ngoại IR mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) PHỤ LỤC B3: PHỔ 1H NMR Hình PLB3.1a Phổ 1H NMR đầy đủ mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh) Hình PLB 3.1b Phổ 1H NMR vùng anomeric mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh) Hình PLB 3.2a Phổ 1H NMR đầy đủ mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB 3.2b Phổ 1H NMR vùng anomeric mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) PHỤ LỤC 4: PHỔ 13C NMR Hình PLB 4.1a Phổ 13C NMR đầy đủ mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB 4.1b Phổ 13C NMR vùng anomeric mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB 4.2a Phổ 13C NMR đầy đủ mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) Hình PLB 4.2b Phổ 13C NMR vùng anomeric mẫu TN4 (chiết kiềm nóng) PHỤ LỤC 5: PHỔ HSQC Hình PLB 5.1a Phổ HSQC đầy đủ mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB 5.1b Phổ HSQC vùng anomeric mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) PHỤ LỤC 6: PHỔ COSY Hình PLB 6.1a Phổ COSY đầy đủ mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng) Hình PLB 6.1b Phổ COSY vùng anomeric mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng)