Chọn t t ả ph i ƣ nu i n dạng ph i n ng ó hỉ ịnh nu i y ph i li n tụ Time-l pse v th hiện xét nghiệm di truyền tiền l m tổ tại Kho hỗ tr sinh sản - ệnh viện Sản Nhi Quảng Ninh t 9/2020 – 12/2021.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong nghi n u sử dụng phƣơng ph p ể theo dõi v nh gi ph i ũng nhƣ ph n tí h di truyền ph i
- Phƣơng ph p theo dõi ph i li n tụ time-lapse:
Hệ th ng time-l pse (TLS) l một phƣơng ph p nh gi h t lƣ ng ph i kh ng x m l n mới ƣ ph t triển So với hệ th ng nu i y th ng thƣờng, TLS ung p iều kiện nu i y ổn ịnh v ghi nh n hi ti t về gi i oạn ph t triển n ầu ph i th i ngƣời C nghi n u ã hỉ r rằng h i ph i gi ng nh u về h nh th i ó thể ó qu tr nh ph t triển ho n to n kh nh u n u ƣ ph n tí h ằng TLS Do ó, TLS ó thể loại tr một s ph i ph n ắt t thƣờng ƣ oi l ó tiềm n ng ph t triển „ nh thƣờng‟ trong nh gi tĩnh ằng h sử dụng t m th ng thƣờng. L họn úng ph i huyển nhằm t ng tỉ lệ th i, ồng thời giảm s ph i huyển, giảm tỉ lệ th i l một th h th h ng ầu ho huy n vi n phôi họ trong lĩnh v hỗ tr sinh sản Hiện n y, phần lớn việ họn ph i h y u d v o h nh th i Tuy nhi n, phƣơng ph p n y ó gi trị d o n th p Có nhiều
24
phƣơng ph p mới giúp ải thiện việ l họn ph i ó tiềm n ng nhằm t ng tỉ lệ thành công trong iều trị IVF Trong ó, hệ th ng nu i y ph i k t h p với mer qu n s t li n tụ (TLM: time-l pse monitoring) ho phép nh gi hi ti t h nh th i ph i, ung p th ng s ộng họ v ng ụ l họn ph i TLM giúp l họn ph i tiềm n ng l m tổ t t hơn, dẫn n tỉ lệ trẻ sinh o hơn so với nu i y t th ng thƣờng Tuy nhi n, gi trị l m s ng time-l pse hỉ ƣ ng nh n ở một v i nghi n u
Hình 2.1: Hệ Thống time – lapse GERI PLUS tại IVF Quảng Ninh
- Phƣơng ph p nh giá ộng họ hình thái ph i:
Để nh gi qu tr nh ph n hi ph i d tr n s lƣ ng ph i o, hội nghị ồng thu n Ist n ul ã th ng nh t những m ụ thể, o gồm: Ng y 1 (26 ± 1 h s u ICSI) : 2 t o; Ng y 2 (44 ± 1 h): 4 t o v Ng y 3 (68± 1 h): 8 t o S ph n ắt sớm (lần ph n hi lần ầu ti n xảy r trƣớ 26±1 giờ i với ICSI , 28 ±1 giờ i với IVF) ã ƣ h ng minh l ó tƣơng qu n với h t lƣ ng ph i t t, s ph t triển ph i n ng v tỷ lệ ó th i t t
Ch t lƣ ng ph i trong hỗ tr sinh sản ƣ nh gi h y u d tr n ti u huẩn ph n loại về h nh th i ph i nhằm họn l ph i ó tiềm n ng ể sử dụng
25
Đ i với ph i ph n hi , nh gi o gồm s ph i o, ộ ồng ều giữ ph i o v m ộ ph n mảnh S lƣ ng ph i o tại thời iểm ng y 3 sẽ phản nh khả n ng ph n hi v ƣ xem l một trong những hỉ s d o n tiềm n ng ph t triển ph i C nghi n u ho th y i với ph i ph n hi ng y 3 ó s lƣ ng ph i o ít, tiềm n ng ph t triển v tỉ lệ th i sẽ giảm, tỉ lệ sẩy th i t ng ở nhóm huyển ph i ng y 3 ó ít hơn 6 ph i o K t quả o o t một nghi n u kh ho th y tiềm n ng ph t triển ở ph i ≤ 6 ph i o giảm so với ph i ≥ 7 ph i o Do ó, ph i ng y 3 với s ph i o ít hơn 6 thƣờng kh ng ƣ sử dụng thƣờng quy tại nhiều trung t m Một s trung t m l họn nu i y ph i n gi i oạn ph i n ng nhằm t ng tỉ lệ l m tổ, tỉ lệ th i l m s ng v tỉ lệ trẻ sinh s ng, tuy nhi n th ng tin về tỉ lệ ph i n ng v k t quả l m s ng trong hu k huyển ph i ng lạnh ph i ng y 3 ó s lƣ ng ph i o ≤ 6 l r t hạn h Nghi n u n y (2021) nhằm mụ í h nh gi tiềm n ng ph t triển v tỉ lệ th i khi ph n tí h k t quả l m s ng ở ph i ng y 3 ó ≤ 6 ph i o v ph i n ng ƣ rã nu i t các phôi này.
- Phƣơng ph p PGT-A:
Đ y l một kỹ thu t lớn o gồm nhiều kỹ thu t huy n s u trong ó, PGT-A mang lại một hu k iều trị v sinh n to n hơn C i tƣ ng ệnh nh n ó tiền sử “nặng nề” th y l một phƣơng ph p mở r on ƣờng iều trị ho họ
+ Kỹ thu t sinh thi t phôi:
Kỹ thu t sinh thi t ph i ƣ ph t triển nhƣ l một ng ụ nhằm hỗ tr hẩn o n di truyền ph i trong lĩnh v hỗ tr sinh sản Tuy nhi n, hiệu quả kỹ thu t n y vẫn òn hƣ th s ƣ ng nh n Việ hẩn o n s i dẫn n ộ nhạy v ộ ặ hiệu th p ũng nhƣ nguy ơ g y tổn thƣơng ph i khi sinh thi t l một trong những nhƣ iểm lớn PGT- Kỹ thu t sinh thi t ó thể hi th nh 2 nhóm: nhóm th hiện kho n mở ZP v o gi i oạn ph i ng y 3 s u ó nu i n ng y 5 v nhóm th hiện kho n mở ZP ở gi i oạn ph i ng y 5 Hiện n y, hƣ ó quy tr nh kỹ thu t ụ thể th ng nh t ho qu tr nh sinh thi t ph i B i vi t n y tổng qu n tr nh
26
y những v n ề ng òn g y tr nh ãi về việ sử dụng kỹ thu t sinh thi t ph i trên lâm sàng.
Th hiện tr n ph i n ng ( ph i ng y 5) khi ó ph i ó 2 dạng t o iệt ho hính l t o nh n (ICM) v t o l nu i (TE) Th hiện tr n kính hiển vi ảo ngƣ ùng ộ l ser l y 2-5 t o l nu i (TE), rử ph i o v lƣu giữ với m i trƣờng Polyvinylpyrrolidone (PVP) ph loãng s u ó khuy h ại ộ gen (WG ) ằng ộ kit ri ng iệt
+ Kỹ thu t giải tr nh t gen NGS:
Giải tr nh t gen l kỹ thu t x ịnh tr nh t DN gen ụ thể, mã ho hoặ kh ng mã ho ho protein h n ng ụ thể Giải tr nh t gen th hệ mới (Next-Gener tion Sequen ing, NGS) l ng nghệ ho phép giải mã ồng thời h ng triệu DN ùng lú , qu ó giúp n ng o hiệu su t qu tr nh giải mã hệ gen ngƣời
Giải tr nh t llumin : Giải tr nh t Ro he 454 (h y òn gọi l pyrosequen ing 454): Kỹ thu t n y d tr n nguy n lý “giải tr nh t ằng tổng h p” o gồm: khởi ộng một s i DN ã ƣ giải tr nh t v giải tr nh t s i ổ sung ằng phản ng enzyme C ng nghệ giải tr nh t pyrosequen ing 454 ó tính nhạy o hơn hẳn so với phƣơng ph p truyền th ng, ộ hính x l n tới 99,9% với oạn 200 se v 99% với oạn 400 se Chỉ trong vòng 10 giờ, hệ th ng giải tr nh t ƣ 400-600 triệu p, giúp ti t kiệm ng kể hi phí so với khi sử dụng phƣơng ph p S nger ể giải tr nh t một s lƣ ng lớn DN Tuy nhi n, pyrosequen ing 454 vẫn t n kém hơn so với h i ng nghệ NGS kh ƣ hỉ r trong phần n y V hạn h lớn nh t pyrosequen ing 454 l việ khó ph n tí h hính x một loại xit nu lei lặp lại li n tụ t 6 nu leotide trở l n.
2.3 Địa Điểm Nghiên cứu
27
2.4 Chọn lựa mẫu
- Đ i tƣ ng ệnh nh n: T t ả ệnh nh n ó hỉ ịnh nu i y ph i li n tụ (Time - lapse) và sàng lọ ph i tiền l m tổ (PGT-A).
- Đ i tƣ ng nghi n u: Ph i s ng lọ tiền l m tổ PGT- ồng thời ƣ nu i y t ng y 1 n ng y 5 trong time-lapse.
K t quả: Thu ƣ 261 ph i 61 ệnh nh n trong 62 hu k iều trị thụ tinh trong ng nghiệm
2.5 Các bƣớc tiến hành
Bƣớ 1: Th m kh m v hẩn o n nguy n nh n hi m muộn
Th hiện xét nghiệm ơ ản nh gi khả n ng sinh sản nguời v v hồng
C th m dò ắt uộ ho ngƣời v : - Si u m m s n ng noãn th p - MH, Prol tin ng y t k hu k kinh - FSH ơ ản ng y ó kinh th 2
- HSG sau sạ h kinh 2-4 ngày
C th m dò ắt uộ ho ngƣời hồng: - Tinh dị h ồ
Bƣớ 2: Kí h thí h uồng tr ng
- Si u m ƣờng m ạo nghi nh n t nh trạng 2 u ng tr ng, s n ng noãn th p Chỉ ịnh u ng Clomiphen 25 mg/ng y n u kh ng tồn tại n ng noãn tồn dƣ U ng thu li n tụ ho n ng y si u m xu t hiện n ng noãn trội >12 mm v ti p tụ n ng y ó n ng trƣởng th nh >20 mm
28
- L y m u xét nghiệm Estr diol, LH, Progesterone tại thời iểm trigger Estr diol có gi trị ti n o n họ hút noãn th nh ng n u ạt >300 pg/ml
Bƣớ 3: Chọ hút noãn
- Chọ hút s u trigger 36 giờ tại phòng th thu t
- Bệnh nh n nằm tƣ th phụ kho , g y m ƣờng tĩnh mạ h, vệ sinh ơ qu n sinh dụ
- Si u m ầu dò m ạo khảo s t h i uồng tr ng
- Gắn kim họ hút noãn, ti n h nh họ hút dị h n ng t ng n ng noãn ằng t y dƣới hỉ dẫn si u m
- Chuyển ng nghiệm h dị h n ng nỗn ho phịng L o IVF ể t m noãn
- S u họ hút noãn ệnh nh n ƣ u ng kh ng sinh moxi ilin 500 mg X 2 vi n/ng y X 5 ng y v hờ h nh kinh trở lại
Bƣớ 4: T h noãn v nh gi h t lƣ ng noãn - L o IVF nh n ng nghiệm h dị h n ng noãn
- Bom dị h n ng noãn v o ĩ peptri, t m v nhặt ph h p noãn-t o hạt (OCC) dƣới kính hiển vi soi nổi trong t thao tác vô trùng.
- Hút huyển kh i OCC s ng ĩ rử , ti n h nh rử , nh gi so ộ o , nu i y OCC trong t y tri-g s (37 ộ , 5% Ơ2, 6% CO2) trong 30 phút - 1 giờ
- S u ó t h kh i OCC ằng m i trƣờng h men Hy ruronid se v pipette ể loại ỏ h t t o hạt o qu nh noãn, nh gi h t lƣ ng noãn v s trƣởng th nh noãn.
Bƣớ 5: Chuẩn ị tinh trùng
- Với mẫu tinh trùng u l y theo phuơng ph p t nhi n: ể ly giải trong
t m 37 ộ trong 30 phút Đọ v ghi nh n ặ iểm tinh dị h ồ truớ 20 lọ rử (m t ộ tinh trùng, thể tí h tinh dị h, tỉ lệ tinh trùng di ộng ti n tới, t ộng)
29
- Với mẫu tinh trùng phẫu thu t: ph loãng mẫu thu u với m i truờng sperm rinse v nh gi s lu ng tinh trùng duới kính hiển vi ảo ngu
- Với mẫu tinh trùng ng lạnh: ti n h nh rã ng tinh trùng theo quy tr nh
- Th hiện lọ tinh trùng theo phuơng ph p th ng nồng ộ với m i truờng (Sil- select plus 90 và 45).
- Qu y ly t m l y tinh trùng, t ộ v thời gi n ly t m tùy thuộ loại mẫu v h t lu ng mẫu tinh trùng, th ng thuờng 1500 vòng/phút X 15 phút
- Rử tinh trùng trong m i truờng sperm rinse v nh gi k t quả s u lọ rử (m t ộ tinh trùng s u rử , thể tí h, tỉ lệ tinh trùng di ộng ti n tới)
- Chuyển mẫu tinh trùng ho phòng L o IVF th hiện IVF hoặ ICSI Bƣớ 6: Ti m tinh trùng v o o tƣơng noãn
- Chuẩn ị v kiểm tr hệ th ng kính hiển vi soi nổi, hệ th ng vi ti m, vi th o t , ệ m
- Đặt tinh trùng v noãn v o ĩ ICSI ã u huẩn ị truớ ó t i thiểu 6 giờ (37oC, 5% O2, 6% CO2).
- Qu n s t, l họn tinh trùng ể ICSI, t ộng tinh trùng - Hút tinh trùng vào kim vi tiêm.
- Ti m tinh trùng v o o tƣơng noãn
- Chuyển noãn ã ti m tinh trùng v o t th o t ể rử v huyển v o ĩ nu i y Time Lapse.
Bƣớ 7: Theo dõi v nh gi ph i Ng y 3 tr n thi t ị time-lapse Qu n s t tr n m n h nh thi t ị Geri plus
Đ nh gi qu tr nh ph n hi ( t lần ph n hi ầu ti n xảy r trƣớ 26±1 giờ i với ICSI)
30
Bƣớ 8: Sinh thi t ph i Ng y 5 ( huẩn ị h t liệu hạy PGT-A)
Qu n s t s ph t triển ph i tr n hệ th ng time l pse, khi ph i ạt n gi i oạn ph i n ng sớm (kho ng n ng ộ 1) th hiện hỗ tr ph i tho t m ng với ƣờng kính lỗ 6- 8 µm.
Qu n s t ph i ph t triển ti p tụ tr n Timel pse, khi phần t o l nu i ph i tho t m ng ƣ khoảng 30-50% thể tí h ph i th th hiện sinh thi t (thƣờng diễn r khoảng 16 n 18 giờ s u khi hỗ tr ph i tho t m ng)
+ Th hiện sinh thi t ph i:
Điều hỉnh kính, kiểm tr hệ th ng vi tiêm và vi thao tác Gắn kim holding v kim iopsy v o hệ th ng vi ti m
Tr ng kim trong giọt G ĩ tr ng kim, huyển s ng giọt P ể l y p l ho kim sinh thi t
Chuyển ph i v o ĩ sinh thi t
Dùng kim holding giữ ịnh ph i ở vị trí i diện với phần ph i ã tho t m ng Dùng kim sinh thi t hút một phần t o l nu i ã tho t m ng, ƣớ lƣ ng ã hút ƣ khoảng 5-8 t o th kéo nhẹ nh ng kim sinh thi t ho phần li n k t giữ t o ng v ộ lộ rõ
Kéo, ẩy v d y nhẹ kim sinh thi t ể l m t li n k t giữ t o Trong trƣờng h p t o kh ng t t, dùng l ser ắt 1 ƣờng ở phần li n k t hẹp nh t giữ 2 t o, rồi ti p tụ kéo, ẩy v d y nhẹ kim sinh thi t ể t o t h rời nhau.
Đẩy ph i về tr n giọt sinh thi t v nhả t o ở dƣới giọt sinh thi t tr nh ụm t o ị dính trở lại ph i
Chuyển ph i v o ĩ nu i theo úng th t sinh thi t ph i tr n ĩ sinh thi t, tr nh hút phải phần t o v sinh thi t ƣ Ghi lại h t lƣ ng ph i
31
+ S u khi ho n th nh sinh thi t ph i, ti n h nh rử t o: L y m i trƣờng PBS trong t ảo quản r ệ m ể rã
Ghi mã s sinh thi t v s th t ph i l n tu PCR, 1 tu PCR ghi Neg ể l m tu h ng m
+ L m ĩ rử t o:
Sử dụng ĩ petri 60mm ể l m ĩ rử t o
Dùng Mi ropipette ặt 3 giọt m i trƣờng G-mops ở h ng tr n v 3 giọt m i trƣờng PBS ở h ng dƣới, mỗi giọt thể tí h 50 µl
Sử dụng pipette rử t o hút ụm t o t ĩ sinh thi t, lần lƣ t rử qu giọt m i trƣờng theo th t t tr i qu phải, t tr n xu ng dƣới
Dùng mi ropipette ịnh lƣ ng 2 5 µl hút t o ùng m i trƣờng PBS v o tu PCR Hút m i trƣờng PBS ở giọt rử u i ho v o tu Neg ể l m h ng m
Mỗi ƣớ th o t phải ó ngƣời he k héo mã s sinh thi t, mã s ph i tr n ĩ v trên tub PCR.
Bảo quản tu PCR h t o ở nhiệt ộ 2-8oC trƣớ khi l m xét nghiệm di truyền
S u khi ho n th nh rử t o, ti n h nh ng ph i theo quy tr nh, mỗi ph i ng 1 ọng ó nh mã s theo mã s ph i
Bƣớ 9: Đ nh gi k t quả di truyền ph i
Bƣớ 10: Thu nh n v ph n tí h s liệu
Ngày 0 Thu nh n noãn, tinh trùng