Nghiên cứu sự đa dạng của nhóm vi khuẩn có khả năng cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm ở đồng bằng sông cửu long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA BÙI HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA NHÓM VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CHẤT LƯỢNG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THƯƠNG PHẨM Ở ĐỜNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 62.42.80.05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH – THÁNG 01 NĂM 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Người hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Phản biện độc lập: PGS TS Nguyễn Đức Hoàng Phản biện độc lập: PGS TS Lê Hùng Anh Phản biện: Phản biện: Phản biện: PGS TS Lê Phi Nga PGS TS Trịnh Nọc Nam PGS TS Lê Hồng Phú Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp Trường đại học bách khoa Tp.HCM vào lúc 14 30 ngày 28 tháng 12 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM - Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí nước B.H.Quan, L.X.Nguyet, L.H.Trang, N.D.Luong, “Isolation of sulfide oxidizing bacteria in catfish ponds and optimization of sulfide removal efficiency using response surface methodology - central composite design”, Journal of Biotechnology 14(1A): 455-462, 2016 B.H.Quan, H.N.Anh, V.T.N.Anh, L.H.Trang, N.D.Luong, “Application of immobilized Nitrosomonas marina and Nitrobacter winogradskyi for the treatment of ammonia in aquaculture ponds”, Journal of Biotechnology 14(1A): 573-578, 2016 B.H.Quan, T.T.N.Tien, L.H.Trang, V.T.N.Anh, N.D.Luong, “Isolation of anaerobes from the sediments of catfish ponds and their application in treatment of aquaculture sewage”, Journal of Science and Technology 53 (5A):144-151, 2015 Kỷ yếu hội nghị quốc tế B.H.Quan, V.T.N.Anh, L.H.Trang, N.D.Luong, “Isolation and selection of protease producing bacteria from aquaculture water and sediments”, International Symposium on Food Security and Sustainable Development 2017 (ISFS 2017) (Poster) L.H.Trang, B.H.Quan, D.C.Thuan, P.A.Tuan, N.D.Luong, Optimization of protease production from Bacillus subtilis SIAMB79 (from aquaculture pond sediments) using RSM-CCD, International Symposium on Food Security and Sustainable Development 2017 (ISFS 2017) (Poster) Kỷ yếu hội nghị nước L.V.Nhật, B.H.Qn, N.Đ.Lượng, “Tối ưu hóa mơi trường ni cấy Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Nitrosomonas marina, Nitrobacter winogradskyii để tạo chế phẩm xử lý nước ao nuôi cá tra” Kỷ yếu Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, 2013 Mục lục CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Các nội dung của nghiên cứu 1.3 Mục tiêu của luận án 1.4 Ý nghĩa khoa học 1.5 Ý nghĩa thực tiễn 1.6 Tính của luận án 1.7 Cấu trúc của luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về nuôi cá tra thương phẩm ĐBSCL 2.2 Vi khuẩn nuôi thủy sản 2.3 Chất lượng nước ao nuôi thủy sản 2.4 Các biện pháp cải thiện chất lượng nước ao nuôi thủy sản CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.2 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Kết phân lập sự đa dạng về số lượng nhóm vi khuẩn 4.2 Kết định danh sự đa dạng về loài của vi khuẩn 11 4.3 Kết sự đa dạng về loài theo vị trí địa lý tuổi ao nuôi 14 4.4 Sự đa dạng lồi theo từng nhóm vi kh̉n 15 4.5 Kết thử nghiệm khả cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra của chủng vi khuẩn phân lập 20 4.5.1 khí Kết kiểm tra hoạt tính vi khuẩn xử lý TAN điều kiện hiếu 20 4.5.2 Kết chuyển hóa hợp chất nitơ vô điều kiện kỵ khí20 4.5.3 Kết xử lý H2S 21 4.5.4 Kết thử nghiệm hoạt tính kết tụ sinh học của chủng phân lập 21 4.5.5 4.6 Kết thử nghiệm khả chuyển hóa vật chất hũu 21 Kết tối ưu hóa nhân sinh khối của chủng vi khuẩn chọn 23 4.6.1 Kết tối ưu hóa điều kiện mơi trường nhân sinh khối NH5 Nitrosomonas marina 23 4.6.2 Kết tối ưu hóa mơi trường nhân sinh khối vi khuẩn B115 Xanthomonas bromi 23 4.6.3 Kết tối ưu hóa mơi trường nhân sinh khối Bacillus ehimensis 24 4.6.4 Kết tối ưu hóa mơi trường nhân sinh khối B.amyloliquefaciens 24 4.6.5 Kết tối ưu hóa mơi trường nhân sinh khối vi kh̉n P.humicus 24 4.6.6 Kết tối ưu hóa mơi trường nhân sinh khối P.eucalypti 24 4.6.7 Kết tối ưu môi trường nhân sinh khối P.polymyxa 25 4.6.8 4.6.8 Kết cố định vi khuẩn N maria N winogradskyi kết thử nghiệm xử lý ammonia nước ao nuôi cá tra 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Kiến nghị 26 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Chất lượng nước ao cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh thường không tốt [1] Sản xuất 1kg cá tra thương phẩm cần 7,4m3 nước sinh 19,7 lít bùn, cá chỉ hấp thụ 33,6% nitơ, thải môi trường nước 38,5%, bùn 1,17% vi sinh vật hấp thụ 26,7% [2] Vật chất khô, cá hấp thu 9,4%, nước 17,3%, bùn 4,93% phân hủy vi sinh vật yếu tố khác chiếm 68,3% [2] Như vậy, cá tra thương phẩm tạo lượng lớn chất thải vi sinh vật đóng vai trò quan trọng chuyển hóa chất thải Người ni cá tra đồng bằng sơng Cửu Long (ĐBSCL) trì chất lượng nước bằng cách thay nước hút bùn đáy định kỳ Đã có nghiên cứu vi sinh vật loại bỏ đạm môi trường [3], loại bỏ H2S [4], tạo enzyme [5], tạo chất kết tụ sinh học loại bỏ ô nhiễm [6] cải thiện chất lượng nước [7] ao cá tra, vi sinh vật tổng hợp enzyme ao nuôi cá [8] thực hiện Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu xác định sự đa dạng của nhóm vi khuẩn có khả cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra thương phẩm ĐBSCL Do vậy, nghiên cứu nhóm vi khuẩn sở khoa học quan trọng giúp kiểm soát chất lượng nước ao nuôi tra thương phẩm nội dung nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng của nhóm vi khuẩn có khả cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm Đồng bằng sông Cửu Long” 1.2 Các nội dung của nghiên cứu (1) Phân lập nhóm vi khuẩn chuyển hóa TAN điều kiện hiếu khí, hợp chất nitơ điều kiện kỵ khí, H2S, protein, tinh bột, cellulose, lipid nhóm vi khuẩn tạo chất keo tụ sinh học (2) Định danh chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA (3) Đánh giá sự đa dạng của chủng vi khuẩn phân lập về số lượng giống loài; thành phần giống lồi theo vị trí, tuổi ao nhóm hoạt tính (4) Xác định khả chuyển hóa TAN điều kiện hiếu khí, chuyển hóa hợp chất nitơ vô điều kiện kỵ khí, lưu huỳnh, protein, tinh bột, cellulose, lipid khả tạo chất keo tụ của chủng phân lập (5) Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy chủng có hoạt tính cải thiện chất lượng nước ao ni cá tra thương phẩm trội (6) Thử nghiệm khả xử lý TAN nước ao nuôi cá tra thực tế quy mô 10 lít của 02 chủng phân lập nhóm vi khuẩn xử lý TAN hiếu khí 1.3 Mục tiêu của luận án Phân lập xác định sự đa dạng sinh học của chủng vi khuẩn từ ao nuôi cá tra thương phẩm ĐBSCL, tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy thu sinh khối chủng vi kh̉n có hoạt tính cao đồng thời xác định khả xử lý nước ao nuôi cá tra thực tế 1.4 Ý nghĩa khoa học Luận án xác định sự đa dạng về số lượng chủng loại, đa dạng hình thức dinh dưỡng phân bố địa lý dọc sông Mekong của nhóm vi khuẩn có khả cải thiện nước ao nuôi cá tra thương phẩm ĐBSCL kết hợp giải trình tự gen 16S rRNA Luận án xác định môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu thu sinh khối chủng có hoạt tính cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra thương phẩm bật làm sở cho trình sản xuất sinh khối chủng Luận án xác định khả cải thiện nước ao nuôi cá tra thương phẩm thông qua thí nghiệm xử lý TAN bằng chế phẩm sản xuất từ sinh khối vi khuẩn tối ưu hóa cố định chất mang nước ao nuôi thực tế điều kiện phòng thí nghiệm (10 lít) 1.5 Ý nghĩa thực tiễn Luận án xây dựng sưu tập chủng vi khuẩn có khả cải thiện nước ao ni cá tra thương phẩm làm sở để ứng dụng thực tiễn Luận án xác định điều kiện lên men tối ưu nhân sinh khối chủng vi khuẩn có hoạt tính cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra sở sản xuất sinh khối chủng làm sản phẩm ứng dụng ao nuôi cá tra 1.6 Tính của luận án Đề tài nghiên cứu đầu tiên đưa đánh giá toàn diện sự đa dạng về số lượng, chủng loại, đa dạng về phân bố theo thời gian nuôi cá tra đa dạng về phân bố địa lý dọc sông Mekong của nhóm vi khuẩn có khả cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra thương phẩm ĐBSCL Đề tài xác định 28 lồi Paenibacillus lần đầu tiên cơng bố hiện diện mơi trường ao ni cá tra 10 lồi lần đầu tiên cơng bố có khả oxi hóa TAN điều kiện hiếu khí Đề tài cũng xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu bằng lên men tối thu sinh khối của chủng vi khuẩn chọn lựa định hướng ứng dụng để cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra 1.7 Cấu trúc của luận án Luận án gồm có chương Chương mở đầu đặt vấn đề cần nghiên cứu Chương tổng quan về nghiên cứu nền liên quan đến đề tài Chương vật liệu phương pháp nghiên cứu trình bày phương pháp áp dụng đề tài Chương kết biện luận trình bày tồn kết của nghiên cứu Chương kết luận kiến nghị tóm tắt kết đạt trình bày xu hướng nên thực hiện tương lai Tài liệu tham khảo trình bày toàn tài liệu trích dẫn luận án Phụ lục trình bày số trình tự gen 16S rRNA kết phân tích phương sai ma trận quy hoạch thực nghiệm tối ưu CHƯƠNG 2.1 TỞNG QUAN Tởng quan về ni cá tra thương phẩm ĐBSCL Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) người dân vùng ĐBSCL nuôi từ những thập kỷ 1960 Việc nuôi cá tra ngày trở nên phổ biến ĐBSCL thiên nhiên ưu đãi Cá tra thâm canh đạt suất trung bình 422 tấn/ha/vụ với thời gian ni trung bình 293 ngày/chu kỳ, trọng lượng trung bình thu hoạch 952 g/cá thể [2] Diện tích nuôi cá tra ĐBSCL năm 2020 đạt 5.700 ha, sản lượng ước đạt 1,56 triệu cá (VASEP, 2021) 2.2 Vi khuẩn nuôi thủy sản Sự đa dạng của vi khuẩn thủy sản khác theo độ mặn độ mặn ảnh hưởng đến vi hệ sinh da cá [9] Từ mẫu bùn nước của ao nuôi cá tra ĐBSCL, phân lập 1682 chủng vi khuẩn khử đạm ao nuôi thuộc giống Arthrobacter, Corynebacterium, Rhodococcus, Bacillus Pseudomonas [3] Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập từ nước thải ao nuôi cá tra ĐBSCL [10] Paracoccus versutus phân lập từ bùn ao ni cá tra Tiền Giang có khả chuyển hóa 125,78 mg/l ammonium sau 168 ni cấy môi trường ACC [11] Paracoccus Pseudomonas khử nitrate ao nuôi nước ngọt [12] Bacillus amyloliquefaciens Bacillus pumilus giúp cá chịu strees ammonia [19] Đã phân lập 654 chủng vi khuẩn từ bùn 525 chủng vi khuẩn từ nước nuôi trồng thủy sản thuộc ngành Actinobacteria, Firmicutes Proteobacteria, 27 giống, Bacillus (37,7%) Vibrio (28,1%) [13] 2.3 Chất lượng nước ao ni thủy sản Chất lượng nước đóng vai trò chính yếu ảnh hưởng đến sức khỏe của cá, sự suy giảm của chất lượng nước cũng gây stress cho cá, làm cho vi khuẩn hội xâm nhập cá cá bị bệnh [14] Nghiên cứu của Nguyễn Nhứt (2013)[2] cho rằng để sản xuất 1kg cá tra thương phẩm cần 7,4 m3 nước sinh 19,7 lít bùn Cá tra thương phẩm chỉ hấp thụ 33,6% nitơ thải môi trường nước 38,5%, bùn 1,17% vi sinh vật hấp thụ 26,7% Đối với vật chất khô, cá hấp thu chỉ 9,4%, chuyển vào nước 17,3%, bùn xả 4,93% phân hủy vi sinh vật yếu tố khác chiếm 68,3% [2] Ao nuôi đạt suất 300 tấn/ha/vụ vụ ni thải mơi trường khoảng 2.677 bùn ướt (tương đương 937 bùn khô) [15] Trong ao cá, nitơ tồn dạng khí nitơ tan nước, hợp chất vô NH4+, NO3-, NO2- hợp chất hữu acid amin, protein, … Hợp chất nitơ bị phân hủy thành TAN, chất bị phân hủy thành NO2- NO3-[16] tùy thuộc vào hoạt động của vi khuẩn môi trường nuôi địa có ao ni [32] Xem xét tính đa dạng của chủng vi khuẩn phân lập nhóm bằng cách xây dựng phát sinh lồi theo phương pháp neighbor join với bootstrap 1.000 (hình 4.12) Trong đề tài phân lập 10 giống vi khuẩn sinh tổng hợp chất kết tụ sinh học: Paenibacillus, Bacillus, Cytobacillus, Chryseobacterium, Streptomyces, Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Solibacillus, Methylobacterium Tất chủng thuộc về Actinobacteria, ngành Bacteroidetes, Firmicutes Proteobacteria Trong nhóm này, Bacillales chiếm ưu thế (hình 4.13) Nhiều nghiên cứu cũng xác định giống Bacillus [33], [34], Paneibacillus Chryseobacterium [36], Hình 4.13 Cây phát sinh lồi nhóm vi kh̉n sinh tổng hợp chất kết tụ sinh học [35], Streptomyces [37], Pseudomonas [38], Rhodococcus[39] , Solibacillus [40], Methylobacterium[41] sinh tổng hợp chất kết tụ sinh học Sự đa dạng về giống loài của Bacillales cao với giá trị bootstrap 1.000 lần lặp lại đa số nhỏ 50% Đề tài phân lập chủng có hoạt tính phân hủy protein thuộc giống vi khuẩn nằm nhánh phát sinh (hình 4.14) Các giống Hình 4.14 Cây phát sinh loài chủng phân hủy protein 17 Bacillus, Fictibacillus, Jeotgalibacillus [42], Lysinibacillus phù hợp với nghiên cứu trước về khả tạo protease Nhóm vi khuẩn phân hủy tinh bột thuộc Bacillales mà chủ yếu họ Bacillaceace Paenibacillaceae Chỉ có chủng Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae phân lập Trong 17 chủng phân lập được, 64,7% giống Bacillus Cây phát sinh lồi của nhóm vi kh̉n chuyển hóa tinh bột trình bày Hình 4.16 Cây phát sinh lồi nhóm vi kh̉n phân hủy tinh bột hình 4.15 Về mặt phân loại học, nhóm có hoạt tính chuyển hóa tinh bột mạnh Bacillus gồm amyloliquefaciens loài B.amyloliquefaciens, B.siamensis, B velezensis B.nakamurai đều tạo nhiều loại enzyme protease, lipase, xylanase, aminotransferase, α-amylase, cellulase, pectinase, barnase, peroxidase, and laccase [43] Hình 4.15 Cây phát sinh lồi nhóm vi kh̉n phân hủy cellulose Trong nhóm B velezensis đánh giá vi khuẩn tiềm sử dụng làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho động vật cá [43] Một nghiên cứu Việt Nam cũng phát hiện 12 18 chủng vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột ao ni cá xác định Bacillus, Paenibacillus và Streptomyces [8] Nhóm vi khuẩn có hoạt tính phân hủy cellulose từ bùn ao nuôi cá tra thương phẩm phân lập thu nhận 21 chủng có đặc điểm đại thể vi thể khác biệt Các chủng nhóm đa số thuộc về giống Paenibacillus (47,6%) Cây phát sinh loài với giá trị bootstrap lặp lại 1.000 lần trình bày hình 4.16 Hình 4.16 chỉ rằng chủng phân lập đa dạng với 15 nhánh hình thành từ 21 chủng Hiện nghiên cứu về hệ vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase ao ni cá thương phẩm còn Tại Việt Nam, phân lập chủng từ mẫu bùn chủng từ mẫu nước ao nuôi cá Thừa Thiên Huế, số chủng xác định Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas Streptomyces [8] Kết phù hợp với kết nghiên cứu của Trong nghiên cứu cũng phân lập vi khuẩn thuộc giống có khả phân hủy lipid ao ni cá Hình 4.17 trình bày phát sinh lồi của nhóm Paenibacillus, Bacillus, Brevibacillus, vi khuẩn này: Lysinibacillus, Geobacillus, Burkholderia, Cytobacillus, Pseudomonas Hầu hết chúng đều có khả sinh Hình 4.17 Cây phát sinh lồi nhóm vi kh̉n phân hủy lipid tổng hợp lipase, trừ giống Cytobacillus chưa nghiên cứu Đặc biệt giống Geobacillus có gen sinh tổng hợp lipase chịu nhiệt chịu kiềm [44] Trên thế giới chưa có nghiên cứu về nhóm vi khuẩn phân hủy lipid mơi trường ni trồng thủy sản nói chung môi trường ao nuôi cá tra thương phẩm nói riêng 19 Như vậy, nhóm vi khuẩn phân hủy chất hữu ao chiếm 46% (68 chủng) ưu thế so với nhóm khác Nhóm vi khuẩn tạo enzyme phân hủy chất hữu ao nuôi cũng nghiên cứu không nhiều 4.5 4.5.1 Kết quả thử nghiệm khả cải thiện chất lượng nước ao nuôi cá tra của chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả kiểm tra hoạt tính vi khuẩn xử lý TAN điều kiện hiếu khí Kết xác định hoạt tính xử lý TAN điều kiện hiếu khí của 36 vi khuẩn phân lập cho thấy: Ở nồng độ NH4+ 10mg/L môi trường nuôi cấy xử lý chủng vi khuẩn thử nghiệm đa số đều làm giảm TAN xuống 2mg/l Trong chủng NH5 làm giảm mạnh nhanh từ 10,4±0,01 mg/l (0 giờ) giảm 1,7±0,01 mg/l (24 giờ), 1,2a±0,01 (48 giờ), 0,8a±0,00 (72 giờ) (P