Đánh giá mối tương quan giữa động học hình thái và chất liệu di truyền trên phôi người

NGUYỄN DƢƠNG HƢNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÁNH GIÁ MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA ĐỘNG HỌC HÌNH THÁI VÀ CHẤT LIỆU DI TRUYỀN TRÊN PHÔI NGƢỜI NGUYỄN DƢƠNG HƢNG Hà Nội 2022 2019-2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ ĐÁNH GIÁ MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA ĐỘNG HỌC HÌNH THÁI VÀ CHẤT LIỆU DI TRUYỀN TRÊN PHÔI NGƢỜI NGUYỄN DƢƠNG HƢNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.Ts Tạ Thị Thu Thuỷ Hà Nội 2022 L I C M ĐO N T i C m o n yl ng tr nh nghi n u ri ng t i s liệu, k t n u lu n v n l trung th tk v hƣ t ng ƣ i ng tr nh n o kh T giả lu n v n Nguyễn Dƣơng Hƣng ng LỜI CẢM ƠN Để ho n th nh ƣ iệt tới tr y tỏ s ảm kí h ặ t i, Phó gi o sƣ ti n sỹ Tạ Thị Thu Thuỷ - Ngƣời ã ịnh hƣớng, ti p dẫn dắt v kho họ i lu n v n thạ sĩ n y, t i xin v n ho t i su t thời gi n th Xin h n th nh ảm ơn i giảng v ề t i nghi n u ộ s h C ng nghệ Sinh họ cô ã giúp ho t i mở m ng th m nhiều ki n th hữu í h sinh lý ngƣời nói chung ph i ngƣời nói ri ng Đồng thời, cô ũng l ngƣời lu n ho t i lời khuy n v ùng quý gi ả ki n th huy n m n ũng nhƣ ịnh hƣớng ph t triển s nghiệp Một lần nữ , t i xin gửi lời ảm ơn s i t ơn n cô ằng t t ả t m lòng v m nh T i ũng xin gửi lời ảm ơn h n th nh n B sĩ huy n kho Đỗ Duy Long – Kho Hỗ tr sinh sản Bệnh viện Sản Nhi Quảng Ninh ã truyền ạt ho t i ki n th hội thảo th y họ hi m muộn, kỹ n ng mềm ho nh nghi n sƣ h y v ý nghĩ T i xin tr n trọng ảm ơn s nhiệt t nh Quang ã d nh thời gi n quý u ể hỗ tr t i u, t m hiểu s u di truyền họ ƣ u ằng B sĩ di truyền họ Diệp Minh ho t i qu tr nh nghi n Giúp ho qu tr nh ho n th nh lu n v n nh nh hóng v hiệu nh t S u ùng, t i xin tỏ lòng i t ơn n h mẹ, ngƣời th n v ạn è ã lu n n ạnh ng hộ, ộng vi n t i uộ s ng ũng nhƣ thời gi n ho n th nh lu n v n thạ sĩ Xin h n th nh ảm ơn t t ả ngƣời!” MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Thụ tinh ống nghiệm (IVF - In vitro Fertilization) 1.2 Hệ thống nuôi cấy phôi Cấ u t rúc hệ t hố ng nuô i cấy p hôi 1.3 Sinh lý phát triển phôi ngƣời, đánh giá phôi IVF 1 3 3 Sự t hụ ti nh – gi đ oạ n hì nh t hà nh hợp t Giai đoạ n p hâ n cắ t p hô i ( đ ộ ng l ực họ c ) Đá nh g iá p hôi g iai đoạ n p hâ n chi a Cá c bấ t t hƣờng đ ộ ng họ c p hôi đƣợc g hi nhậ n b ằ ng hệ t hố ng t i me -la pse Đá nh g iá p hôi na ng ng ày 1.4 Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ 16 1.4.1 Đột biến NST phôi Cá c bệnh độ t b iến cấ u trúc NST t hƣờng t rên p hôi Phô i t hể k m 4 Xét ng hi ệm d i t ruyền ti ền m tổ (PGT -A ) 1.5 Các nghiên cứu khác hình thái phơi chất lƣợng di truyền giới 21 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1Tiêu chuẩn lựa chọn 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3 Địa Điểm Nghiên cứu 26 2.4 Chọn lựa mẫu 27 2.5 Các bƣớc tiến hành 27 2.6 Các tham số nghiên cứu 32 2.7 Xử lý số liệu 32 2.8 Đạo đức nghiên cứu 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Ảnh hƣởng độ tuổi bệnh nhân đến kết cục điều trị 33 3.2 Đánh giá động lực học phôi 35 Hình 17 Tỷ lệ xuất bất thường phân chia 35 3.3 Kết PGT-A 37 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU TH M KHẢO DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT a-CGH Array Comparative Genomic Hybridization/ Lai so s nh/ AMH a-SNP i hi u ộ gen dùng híp DN Anti Mullerian Hormone rr y Single Nu leotide Polymorphism/ Ph n tí h h nh ơn dùng chíp DNA CGH Comp r tive Genomi Hy ridiz tion/ L i so s nh ộ gen FISH Fluores ent In Situ Hy ridiz tion/ L i hu nh qu ng hỗ ICM Inner Cell M ss/ Kh i t ICSI Intra Cytoplasmic Sperm Injection/ Tiêm tinh trùng vào bào tƣơng o nụ ph i noãn IVF In vitro Fertiliz tion/ Thụ tinh ng nghiệm NGS Next Gener tion Sequen ing/ Giải tr nh t gene th hệ NST Nhiễm sắ thể PGT-A Preimplantation Genetic Testing for neuploidy/ Xét nghiệm di truyền lệ h ội tiền l m tổ TE Trophectoderm Epithelium/ Nguyên bào nuôi D NH MỤC HÌNH Hình 1.1 tr i: em é ầu ti n tr n th giới; phải: IVF dầu ti n Việt Nam Hình 1.2 M h nh y ut hệ th ng nu i (Nguồn: Turner, 2013) Hình 1.3 C th ng s ộng họ y ót ph i (Nguồn: ộng l n ph i lison C mp ell, 2015) Hình 1.4 Gi i oạn ph t triển ph i Hình 1.5 S lƣ ng ph i Hình 1.6 Ph i ph n mảnh (IVFQN) 11 Hình 1.8 Tỉ lệ kí h thƣớ ph i o lý tƣởng ph i gi i oạn ph n hi (2-, 4-, 8- t o) (Nguồn: Fern ndo JP, 2012) qu n iểm kiểu ph n hi ph i “st ge-spe ifi ” so với “non-st ge spe ifi ” M u x nh l ml ph i “st ge spe ifi ” M u x nh nhạt l ph i “non-st ge spe ifi ” (Nguồn: Fern ndo JP, 2012) Hình 1.9 Ph i nh n 13 Hình 1.10 Nguy n lý ph n hi ph n mảnh 13 Hình 1.11 Đ nh gi ph i n ng Fertility Center) 15 Hình 1.7 o Fenwi k J (2002) G rdner D K(1999) (Ngu n: Red Rock 11 Hình 1.12 H nh ảnh ph i khảm NST s 2s, 5s, 10 (IVFQN) 19 Hình 1.13 H nh ảnh ph i 19 nh thƣờng: 46,XY (IVFQN) Hình 1.14 Sinh thi t ph i N5 ( Chuẩn ị nguy n liệu ho PGT-A) 20 Hình 2.1 Hệ Th ng time – l pse GERI PLUS IVF Quảng Ninh 24 Hình 3.1 Tỷ lệ xu t 40 Hình 3.2 Tỷ lệ t thƣờng ph n chia loại ột i n 35 D NH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đ nh gi ph i n ng theo ti u huẩn Bảng 3.1 Tổng s Bảng 3.2 Ph n G rdner D K (1999) ệnh nh n 33 tuổi ệnh nh n v k t ụ iều trị 34 Bảng 3.4 Tỷ lệ tạo ph i n ng 36 Bảng 3.5 Khả n ng tạo ph i n ng Bảng 3.6 M i tƣơng qu n giữ Bảng 3.7 Tỷ lệ ph i hỉnh ội Bảng 3.8 C 15 nhóm ph i ph n hi t thƣờng ộng họ v k t di truyền nhóm ph i ph n hi NST ột i n thƣờng gặp t thƣờng 37 38 38 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện n y, tỷ lệ v sinh ng y sinh sản hi m muộn ng y ặp v k ng t ng l n, ầy hồng ộ tuổi ng nhiều Theo Bộ y t Việt N m ó khoảng 7,7% hồng v sinh hi m muộn v 50% s hƣ ặp v ó ộ tuổi sinh sản Một th ng Bộ Y t , khoảng 30% trƣờng h p v sinh nguy n nh n t ngƣời hồng, 30% v , 30% t hi m muộn ng ng y ả h i v 10% kh ng rõ nguy n nh n Độ tuổi v sinh, ng trẻ hó v em lại lo ngại ho nhiều ặp i trẻ n y Nguy n nh n h y gặp nữ l tắ h i vòi tử ung, hội h ng uồng tr ng n ng, lạ nội mạ tử ung ƣờng sinh dụ Cuộ s ng gặp p l Ngƣời ó tinh trùng nhƣng y u, ít, qu i ị, vi m tinh ho n Cùng với s t thƣờng ẩm sinh gene, hệ iệt v ph t triển (IVF - In vitro fertiliz tion) r giữ y họ v sinh họ v nhiễm ũng l m t ng t nh kho họ , kỹ thu t thụ tinh ng nghiệm ời v ng y ng ƣ ng dụng rộng rãi iều thụ tinh ng nghiệm (IVF) n nhiều huy n ng nh nhƣ sinh họ sinh sản, sinh họ t kho , nội ti t họ , di truyền họ ệnh hồng trẻ trị v sinh tr n to n th giới Cơ sở họ thu t Do ó, IVF ƣ o, sản phụ xem l s k t h p mẫu m ể ng dụng v o iều trị l m s ng ho ệnh nh n Việt N m nƣớ tr n th giới 20 n m v lĩnh v t thƣờng hoặ tắ nghẽn hệ th ng dẫn tinh Ngo i r , m i trƣờng ộ hại, trạng v sinh hi m muộn, ặ is u ng thẳng, g y r i loạn qu tr nh rụng tr ng N m giới v sinh thƣờng kh ng có tinh trùng suy tinh ho n, xu t tinh ngƣ li n qu n , IVF Tuy v y húng t nƣớ khu v ã ó ƣ IVF, v i kĩ thu t huy n iệt, húng t khoảng 10 - 15 n m vị trí qu n trọng khu ã tiệm th giới Với tiềm n ng thị trƣờng v nguồn nh n l n tr nh ộ h ng ầu , húng t ng ng trƣớ hội r t lớn ể ph t triển IVF th nh mũi nhọn Y họ v C ng nghệ sinh họ Việt N m Trong kỹ thu t n y, tinh trùng v tr ng ƣ thể v s u ó ƣ k t h p tạo ph i phịng thí nghiệm Ph i ƣ n ng y s u ó huyển v o uồng tử ung l y r khỏi nu i t ngƣời phụ nữ Hiện n y IVF v th NST, hi m tỷ lệ l 23,29% v 24,92%; òn lại ột i n khảm m t oạn v 100% 80% 60% 40% 23,29% 18,73% 17,92% 24,92% 56 20% 3,09% 3,58% 4,40% 4,07% 0% Mất NST Thừa NST Mất đoạn Lặp Khảm Khảm Khảm Khảm thừa thừa đoạn NST NST đoạn đoạn Đột biến số lƣợng (36,65%) th Đột biến cấu trúc Đột biến khảm (6.67%) oạn lần lƣ t l 4,40% v 4,07% (H nh 16) (56.68%) Hình 3.2 Tỷ lệ loại đột biến Ngo i ột i n khảm, ịn ó t nh trạng ột i n s lƣ ng ũng r t phổ i n, tỷ lệ xu t ột i n s lƣ ng NST l 36,65%; ó ột i n m t NST v th NST tƣơng ƣơng nh u lần lƣ t l 18,73% v 17,92% Điều n y tƣơng t nghi n xỉ C nghi n u tr n 15169 ph i, nhóm t ột i n th u Fr n si k v ộng s (2014) giả hỉ r tỷ lệ trisomy/monosomy x p NST v m t NST l phổ i n v gần nhƣ hi m tỉ lệ tƣơng ƣơng nhƣ 40 Tỷ lệ xu t ột i n u trú NST nghi n u húng t i l th p nh t hi m 6,67%; ó ột i n m t oạn v lặp oạn lần lƣ t l 3,09% v 3,58% Bảng 3.8: C NST ột i n thƣờng gặp Trong 88 phơi lệ h ội ảng … nhóm nghi n NST ó iểu ệnh ƣ u ghi nh n ti p y họ th ng k NST đột biến Số phôi Tỷ lệ +13 25 2,62% +16 43 4,51% +18 16 1,68% +21 36 3,78% +22 19 1,99% +X 12 1,26% -X 32 3,36% Nh n xét: K t ảng ho th y: tỷ lệ trisomy 16 hi m tỷ lệ o nh t l 4,51%; tỷ lệ trisomy 22 hi m 1,99% Chúng t i ũng th ng k ƣ tỷ lệ ột i n trisomy 13, trisomy 18, trisomy 21 lần lƣ t l 2,62%; 1,68%; 3,78% C ột i n n y g y n n hội h ng P t u, hội h ng Edw rds v hội h ng Down tr n l m s ng Đ i với NST giới tính, húng t i ghi nh n tr n NST X: ột i n trisomy xảy 12 trƣờng h p hi m tỷ lệ 1,26% v hi m tỷ lệ kh thể sảy r tr n o l 3,36% S t NST n o Đặ ột i n monosomy tr n 32 trƣờng h p t thƣờng NST gi i oạn ph i tiền l m tổ ó iệt l NST m tới hƣơng tr nh s ng lọ tiền sinh lại ó tỷ lệ Nhóm t giả Ru io n m 2013, hỉ r t thƣờng kh o nhƣ 16, 22 NST ị ảnh hƣởng nhiều nh t i với ả ệnh nh n ó ph i kh ng l m tổ li n ti p v 41 húng t thƣờng nghĩ ệnh nh n lớn tuổi l NST 22 v 16 s u ó l NST 13, 21, 18, XY, 15, 17 ho nhóm ệnh nh n ị ph i kh ng l m tổ li n ti p v 21, 15, 13, 18, 17 v XY nhóm ệnh nh n lớn tuổi Fr n si k v ộng s (2014) ã sử dụng phƣơng ph p RT - PCR v SNP ể NST nh gi 23 ặp ph i n ng K t l NST h y ị lệ h ội nh t ũng l 13, 15, 16, 18, 19, 21 22 C ột i n thƣờng gặp n y ũng tƣ ng t nghi n Thị Kh nh Vy (22, 19, 16, 15, 21 v XY), th i t thƣờng ó thể ph t ƣ u n m 2016 Ph n y ũng l s i lệ h NST li n qu n n thời gian mang thai Đột i n trisomy 16 v trisomy 22 l ột i n g y n n tƣ ng sảy th i sớm trƣớ tuần 12, i với ệnh nh n th loại ột i n n y ó ý nghĩ kỹ thu t IVF th việ s ng lọ k qu n trọng ảnh hƣởng tr ti p n tỷ lệ ó thai ũng nhƣ tỷ lệ sinh s ng C ột i n òn lại g y ảnh hƣởng tới s s ng, trí tuệ, khả n ng sinh sản trẻ g y n n nhửng ảnh hƣởng r t lớn ả v t h t lẫn tinh th n ho ản th n trẻ ũng nhƣ ảnh hƣởng tới gi húng t i phù h p với k t Chính v th , việ ph t thiện tỷ lệ th nh ng hu k nh v to n thể xã hội Có thể th y k t nghi n u ã th trƣớ y ột i n tr n kh ng ã góp phần ải iều trị m ho n to n khỏe mạnh 42 ịn góp phần ho r ời em é CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nu i t y ph i tới gi i oạn ph i n ng ng y v sử dụng phƣơng ph p giải tr nh gen th hệ (Next Gener tion Sequen ing / NGS) NST nh gi to n ộ 23 ặp 261 ph i thụ tinh ng nghiệm húng t i ó k t lu n s u: - Đ i tƣ ng ệnh nh n: Tổng s ệnh nh n th m gi nghi n u l 61 ệnh nh n Tuổi trung nhóm i tƣ ng nghi n u l 32 ± 5,29 Cho th y ộ tuổi hƣởng n hƣớng iều trị v sinh ũng nhƣ k t ụ iều trị ó tiền sử “nặng nề” Nhóm ệnh nh n hính l m s ng lọ hi m 38,6% v y l nhóm ó nguy th i theo s tuổi B n ạnh ó k t ụ