Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.

Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu và phân loại rong biển

Rong biển là thực vật thủy sinh bậc thấp sống ở biển, với kích thước và hình dạng đa dạng Chúng có thể là đơn bào hoặc đa bào, thường mọc trên rạn san hô, vách đá, hoặc dưới tầng nước sâu có ánh sáng mặt trời để quang hợp Rong biển đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển, cung cấp nơi sống và nguồn thức ăn cho nhiều loài sinh vật, đặc biệt trong giai đoạn cây non Ngoài ra, rong biển còn có giá trị lớn đối với con người, được sử dụng làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp chế biến như chiết xuất keo agar, carrageenan, fucoidan, cũng như trong thực phẩm và thuốc chữa bệnh.

Rong biển là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, cung cấp nhiều chất chống oxy hóa, protein, chất xơ, khoáng chất và các nguyên tố vi lượng Nó cũng chứa một lượng nhỏ omega-3, omega-6, cùng với các vitamin A, B, C, E, làm cho rong biển trở thành món quà quý giá từ thiên nhiên cho sức khỏe.

Trên toàn cầu, các nhà khoa học đã phân loại khoảng 10.000 loài rong biển, chia thành ba nhóm chính dựa trên màu sắc và giá trị kinh tế Cụ thể, rong đỏ có khoảng 6.500 loài, rong nâu với khoảng 1.800 loài và rong lục khoảng 1.500 loài.

Tại Việt Nam đã xác định được khoảng 827 loài rong biển thuộc 4 ngành Trong đó, ngành rong đỏ chiếm hơn 412 loại, ngành rong lục chiếm

Trong tổng số 180 loại rong nâu, có hơn 147 loại thuộc ngành rong lam với gần 88 loại được ghi nhận Theo bảng 1.1, 310 loài rong phân bố chủ yếu ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc, trong khi 484 loài hiện diện tại các tỉnh phía Nam, và 156 loài có mặt ở cả hai vùng.

19 Bảng 1.1 Tổng số taxon rong biển Việt Nam [22]

Số lượng và tỉ lệ(%)

Nguồn: Nguyen Van Tu, et al [22]

Rong biển được phân loại thành nhiều ngành khác nhau dựa trên thành phần cấu tạo, sắc tố, hình thái và đặc điểm sinh sản Tại vùng biển Việt Nam, có gần 800 loài rong biển được phát hiện, và các nhà khoa học Việt Nam đã thống nhất xếp chúng vào 3 ngành chính có giá trị kinh tế cao theo hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977.

Rong nâu là một loại rong biển có kích thước lớn, bao gồm bốn chi chính: Sargassum, Turbinaria, Dictyota và Padina Loài rong này phân bố rộng rãi và thường chiếm ưu thế trên các bãi triều ven biển ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới.

Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ… Trong đó, hai chi

Sargassum và Turbinaria, hai loại rong thuộc họ Sargassaceae (bộ Fucales), là những đối tượng phổ biến và có giá trị kinh tế cao Trung Quốc là quốc gia dẫn đầu thế giới về sản lượng rong nâu, tiếp theo là Hàn Quốc, Nhật Bản, Na Uy và Chile.

Hình 1.1 Hình ảnh về một số loài rong nâu [26].

Rong lục là một loài rong nhỏ, tương tự như rong đỏ, bao gồm cả các loài đơn bào và đa bào Trên thế giới, rong lục chủ yếu phân bố tại Philippines, sau đó là Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản, và ít hơn ở Việt Nam với các loài như Ulva reticulata và Ulva lactuca.

Caulerpa racemosa, … Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước:

Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia, Achentina, Bangladesh…[21, 27].

Hình 1.2 Hình ảnh về một số loài rong lục [28].

Rong đỏ (hay tảo đỏ): Là những sinh vật quang tự dưỡng thuộc ngành Rhodophyta [29], có kích thước nhỏ hơn rong nâu, thường dài không quá

50cm nhưng một số loài có thể đạt 2m [30].

Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile, Indonesia, Philippines tiếp đến là Thái Lan, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii, Ấn Độ, Anh, Mỹ …

Hiện nay trên thế giới đã phân loại được gần 6500 loài rong đỏ, khoảng

800 chi, thuộc nhiều họ khác nhau Tại vùng biển Việt Nam ngành rong đỏ

Rhodophyta có khoảng 412 loài [22, 31] Từ rong biển có thể tách các polysaccharide như: carrageenan, acid alginic, agar,… Các loài rong đỏ được chia làm ba nhóm chính [22, 32, 33]:

- Nhóm rong cho Agar (Agarophyte): bao gồm các chi, các loài như: Gelidium, Graccilaria, Acanthopeltis, Gelidiella,

- Nhóm Gelans: nhóm rong này dùng để sản xuất Furcellaran, điển hình của nhóm rong này là Furcellaria.

- Nhóm rong cho Carrageenan (Carrageenophyte): bao gồm các chi, các loài như: Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea, Chondruscripus,

(Endl.) Boerg Gymnogongrus flabellifotmis Harv

Liagora sp1 Liagora sp2 Grateloupia lithophila

Hình 1.3 Hình ảnh về một số loài rong đỏ [34]

1.1.2 Thành phần hóa học có trong rong biển

Vào năm 2005, Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh Lí và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học và cấu trúc của carrageenan từ rong biển Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum và Eucheuma denticulatum, những loài rong biển được di nhập từ Philippines.

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số loài rong trong 3 ngành rong chính (Tỉ lệ tính trên 100g rong tươi) [25]

Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục

Tannin 2 - 10 0,1 0,5 - 6,0 nd nd nd Nd

Iod 0,01 - 0,1 0,3 - 1,1 0,05 0,01 - 0,1 0,0005 nd Nd nd: Không phát hiện thấy

Rong biển chứa nhiều thành phần hoá học quý giá về dinh dưỡng và dược liệu, bao gồm polysaccharide, carotenoid, protein, lipid, hợp chất phenolic, acid amin, acid béo đa nối đôi, vitamin, peptide, khoáng chất, hợp chất chứa iod, laminaran và alginate Trong số đó, polysaccharide là thành phần chính, được xem là nguồn carbohydrate phong phú và có giá trị kinh tế cao, thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cho các ứng dụng y học.

1.1.3 Sulfate polysaccharide từ rong biển

Polysaccharide là các hợp chất cao phân tử được hình thành từ nhiều monosaccharide liên kết với nhau qua liên kết glycoside Chúng được chiết xuất từ thực vật và ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, với các ví dụ như agar, pectin, lectin và carrageenan Gần đây, rong biển đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, góp phần vào việc khai thác tiềm năng của rong biển tại Việt Nam.

GIỚI THIỆU VỀ CÂY RONG BETAPHYCUS GELATINUS

Hình 1.4 Rong Betaphycus gelatinus ở Ninh Thuận [35].

Tên tiếng Việt: Rong hồng vân

Tên La Tinh: Fucus gelatinus Esper1800

Betaphycus gelatinus (Esper) Doty ex P.C.Silva 1996

Rong B.gelatinus được định danh theo khóa phân loại như sau:

Giới Plantae Ngành Rhodophyta Lớp Florideophyceae

Họ Rong kỳ lân Solieriaceae Chi Betaphycus

TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN

Carrageenan là một hợp chất chiết xuất từ các loài rong biển thuộc họ Rhodophyceae, thường được tìm thấy ở khu vực Đại Tây Dương, đặc biệt gần Anh, Châu Âu và Bắc Mỹ.

Carrageenan đã được biết đến từ lâu ở phương Tây, với những phát hiện đầu tiên của các nhà khoa học như Schimdt và Stantord trong giai đoạn 1842-1862 về sự tồn tại của nó trong rong đỏ Chondrus crispus và Irish moss thuộc họ Rhodophyceae Tuy nhiên, những khám phá ban đầu còn thô sơ và chưa xác định rõ tính chất của carrageenan Đến khi Chiến tranh thế giới thứ nhất bùng nổ, nhu cầu về gelatin cho quân đội gia tăng, dẫn đến việc cần tìm kiếm chất thay thế Nhiều nghiên cứu được tiến hành và carrageenan đã được xác định là một chất có tính chất tương tự gelatin.

Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấn ven biển Irish thuộc Carrageenan.

Từ những loài rong đỏ (Rhodophyceae) người ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: kappa-carrageenan, lambda- carrageenan, iota-carrageenan, beta-carrageenan…[38].

1.3.2 Phân bố và sản lượng carrageenan trên thế giới và trong nước

1.3.2.1 Phân bố và sản lượng carrageenan trên thế giới

Hằng năm, thế giới khai thác và sản xuất khoảng 100.000 tấn carrageenophyte, đồng thời chế biến 15.000 tấn carrageenan từ các quốc gia như Trung Quốc, Indonesia, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Singapore, Thái Lan, Nam Mỹ (Chile), Châu Âu (Đan Mạch, Liên minh Châu Âu), Châu Phi (Morocco, Nam Phi, Zanzibar) và Nam Nhật Bản.

Theo thống kê năm 2000, hơn 80% sản lượng carrageenan được sản xuất bởi các công ty hàng đầu như FMC và CP Kelco của Mỹ, Danisco của Đan Mạch, Degussa của Đức, và Ceamsa của Tây Ban Nha.

Ngành công nghiệp sản xuất carrageenan đang phát triển mạnh mẽ không chỉ ở Mỹ và Tây Âu mà còn ở nhiều quốc gia Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản và Philippines Tại Nhật Bản, các sản phẩm agar, alginate và carrageenan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm và các lĩnh vực khác Ngành công nghiệp carrageenan chủ yếu sử dụng hai loài rong Eucheuma và Kappaphycus nhập khẩu từ Đông Nam Á, cùng với các nguyên liệu tự nhiên Chondrus và Gigartina từ châu Mỹ và châu Âu Tảo bẹ Nhật Bản (Saccharina japonica) chiếm khoảng 51% tổng lượng rong biển được nuôi trồng, trong khi Gracilaria đứng ở vị trí thứ hai.

Undaria spp (wakame) và Porphyra spp (Tiếng Nhật) Bốn loài chính này đóng góp 92% tổng sản lượng năm 2015.

Sản lượng rong biển nuôi trồng ở Trung Quốc chiếm khoảng 60% tổng sản lượng rong biển toàn cầu, với sự tăng trưởng nhanh chóng từ 9,7 triệu tấn vào năm 2006 lên 13,9 triệu tấn vào năm 2015.

Bảng 1.3 Sản lượng rong biển nuôi trồng ở Trung Quốc từ 2009–2015 [39]

Trọng lượng tính bằng tấn

Thực vật thủy sinh khác

Indonesia báo cáo sản lượng từ 1,2 triệu tấn năm 2006 lên 11,3 triệu tấn năm 2015 Sản lượng rong biển, 2010–2015 ở bảng 1.4.

Bảng 1.4 Sản lượng rong biển ở Indonesia từ 2010–2015 [39]

Trọng lượng tính bằng tấn

Tổng sản lượng nuôi trồng

Sản xuất tự nhiên(hoang dã)

Theo thống kê của Philippines, trong năm 2016, xuất khẩu rong biển và carrageenan đạt gần 43.000 tấn, với giá trị khai báo hải quan lên tới 200 triệu USD.

Bảng 1.5 Xuất khẩu rong biển (carrageenan) ở Philippines từ 2013–2016

Trọng lượng tính bằng tấn; trị giá hàng nghìn USD

1.3.2.2 Phân bố và sản lượng carrageenan trong nước [40]

Hình 1.5 Bản đồ vị trí khu vực phân bố các carrageenophytes ở Việt Nam.

Cho đến nay các loài rong thuộc nhóm Carrageenophyte ở ven biển phía Nam Việt Nam được xác định là Eucheuma spp, Kappaphycus spp,

Hypnea spp, Acanthophora-spp, Gymnogongrus spp, Betaphycus Trong đó Eucheuma, Kappaphycus, Betaphycus, chủ yếu phân bố ở vùng biển miền

Trung Việt Nam, nằm trong nhóm nguyên liệu chính và phổ biến cho công nghiệp chế biến carrageenan của các nước trên thế giới.

Carrageenan là một loại sulfate galactan có cấu trúc mạch thẳng, hòa tan trong nước, được tạo thành từ sự luân phiên giữa các đơn vị D-galactose và 3,6-anhydro-D-galactose thông qua các liên kết α-1,4 và β-1,3-galactopyranosyl.

42] Phụ thuộc vào số lượng, vị trí của nhóm sulfate và sự có mặt của vòng 3,6-anhydro của gốc galactose mà carrageenan được phân làm 03 họ chính sau:

• Họ Kappa carrageenan bao gồm kappa (κ) và iota (ι) carrageenan.

• Họ Beta carrageenan bao gồm beta (β) và omega (ω) carrageenan.

• Họ Lambda carrageenan bao gồm theta (θ) và pi (π) carrageenan.

Phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy mỗi loại carrageenan như mu (à), kappa, nu (ν), iota, xi (ξ), gamma (γ) và theta đều có các cấu trúc chỉ thị tương ứng Một số cấu trúc này được trình bày trong hình 1.7, bao gồm γ-carrageenan với R=H(G-D6S), β-carrageenan với R=H(G-DA), Ψ-carrageenan (G6S-D6S) và ω-carrageenan (G6S-DA).

Carrageenan họ Beta μ-carrageenan R=H(G4S-D6S) κ-carrageenan R=H(G4S-DA) ν-carrageenan R=SO 3 - (G4S-D2S,6S) ᶥ -carrageenan R=SO 3 - (G4S-DA2S)

Carrageenan họ Kappa λ-carrageenan R=SO 3 - (G2S-D2S,6S) θ-carrageenan R=SO 3 - (G2S-DA2S) δ-carrageenan R=SO 3 - (G,6S) α-carrageenan R=SO 3 - (G-DA2S) ξ-carrageenan R=H(G2S-D2S)

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các dạng carrageenan [43].

Mạch polysaccharide của carrageenan có cấu trúc xoắn kép, với mỗi vòng xoắn được hình thành từ các gốc disaccharide Cấu trúc bậc 3 của nó được ổn định nhờ các liên kết hydro giữa oxy ở C6 của gốc galactose trong mạch này và gốc tương tự ở mạch khác Trong dung dịch, các xoắn kép có khả năng liên hợp để tạo thành cấu trúc bậc 4 Carrageenan có công thức cấu tạo đơn giản khi gắn với các ion Ca2+, K+, Na+, thể hiện qua các công thức R=(OSO3)2Ca, hoặc R-OSO3Na, ROSO3K, trong đó R là gốc polysaccharide.

Sự có mặt của các cation như K+, Ca2+ và Na+ thúc đẩy sự hình thành các dimer xoắn ốc và tạo ra mạng lưới ba chiều ổn định Điều này xảy ra nhờ vào sự tương tác giữa các phân tử trong các chuỗi xoắn carrageenan thông qua việc liên kết với các nhóm sulfate.

Hình 1.7 Cơ chế tạo gel của κ-carrageenan khi có mặt các ion kali [46].

1.3.4 Tính chất hóa lý của carrageenan

Hydrocolloid chứa α-D-1,3 và β-D-1,4 galactose với hàm lượng sulfate lên đến 40% tổng khối lượng, tích điện âm, kết hợp với ammonium, potassium, calcium, magnesium và sodium.

Khả năng hòa tan λ-carrageenan hòa tan trong nước lạnh và nước nóng, κ- carrageenan hòa tan trong nước nóng, κ-carrageenan bị kết tủa trong dung dịch potassium.

Hình thành gel λ-carrageenan không hình thành gel, chỉ hình thành cấu trúc xoắn Ion calcium hình thành gel với ι-carrageenan Ion potassium hình thành gel với κ-carrageenan.

Khi chuyển hóa liên kết glycoside bị thủy phân ở pH thấp (pH +3 ppm), tương tự như khi thực hiện metyl hóa Thông tin về trật tự các đơn phân trong mạch polysaccharide phản ánh cấu trúc chuỗi của các liên kết glycoside, đây là yếu tố cấu trúc quan trọng cần xác định từ hai loại phổ 1H-13C HMBC và NOESY.

1.4.3 Một số nghiên cứu cấu trúc của carrageenan

Năm 2003, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã xác định κ-carrageenan từ rong sụn nuôi trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng cách sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR) và các phương pháp sắc ký như sắc ký lọc gel (GPC) và sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện (ESI-MS).

Theo nghiên cứu của Guangli (2004), quá trình thủy phân κ-carrageenan bằng acid HCl chỉ diễn ra tại liên kết α-(1→3) glycosidic Sử dụng phương pháp ESI-MS, nghiên cứu đã chỉ ra rằng các phân tử κ-carrageenan là một acid sulfuric galactan tuyến tính và không có phân nhánh.

Theo nghiên cứu của Theo Guibet và cộng sự (2006), các sản phẩm thủy phân đã được phân tích bằng phổ 1H và 13C-NMR Kết quả cho thấy tất cả các oligo carrageenan thuộc loại neo - carrabiose oligosaccharide, chứng minh rằng λ-carrageenase có khả năng thủy phân liên kết β - (1-4) glycosidic.

Trần Đình Toại và cộng sự (2008) đã sử dụng acid HCl để thủy phân carrageenan chiết xuất từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae, thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta tại Việt Nam, nhằm tạo ra oligo carrageenan Họ đã áp dụng các phương pháp phân tích như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13 C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng ESI-MS để xác định cấu trúc sản phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy, quá trình thủy phân carrageenan bằng acid HCl chỉ làm thay đổi không đáng kể cấu trúc polymer, chủ yếu phá vỡ các liên kết glycoside và cắt ngắn mạch polymer.

Năm 2009, theo Loan Hui các oligosaccharide tách bằng cách sử dụng phân đoạn ethanol, các phân đoạn được sắc ký lọc gel qua cột lọc Bio-Gel P-

4, xác định phổ IR và phân tích hóa học, chứng minh rằng: quá trình thủy phân enzyme làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của κ-carrageenan [85].

1.5 ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CARRAGEENAN ĐÃ CÔNG BỐ Ở VIỆT NAM

Nguồn nguyên liệu rong carrageennophite rất phong phú, tạo điều kiện cho việc nghiên cứu đa dạng Các thiết bị hiện đại như máy đo hồng ngoại và máy cộng hưởng từ hạt nhân được trang bị đầy đủ, hỗ trợ tối ưu cho việc phân tích cấu trúc của nguyên liệu này.

Các thiết bị hiện đại cho nghiên cứu hoạt tính sinh học theo cơ chế phân tử còn rất hạn chế.

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM …

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

* Rong đỏ Betaphycus gelatinus thu thập ở vùng biển Ninh Thuận.

Rong được thu thập tại Ninh Thuận vào tháng 6/2019 và tháng 3/2021 bởi ThS Trần Mai Đức, được định danh khoa học qua phương pháp hình thái bởi TS Võ Thành Trung từ Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Sau khi thu thập, mẫu rong được rửa sạch bụi bẩn, cát và mùn bằng nước ngọt, sau đó phơi khô trong bóng râm và sấy khô ở nhiệt độ thích hợp.

40 0 C và nghiền mịn thành bột rồi đem nghiên cứu (hình 2.2).

Hình 2.1 Rong Betaphycus gelatinus Hình 2.2 Bột rong Betaphycus gelatinus

Lưu trữ mẫu Nước biển

Hình 2.3 Sơ đồ thu, xử lý nguyên liệu, lưu trữ mẫu, nghiên cứu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tìm điều kiện tối ưu để chiết tách sulfate polysaccharide bằng phương pháp đáp ứng bề mặt.

Bố trí thí nghiệm: Tối ưu hóa thông số chiết bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) với mô hình Box-Behnken [86, 87] Ở đây, nhiệt độ chiết

ND (X1), thời gian chiết TG (X2) và tỷ lệ dung môi : nguyên liệu TL (DM : NL) (X3) là ba biến độc lập trong nghiên cứu Vùng biến nghiên cứu đã được mã hóa và thể hiện trong bảng 2.1 dựa trên kết quả thực nghiệm nhân tố đơn Phương án thí nghiệm bao gồm 12 thí nghiệm nhân tố cùng với 3 thí nghiệm lặp lại, nhằm xác định hiệu suất chiết sulfate polysaccharide dựa trên sự kết hợp của các biến độc lập Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần và được thực hiện ngẫu nhiên để giảm thiểu tác động của biến đổi bất thường trong quan sát Các biến được mã hóa theo phương trình x = (Xi - X0).

Trong mô hình thí nghiệm Box-Behnken, ký hiệu ΔX đại diện cho hiệu số giữa giá trị tuyệt đối cực đại của biến thực (Xi) và giá trị biến tại thí nghiệm trung tâm (X0) Đây là một phần quan trọng trong việc phân tích dữ liệu thí nghiệm, giúp xác định sự ảnh hưởng của các biến độc lập đến kết quả.

Trong nghiên cứu này, hàm mục tiêu (HMT) được xác định là hiệu suất chiết đạt giá trị cực đại Công thức mô tả mối quan hệ giữa các biến độc lập và phụ thuộc được biểu diễn qua các hệ số tuyến tính β0, βi, βii và βij, trong đó Y là hàm mục tiêu và ε là sai số Các hệ số này phản ánh ảnh hưởng tuyến tính và phi tuyến tính lên các biến trong mô hình.

Bảng 2.1 Bảng quy đổi biến mã và biến thực

Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm theo biến mã sử dụng mô hình Box-Behnken

Thí nghiệm chiết xuất polysaccharide được thực hiện bằng cách chiết 15g bột rong trong 450 ml nước với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 30:1, ở các nhiệt độ khác nhau (60°C, 80°C, 100°C) và thời gian chiết khác nhau (30’, 105’, 180’) Sau khi chiết, dung dịch chiết được lọc và tủa bằng cồn tuyệt đối với tỷ lệ Vcồn : Vdung dịch chiết là 4:1 Tủa sau đó được gạn lọc, ly tâm và rửa nhiều lần bằng cồn 85° và 96° Cuối cùng, sulfate polysaccharide được thu nhận sau khi đông khô Trong các thí nghiệm tiếp theo, ảnh hưởng của từng yếu tố chiết được khảo sát bằng cách thay đổi giá trị yếu tố đó, trong khi giữ 3 yếu tố còn lại ở giá trị cơ sở Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính toán hiệu suất chiết và hàm lượng polysaccharide trung bình.

Chiết xuất sulfate polysaccharide tự nhiên (SP) được thực hiện theo quy trình của Craigie và Leigh (1978) Đầu tiên, rong biển được xử lý để loại bỏ chất màu và chất béo bằng ethanol Sau đó, rong biển được chiết với dung dịch NaCl 0,05 M ở nhiệt độ thích hợp.

Trong quá trình chiết xuất, bã rong được chiết lạnh ở 22 oC trong 24 giờ, sau đó chiết nóng với dung dịch NaHCO3 0,5M ở 90 oC trong 2 giờ Sau khi lọc dung dịch chiết nóng và chiết lạnh, tủa được tạo ra bằng cetylpyridinium chloride (CPC) và thực hiện phản ứng trao đổi với ion Na+ trong môi trường NaCl/ethanol 80%, thu được tủa sản phẩm (SP) Tủa này được hòa tan trong nước cất và đông khô, tạo thành SP dạng bột, từ đó tiến hành cân và tính hiệu suất Mẫu sulfate polysaccharide chiết lạnh và chiết nóng được ký hiệu lần lượt là TN1 và TN2.

Chiết sulfate polysaccharide được thực hiện bằng cách xử lý rong với NaOH 0,5 Mol/l trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng (chiết lạnh) và chiết nóng ở 80°C trong 3 giờ, sau đó rửa bằng nước trong 30 phút Hỗn hợp chiết sau đó được lọc và ly tâm để loại bỏ cặn Dung dịch lọc được điều chỉnh pH về 3 bằng HCl, tiếp theo là ly tâm để thu được tủa, sau đó tủa được xử lý bằng ancol 80% qua đêm và rửa 3 lần bằng ancol trước khi sấy khô Các mẫu sulfate polysaccharide chiết lạnh và nóng được ký hiệu là TN3 và TN4.

Quy trình chiết tách bằng các sơ đồ sau: a) Sơ đồ thí nghiệm cơ sở (chiết nước nóng)

Xử lý chất màu và chất béo bằng ethanol

B gelatinus không màu b) Chiết sulfate polysaccharide tự nhiên(nóng, lạnh)

Trao đổi Na + / NaCl/ethanol 80% Trao đổi Na + / NaCl/ethanol 80%

Thu tủa SP Thu tủa SP

Hòa tan tủa bằng nước cất, đông khô Hòa tan tủa bằng nước cất, đông khô

B gelatinus c) Chiết sulfate polysaccharide bằng xử lý kiềm

Hình 2.4 Quy trình chiết tách (a, b, c).

2.2.1.2 Các phương pháp phân tích a) Xác định độ ẩm của rong [88]: Độ ẩm được phân tích bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi và cân khối lượng.

Phương pháp xác định độ ẩm dựa trên nguyên tắc sử dụng nhiệt để bay hơi nước trong mẫu Đầu tiên, cần cân khối lượng mẫu trước và sau khi sấy khô Từ sự chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân, ta có thể tính toán độ ẩm của mẫu một cách chính xác.

Xử lý NaOH 0,5 M, 12 giờ, nhiệt độ phòng

Dịch lọc chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl

Ly tâm, loại tủa Lọc, ly tâm, bỏ cặn

Tủa bằng ancol 80 % để qua đêm

Sulfate polysaccharide chiết kiềm lạnh (TN3)

Sấy tủa và rửa tủa 3 lần bằng ancol là quy trình quan trọng trong phân tích mẫu Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: Độ ẩm (%) = *100% Để xác định hàm lượng protein, phương pháp Lowry được áp dụng.

Protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo ra phức chất màu xanh da trời, với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một khoảng nhất định Để đo cường độ màu, sử dụng thiết bị đo màu quang điện tại bước sóng 750nm.

Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA), có thể xác định hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg Để xác định hàm lượng lipid, áp dụng phương pháp Soxhlet và phương pháp Folch.

Lipid thô được chiết xuất bằng máy chiết Soxhlet (Soxtec System HT6, Tecator, Hoganas, Thụy Điển) với dung môi chloroform - methanol theo tỷ lệ 2:1 (v/v) và sau đó tinh chế theo phương pháp của Folch et al (1957) Dịch chiết lipid tinh khiết được làm bay hơi đến khô bằng thiết bị bay hơi nitơ Rapidrap (Labconco, MO) Hàm lượng khoáng được xác định thông qua phương pháp nung hóa tro ở nhiệt độ 650 °C.

Chén nung được làm sạch và nung ở nhiệt độ 650 o C cho đến khi đạt khối lượng ổn định Tiếp theo, mẫu rong 1,0 g được cân và cho vào cốc nung, sau đó đun trên bếp điện cho đến khi hóa than đen Cuối cùng, sau khi hóa than, mẫu được chuyển vào lò nung ở nhiệt độ thích hợp.

650 o C để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lượng không đổi.

Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m

A: Khối lượng chén nung + tro (g)

B: Khối lượng chén nung (g) m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm.

2.2.1.3 Xác định sulfate theo phương pháp BaCl 2 của Dodgson KS [92]

Hàm lượng sulfate được xác định qua phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin Đầu tiên, cân khoảng 5 mg mẫu carrageenan vào lọ thủy tinh 5ml, sau đó thêm 2 ml HCl 1N và thủy phân ở 100 độ C trong 6 giờ Tiếp theo, lấy 10 µl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm 100 µl TCA và 100 µl hỗn hợp 0,5% gelatin cùng 0,5% BaCl2, lắc đều và đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 360 nm.

DS(%) DS: hàm lượng sulfate (%); mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g); m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).

2.2.1.4 Xác định carbohydrate theo phương pháp phương pháp Phenol-Sulfuric acid của Dubois [93]

Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định qua phương pháp phenol-Sulfuric acid Để thực hiện, chuẩn bị dung dịch mẫu với nồng độ carbohydrate thích hợp Lấy 200 µl dung dịch mẫu, trộn với 200 µl thuốc thử phenol 5% và lắc đều cho đến khi dung dịch trong suốt Sau đó, thêm 1 ml sulfuric acid đậm đặc, lắc đều và đun cách thủy trong 5 phút Sau khi nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm Dung dịch chuẩn có thể sử dụng glucose hoặc galactose.

2.2.1.5 Xác định 3,6-anhydrogalactose theo phương pháp Yaphe và CS [94]