Nghiên cứu trích ly enzyme từ dịch trích gừng

T ng quan v enzyme proteolytic

S l c v enzyme

Enzyme là các chất xúc tác có kích thước từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, không thể đi qua màng bán thấm Chúng có vai trò quan trọng trong việc xúc tác các phản ứng hóa học trong cơ thể sống, giúp đảm bảo quá trình chuyển hóa các chất diễn ra một cách trật tự và hiệu quả Enzymes tạo điều kiện cho các phản ứng hóa học cần thiết cho sự sống, duy trì sự ổn định và cân bằng trong cơ thể.

Enzyme là những chất xúc tác quan trọng trong mô sống, có thể được tách ra từ tế bào vi sinh vật và thực vật Khi tách ra khỏi tế bào, enzyme vẫn giữ được tính chất và khả năng xúc tác của mình, đặc biệt khi được chiết xuất từ dung dịch khô Có ba nguồn nguyên liệu chính để thu nhận enzyme: mô sống của thực vật, mô sống của động vật, và tế bào vi sinh vật.

S l c v enzyme proteolytic

Protease là enzyme có khả năng phân hủy protein bằng cách xúc tác quá trình phân cắt liên kết peptide (-CO-NH-) giữa các L-amino acid, tạo ra các amino acid tự do và một số peptide ngắn, pepton Ngoài ra, protease cũng tác động đến các liên kết ester đơn giản.

 D a vào s phân b có th chia protease làm hai nhóm:

- Endopeptidase: enzyme th y phân peptid gi a m ch

- Exopeptidase: enzyme phân c t các liên k t peptid đ u m ch

 D a vào ngu n thu nh n enzyme:

 D a vào các nhóm ch c trong trung tâm ho t đ ng c a enzyme

- Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombinầ

- Thiol protease (SH): papain, bromelineầ

- Aspartic protease (COOH): pepsin, reninầ

- Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (c n trung tâm ho t đ ng là Zn2+ ho c Mg2+)

1.1.2.3 Tình hình nghiên c u protease trong n c n c ta hi n nay, công b nhi u công trình nghiên c u protease Ch y u là nghiên c u tách chi t tinh s ch và ng d ng c a enzyme các l nh v c công ngh th c ph m và m ph m, d c ph m

Nghiên cứu của Tr n Thanh Trúc và cộng sự (2014) tập trung vào quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đậu tôm sú (Penaeus monodon) Kết quả cho thấy, việc trữ đông nguyên liệu trong 8 tuần giúp duy trì hoạt tính enzyme protease Enzyme này đạt hoạt tính cao nhất là 13,48 U/g chất khô nguyên liệu với điều kiện trích ly tối ưu: tỉ lệ dung môi 1:4 (w/v), pH 9,0, nhiệt độ 50°C và thời gian trích ly 40 phút.

Nghiên cứu của Hà Th Th y Vy và các cộng sự (2016) đã chỉ ra ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh chế enzyme protease chiết xuất từ thịt đậu tôm Kết quả cho thấy ethanol là dung môi tối ưu cho quá trình chiết xuất protease từ cả hai loại tôm (sú và thẻ chân trắng) Đối với tôm sú, tỉ lệ dung môi ethanol là 1:4 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút, đạt hoạt tính riêng 3,49 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 87,46% Trong khi đó, đối với tôm thẻ, tỉ lệ dung môi ethanol là 1:3 (v/v), cho thấy sự tối ưu trong quá trình chiết xuất.

30 phút cho giá tr l n l t là 2,04 U/mg protein, 85,66% và 3,23 l n C hai lo i protease đ c xác đnh b ng đi n di SDS-PAGE có tr ng l ng phân t là 35,8 ÷ 40,5 kDa

Võ V n Qu c B o và các c ng s (2018), thu nh n và kh o sát m t s tính ch t c a ch ph m Ficin t nh a qu v (Ficus auriculata L.) nghiên c u các y u t nh h ng đ n quá trình thu nh n ch ph m ficin t d ch nh a qu v c ng nh kh o sát m t s tính ch t đ c tr ng c a ch ph m enzyme này nh m nâng cao giá tr s d ng c a qu v t i

Th a Thiên Hu là nguồn nguyên liệu giàu protein và có hoạt động protease cao nhất, với giá trị đạt 2,212 mg/g chất khô và 1,077 Hp/ml khi tách chiết bằng dung môi ethanol 96% với tỷ lệ 1/4 ở nhiệt độ 3°C Thời gian thu nhận enzyme này tối ưu là 60 phút Hoạt động của protease đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ 45°C và pH 6, trong khoảng nhiệt độ từ 35°C đến 50°C trong vòng 1 giờ.

1.1.2.4 Tình hình nghiên c u protease ngoƠi n c

Corvisat (1857) chi t tách trypsin t d ch t y, đơy lƠ protease đ u tiên đ c thu nh n nh ng ch a tinh s ch

Danivevski (1862) chi t tách trypsin, amylase t y t ng b ng ph ng pháp h p ph

Nghiên c u nƠy có Ủ ngh a quan tr ng trong chi t tách và nghiên c u các tính ch t c a enzyme c ng nh protein Ti p theo đó lƠ Hommarsten (1872) chi t tách đ c Chymosin

Wurtz (1879) chi t tách đ c papain, Crassman và Ambros (1926) chi t tách đ c bromelainầ

Theo nghiên cứu của Salem và các cộng sự (1995), việc sử dụng 0.3% enzyme, so với các enzyme khác như papain, trypsin, ficin và bromelain, kết hợp với 25% muối ngay từ đầu quá trình sản xuất nấm mốc trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) cho thấy kết quả đáng chú ý Cụ thể, enzyme papain với nồng độ 0.3% mang lại hàm lượng đạm tối ưu nhất trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men, cao hơn nhiều so với mẫu đối chứng lên men truyền thống chỉ đạt 30%.

Liang và các c ng s (1999) nghiên c u ho t tính c a bromelain sau khi b sung polyphenol trà trích ly t trà xanh c a Trung Qu c cho th y tính b n nhi t c a bromelain đ c t ng lên

Nielsen (2001) nghiên c u c i ti n ph ng pháp xác đ nh m c đ th y phân protein cho k t qu nhanh chóng và chính xác

Stein (2004) s d ng protease n i sinh th y phân n i t ng cá tuy t i Tơy D ng cho hi u su t th y phân khá cao

1.1.2 T ng quan v m t s lo i enzyme proteolytic thu nh n t th c v t có s n trên th tr ng

Các enzym phân giải protein đã được phát hiện ở cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm Cụ thể, các loài cây hai lá mầm như lơ sùng, đu đủ, bông sa và euphorbia, trong khi cây một lá mầm chủ yếu là dừa nước.

Người ta thu hoạch papain từ trái đu đủ xanh bằng cách khía nhẹ vào trái, sau đó tách lấy kết tủa protein ở dạng khô nghiền nhuyễn Bromelin được chiết xuất từ thân dứa, sau khi hái, người ta băm lá và ép thân để lấy dịch chiết chứa enzyme Ficin được tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus Một số thực vật như malt cũng chứa các enzyme truyền thống được sử dụng trong công nghiệp rượu, bia và bánh kẹo Malt chủ yếu chứa amilaza hoạt động, trong khi các enzyme thủy phân khác cũng hoạt động đồng thời.

Enzyme trích ly từ thực vật thuộc nhóm Cystein-protease có trung tâm hoạt động chứa nhóm Sulfhydryl (-SH) của Cystein, kết hợp với vòng imidazol của Histidine và nhóm -COOH của axit Aspactic Sự tương tác giữa các nhóm chức này tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác của enzyme Enzyme này có pH tối ưu khoảng 7, giúp phân giải một số loại protein như hemoglobin, casein, và albumin, đồng thời có khả năng đông tụ tốt Ngược lại, các enzyme protease không chứa nhóm Sulfhydryl (-SH) có pH tối ưu thấp hơn và khả năng đông tụ kém hơn Cả hai nhóm proteinase thực vật đều có khả năng chịu nhiệt, duy trì hoạt động ở nhiệt độ từ 60 đến 70 độ C.

T ng quan v m t s lo i enzyme proteolytic thu nh n t th c v t có s n trên

Proteinase thực vật, đặc biệt là papain và bromelin, đóng vai trò quan trọng trong công nghệ và y tế Chúng được ứng dụng trong ngành công nghiệp thuỷ sản, da giày và sản xuất bia Trong y học, các enzyme này được sử dụng để điều trị rối loạn tiêu hóa liên quan đến protein và hỗ trợ điều trị vết thương bong tróc Hơn nữa, các protease thực vật có khả năng tiêu hóa các loài giun sán ký sinh, giúp cải thiện sức khỏe.

T ng quan v g ng

Vào thế kỷ thứ 4 Công nguyên, gừng đã trở thành một phần quan trọng trong y học cổ truyền Trung Quốc Người Hy Lạp và La Mã cổ đại sử dụng gừng như một loại gia vị và cũng để điều trị các bệnh như táo bón, cảm lạnh, viêm phế quản, và đặc biệt là để trung hòa axit dạ dày.

G ng có tên th ng g i m t s qu c gia là: Ginger [ti ng anh], Jiang [ti ng Trung], Gingembre [ti ng Pháp], Ingwer [ti ng c], Zenzero [ti ng Ý], Shoga [ti ng

Nh t], Gengibre [ti ng B Ơo Nha], Jengibre [ti ng Tây Ban Nha] [4]

Tên khoa h c: Zingiber officinale Roscoe

Hình 1 2 Phân lo i m t s lo i enzyme th c v t [32]

Loài Officinale là một loại thảo mộc sống lâu năm, có hình dáng mảnh mai với thân thẳng đứng và lá màu xanh lục trung bình, xếp thành hai hàng trên mỗi thân Cây thường cao khoảng 1,5 m, với lá rộng khoảng 2 cm và dài 20 cm Loài cây này có thân ngầm dày, phát ra mùi thơm đặc trưng và không có đốt Hoa của cây phát triển thành một cụm dày, cao khoảng 8 cm, nổi bật trên thân khác so với các lá.

Gừng là loài thực vật sống chủ yếu ở các vùng nhiệt đới ẩm, râm mát của miền nam châu Á, nhưng hiện nay loại cây này đã được trồng phổ biến phục vụ mục đích thương mại tại Jamaica, Tây Ấn, Haiti, Trung Quốc và Nigeria Gừng thường được thu hoạch vào khoảng 5 - 6 tháng sau khi trồng Các nhà sản xuất gừng khô chính bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Sierra Leone, Nigeria, Jamaica, Fiji và Australia.

Gừng là một loại gia vị quý, được xem như một thảo dược có giá trị sử dụng đa dạng cho sức khỏe Các bộ phận của gừng thường được sử dụng là rễ và thân rễ Gừng và các chất chiết xuất từ gừng là thành phần phổ biến trong thực phẩm, bao gồm các món ăn, đồ uống, rượu và các sản phẩm bánh mì Các dạng thực phẩm bổ biến từ gừng bao gồm cả tươi, khô, viên nén và viên nang.

Tinh dầu gừng là sản phẩm chiết xuất từ thân rễ gừng, nổi bật với thành phần chính là hydrocacbon sesquiterpene như zingiberene Với hàm lượng 550 mg, tinh dầu gừng không chỉ mang lại hương vị đặc trưng mà còn có nhiều lợi ích cho sức khỏe, làm cho nó trở thành một nguồn cung cấp tinh dầu tự nhiên quý giá.

Gừng là một loại gia vị quý giá với nhiều lợi ích cho sức khỏe Gừng có khả năng chống viêm và kháng khuẩn, giúp cải thiện tiêu hóa và giảm cảm giác buồn nôn Các hợp chất trong gừng, đặc biệt là gingerol, đã được chứng minh là có tác dụng tích cực trong việc tăng cường hệ miễn dịch Dù không có tiêu chuẩn chung, các sản phẩm từ gừng thường được tiêu chuẩn hóa để đảm bảo chất lượng và hiệu quả.

Tinh dầu chứa 1 - 3,5% các hợp chất sau khi chưng cất bằng hơi nước, bao gồm nhiều hydrocacbon sesquiterpene như zingiberene, cùng với một lượng nhỏ hydrocacbon monoterpene và các hợp chất oxy hóa so với gừng khô Thành phần của tinh dầu phụ thuộc vào quy trình chiết xuất, loại gừng và nguồn gốc (khô, tươi) Các hydrocacbon sesquiterpene chính trong dầu gừng bao gồm zingiberene (27 - 30%), curcumene (8-9%), sesquiphellandrene (4,8%) và bisabolene (3,2%).

T ng quan v Ginger rhizome proteolytic enzyme trích ly t c g ng

Các nghiên c u ngoƠi n c

Gừng rhizome chứa enzyme proteolytic, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 60 độ C và nhanh chóng bị phân hủy khi nhiệt độ tăng lên 70 độ C Enzyme proteolytic trong gừng có khả năng phân giải collagen và actomyosin.

Nghiên cứu của Kim và Lee (1995) cùng với Mendiratta và cộng sự (2000) đã chỉ ra rằng các tính chất kháng khuẩn của dược liệu gừng có khả năng chống oxy hóa và làm mềm thịt Gừng cho thấy tác dụng làm mềm thịt, với hàm lượng gừng cao hơn dẫn đến hiệu quả rõ rệt hơn trong việc cải thiện chất lượng thực phẩm Nghiên cứu của Naveena và Mendiratta (2001) đã thử nghiệm chi tiết về tác dụng của gừng đối với thịt.

9 gà mái và nh n th y r ng mi ng th t m m h n khi các m u đ c x lý giai đo n sau làm l nh ( 4 ± 1 trong 24 gi )

Naveena và cộng sự (2004) đã tiến hành một nghiên cứu so sánh hai enzym phân giải protein từ thực vật Cucumis trigonus Roxb (Kachri) và Zingiber officinale Roscoe (Thân rừng) với papain Kết quả cho thấy, các mẫu được xử lý bằng enzym từ Kachri và Thân rừng có độ mềm, ngon và đậm hơn so với các mẫu xử lý bằng papain Tuy nhiên, các mẫu xử lý bằng dịch trích từ Kachri lại có điểm số thấp hơn, trong khi các mẫu xử lý bằng papain và Cucumis có điểm số gần như tương đương nhau.

Tsai et al (2012) revealed that ginger's proteolytic enzymes not only have antioxidant effects but also play a significant role in the degradation of key myofibrillar proteins, including titin, myosin heavy chain, troponin-T, desmin, and alpha-actinin.

Các nghiên c u trong n c

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loại cây hàng gỗ, đặc biệt là gừng trâu Sản phẩm từ gừng trâu được biết đến qua nhiều món ăn hàng ngày, nhưng vẫn còn ít nghiên cứu về enzyme protease trong loại cây này Gừng trâu là nguồn nguyên liệu giàu enzyme, trong đó nổi bật là zingibain Bên cạnh đó, hai loại enzyme từ thực vật đáng chú ý là bromelain và papain, với các nghiên cứu sâu hơn về điều kiện tách chiết protease từ gừng trâu sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong tương lai.

T ng quan v ph ng pháp thu nh n Ginger rhizome proteolytic enzyme

S nh h ng c a dung môi đ n quá trình trích ly Ginger rhizome proteolytic

Nghiên cứu về bromelain và papain đã chỉ ra rằng việc tách chiết protease từ các nguồn này có ý nghĩa khoa học và tiềm năng ứng dụng trong tương lai.

1.4 T ng quan v ph ng pháp thu nh n Ginger rhizome proteolytic enzyme

1.4.1 S nh h ng c a dung môi đ n quá trình trích ly Ginger rhizome proteolytic enzyme pH và s có m t ho c không có các ch t n đ nh đóng m t vai trò quan tr ng trong quá trình chi t xu t protease t thân r g ng Ho t tính c a enzyme cao h n đáng k(p ≤ 0,05) khi chi t xu t pH trung tính so v i pH axit ho c ki m [14] M t s nghiên

10 c u tr c đơy đư s n xu t thành công protease t g ng b ng cách s d ng đ m phosphat pH 7 [15] [5]

Cysteine đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sự ổn định của protease trong quá trình chiết xuất EDTA có khả năng ức chế hoạt động của protease bằng cách che lấp các ion kim loại cần thiết, làm giảm khả năng hoạt động của enzyme thông qua việc tấn công nhóm sulfhydryl của cysteine protease Đồng thời, EDTA cũng giúp bảo vệ enzyme khỏi quá trình oxy hóa trong quá trình chiết xuất Nếu không có các chất ức chế ổn định, hoạt động của protease sẽ suy giảm đáng kể trong suốt quá trình chiết xuất và bảo quản.

Tác đ ng c a sóng siêu ơm đ n quá trình thu nh n Ginger rhizome proteolytic

Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có hiệu quả là rất quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học Để tách biệt các protein trong các cấu trúc tế bào, người ta thường sử dụng các yếu tố vật lý và hóa học như sóng siêu âm và các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat, cùng với chất tẩy rửa (detergent).

Sóng siêu ơm lƠ sóng c h c đ c t o nên t s lan truy n dao đ ng c a các ph n t trong không gian và có t n s l n h n gi i h n trên ng ng nghe c a con ng i (20 ậ

20000 Hz) Do trong tr ng siêu âm, các ph n t dao đ ng cùng ph ng v i ph ng truy n sóng nên sóng siêu âm có b n ch t là sóng d c [18]

Hình 1 3 Các kho n t n s âm thanh

Trong môi trường chất lỏng, sóng siêu âm tạo ra các chu trình kéo và nén liên tục, gây ra hiện tượng xâm thực khí Sự tiếp xúc giữa hai pha lỏng/rắn tạo ra các vortex, tăng cường sự truyền khối trong dòng chảy và khuếch tán.

Sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm sử dụng tần số cao từ 20 đến 100 kHz Các mẫu thực phẩm có độ nhớt cao làm giảm sự lan truyền của các phân tử trong trường siêu âm, dẫn đến việc sóng có năng lượng cao sẽ đi xuyên vào thực phẩm hiệu quả hơn.

Tác đ ng sinh h c c a sóng siêu âm

Sóng siêu âm s d ng trong quá trình trích ly r n - l ng có 3 tác đ ng sinh h c chính lên nguyên li u nh sau:

- Chuy n đ ng c a sóng siêu âm r t nhanh, làm l ng các liên k t trong mô

Sự chuyển động của sóng siêu ơm trong môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, dẫn đến hình thành vùng áp suất chân không Hiện tượng này xảy ra khi áp suất chân không vật lý vượt quá áp suất của chất lỏng.

Hình 1 4 Nguyên lý hình thành và v b t khí

Hình 1.4 minh họa quá trình hình thành, lớn lên và nổ của các bọt khí trong pha lỏng Khi sóng âm tác động lên chất lỏng, nó tạo ra các chu kỳ giãn nở và nén liên tục, dẫn đến sự xuất hiện của bọt khí trong pha lỏng.

- Trong pha giưn: khí bên ngoƠi bong bóng đ c khu ch tán vào bên trong

- Trong pha nén: bong bóng co l i và khí b h p th ng c tr l i

M t khác với các phân tử khí, nó tích tụ vào chất lỏng, làm cho kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kỳ giãn nở và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng có thể nổ, với nhiệt độ lên tới 5000 độ và áp suất đạt 2000 at.

Quá trình truyền nhiệt và truyền khối trong pha lỏng là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến sự tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi Đồng thời, sự khuếch tán các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi cũng góp phần nâng cao hiệu quả trích ly Bên cạnh đó, trong pha lỏng, bọt khí xuất hiện sẽ tạo ra các tia chất lỏng; nếu các tia này hướng đến bọt nguyên liệu rắn, có khả năng tạo ra vật rắn và nguyên liệu mới.

Quá trình siêu âm tạo ra hiện tượng xâm thực khí, làm giảm kích thước nguyên liệu và gia tăng sự tiếp xúc giữa nguyên liệu với dung môi Điều này dẫn đến tăng cường khuếch tán các chất hòa tan, góp phần nâng cao hiệu quả của quá trình trích ly.

Các y u t nh h ng đ n kh n ng hình thƠnh vƠ v bóng

Nhi u y u t nh h ng đ n quá trình và hi u qu trích ly b ng sóng siêu âm Chúng bao g m các thông s liên quan đ n:

- Âm tr ng: t n s sóng ơm, c ng đ âm, m t đ n ng l ng âm, ầ

- Nguyên li u thô: c u trúc, m c phá v , lo i và s l ng các ch t trích ly

- c tính v t lỦ dung môi c ng nh đi u ki n kh o sát các y u t : th i gian, nhi t đ , áp su t ng d ng c a sóng siêu âm trong ngành công ngh th c ph m

Siêu âm hiện nay đang là lĩnh vực được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghiệp thực phẩm Sóng siêu âm với tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Hai lĩnh vực chính được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm là

- T n s cao vƠ n ng l ng th p: Siêu âm chu n đoán Trong kho ng t n s MHz

Phân tích độ bền và quy trình điều khiển, kiểm tra là rất quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc thực phẩm Điều này giúp xác định tính chất thực phẩm, đo đạc dòng chảy và bao gói thực phẩm một cách hiệu quả.

Tính năng siêu ơm n ng l ng cao trong quy trình hỗ trợ hàng loạt các lĩnh vực như kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đông hóa, làm mát thực tế, quá trình oxi hóa và tiệt trùng mang lại hiệu quả vượt trội.

T ng quan v ph ng pháp tinh s ch Ginger rhizome proteolytic enzyme

Ph ng pháp k t t a

Sau khi nhận được dịch chiết từ enzyme thô, nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tinh chế enzyme Kết quả là một kỹ thuật tinh chế protein được sử dụng để cô đặc và tinh chế protein Quá trình này bao gồm việc tách protein khỏi dung dịch và thu nhận dưới dạng chất rắn bằng cách thay đổi độ hòa tan của dung dịch Thông thường, quá trình tinh chế này không tốn kém và áp dụng được trên quy mô lớn Có một số phương pháp hoặc hệ thống thực hiện quá trình tinh chế, nhưng việc xác định phương pháp nào phù hợp nhất để đạt được các mục đích mong muốn sau quá trình là rất quan trọng.

Trong các phương pháp truyền thống, phương pháp kết tủa bao gồm nhiều tác nhân khác nhau như dung môi hữu cơ, muối trung tính, polymer, chất đa điền phân, kết tủa tại điểm đẳng điện và kết tủa bằng ion kim loại Nhóm phương pháp này có đặc điểm là dễ thực hiện, sử dụng tác nhân tạo kết, và có tính khả thi cao.

Sử dụng dung môi hữu cơ là một phần quan trọng trong nhiều quy trình sản xuất Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có khả năng làm biến tính protein ngay cả ở nhiệt độ thấp Do đó, quá trình tách protein bằng dung môi hữu cơ cần được thực hiện ở nhiệt độ thích hợp từ 0-5 độ C và lựa chọn dung môi phù hợp để đảm bảo hiệu quả.

Các dung môi như methanol, ethanol và n-butanol đã được nghiên cứu để tách whey protein và sữa khô thu protein concentrate Ethanol được xem là dung môi an toàn hơn so với hai dung môi còn lại Trong khi đó, methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan hơn so với khi sử dụng ethanol Đặc biệt, n-butanol chứa nhiều béo và lactose, dẫn đến khả năng hòa tan kém trong nước.

Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein bao gồm cấu trúc, kích thước, diện tích bề mặt và dung môi Sau khi protein được kết tủa, nó có thể được tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm hoặc lọc Tiếp theo, kết tủa có thể hòa tan trở lại trong một thể tích nhỏ hơn của dung dịch cô đặc hoặc loãng và phân giải trong một dung dịch khác khi điều kiện dung dịch thay đổi.

Ph ng pháp th m tích qua màng cellophane

Thẩm tích là quá trình khuếch tán của các phân tử có nồng độ cao đến nồng độ thấp thông qua một màng bán thấm Quá trình này không áp dụng cho những chất keo hòa tan như protein và một số polysaccharide, nhưng có thể diễn ra với các dung dịch của các tinh thể.

Khi đạt trạng thái cân bằng, các phân tử di chuyển ra và vào màng tế bào với tần suất đều đặn Ngược lại, các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ không thể đi qua màng bán thấm, dẫn đến sự tích lũy ở một phía Điều này có nghĩa là nồng độ của các phân tử này không có sự thay đổi giữa hai bên màng Khi thay dung dịch, thẩm thấu bên ngoài màng bán thấm sẽ tạo ra một gradient nồng độ mới.

Trong quá trình tách chi t và tinh s ch protein, đ lo i b mu i ra kh i dung d ch protein, thường sử dụng dung dch protein vào các túi đ c hi u làm b ng nguyên li u bán th m như màng cellophane Protein là nh ng đ i phân t không th v t qua túi th m tích vƠ đ c gi l i trong túi B ng cách thay đ i th ng xuyên dung d ch r a, có th t y s ch mu i ra kh i protein Có th t ng t c đ th m tích khi khu y dung d ch r a b ng máy khu y c h c hay máy khu y t ho c là quay ch m túi nh dao đ ng c không l n.

1.5.2.2 Các y u t nh h ng đ n quá trình th m tích

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm thấu gồm: thành phần và sự thay đổi nồng độ dung dịch ngoài màng bán thấm, thời gian, nhiệt độ thẩm thấu và kích thước các phân tử so với kích thước lỗ màng Các phân tử có kích thước nhỏ hơn màng thường thẩm thấu nhanh hơn, dẫn đến sự cân bằng nồng độ giữa các phân tử có kích thước lớn hơn và kích thước lỗ màng Màng cellophane, được sử dụng trong thí nghiệm, có cấu trúc lỗ rỗng, cho phép các phân tử nhỏ thẩm thấu qua dễ dàng.

Trong quá trình th m tích, các phân t đi qua mƠng bán th m vƠ đ t tr ng thái cân b ng riêng, đ c l p v i các ch t khác d n đ n m u có th b pha loãng [23] Khi th m tích

Trong nghiên cứu, 15 loại protein được bảo quản ở nhiệt độ 4-5 độ C trong khoảng 6-8 giờ, với thể tích dung dịch ngoài màng bán thấm từ 200-500 ml Một số phân tử có khả năng bám lên màng bán thấm, trong đó sự bám dính này không đáng kể với nồng độ dưới 0,5 mg/ml, nhưng có sự khác biệt rõ rệt so với nồng độ dưới 0,1 mg/ml Có thể bổ sung chất mang vào mẫu dung dịch nhằm tăng cường sự bám dính của protein lên màng.

T ng quan v ph ng pháp đi n di đ ng trên gel poly-acrylamide (PAGE)

Nguyên t c

SDS-PAGE (điện di gel polyacrylamide sử dụng sodium dodecyl sulfate) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide, trong đó SDS hoạt động như một tác nhân làm biến tính protein Trong phương pháp này, protein được xử lý với SDS và tác nhân khử disulfide như mercaptoethanol, khiến chúng bị biến đổi từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tích điện âm Do đó, sự di chuyển của các phân tử protein trong gel phụ thuộc vào kích thước, với các phân tử lớn di chuyển chậm hơn so với các phân tử nhỏ khi đi qua gel Để xác định khối lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn, bao gồm các protein có khối lượng khác nhau.

Cho 20 µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng Thực hiện điện di với dòng điện có hiệu điện thế 100V Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự di chuyển của chất màu xanh bromophenol khi cách đáy gel không quá 1 cm.

Sau khi tiến hành điện di, gel được nhuộm với dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 30 phút Tiếp theo, gel được ngâm trong dung dịch giải màu (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước) để phát hiện protein Kết quả là protein sẽ xuất hiện dưới dạng các vết màu xanh lam trên bề mặt gel.

Xác đ nh tr ng l ng phân t c a protein

o kho ng cách di chuy n c a các b ng protein t gel phân tách t i các b ng protein và kho ng cách t gel phân tách t i v ch màu bromophenol (v ch màu cu i cùng)

Việc xác định các vạch protein có thể thực hiện thông qua giá trị Rf, sử dụng phương pháp nội suy theo độ dày Dựa vào thang chuẩn trên gel di chuyển, chúng ta tiến hành đánh giá giá trị Rf của từng vạch protein.

Phân tích tính ch t c a ch ph m enzyme

Khám phá vai trò của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính của chúng là rất quan trọng Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng protein trong dung dịch, tùy thuộc vào cấu trúc và số lượng amino acid có trong protein Do sự khác biệt về thành phần amino acid giữa các loại protein, kết quả phân tích có thể biến đổi đáng kể.

Phương pháp Biuret là một kỹ thuật xác định protein dựa trên sự hình thành màu sắc khi protein chứa ít nhất hai liên kết peptide phản ứng với CuSO4 Sự liên kết này xảy ra nhờ vào các liên kết coordinate giữa nguyên tử nitơ trong liên kết peptide và ion Cu²⁺ Kỹ thuật này cho phép đo lường nồng độ protein trong mẫu một cách chính xác.

Peptide và protein có khả năng tạo màu khi phản ứng với biuret ở bước sóng 540 nm Một số tác nhân gây cản trở như đệm chuẩn bậc amino acid, đệm Good’s và đệm Tris Phương pháp biuret có ưu điểm là cho kết quả định lượng ổn định với các loại protein khác nhau và dễ dàng thực hiện Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy kém, chỉ phát hiện được nồng độ protein từ 1 mg trở lên.

Phương pháp Lowry là một kỹ thuật phân tích protein hiệu quả hơn so với phương pháp Biuret, nhờ vào việc bổ sung chất Folin-Ciocalteu, tạo ra phản ứng tạo màu xanh đậm trong dung dịch Sự phát triển màu sắc này là kết quả của quá trình tương tác giữa protein và các hóa chất trong phương pháp, giúp xác định nồng độ protein một cách chính xác hơn.

- Liên k t càng cua gi a N t o liên k t peptide v i Cu+2

- S kh ch t Folin-ciocalten do tyrosine và tryptophan trong phân t protein t o ra

Phương pháp biuret cho phép xác định nồng độ protein với độ nhạy cao hơn 100 lần, nhưng kết quả phụ thuộc vào các yếu tố như nồng độ của Good's, (NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan Ngoài ra, hàm lượng tyrosine và tryptophan trong protein có sự khác biệt, dẫn đến kết quả không nhất quán Để khắc phục các vấn đề liên quan đến quy trình này, phương pháp Bradford có thể được áp dụng, giúp xử lý mẫu một cách dễ dàng và hiệu quả Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, tạo ra hai dạng màu khác nhau, với Coomassie Brilliant Blue G-250 thể hiện màu đỏ và xanh lam khi tương tác với protein.

CH NG 2: V T LI U VĨ PH NG PH́P NGHIÊN C U

Nguyên v t li u

G ng

C g ng t i đ c mua t h th ng siêu th Sài Gòn Co op thu c gi ng g ng trâu ậ

Gừng (Zingiber officinale Rosc) là loại cây được trồng phổ biến tại Việt Nam Gừng thường được thu hoạch trong khoảng thời gian từ 9 đến 12 tháng tuổi, với trọng lượng từ 200g đến 500g tùy theo từng cây Sau khi mua, gừng nên được sử dụng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh và để ở nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp để giữ được độ tươi ngon.

G ng khi s d ng làm thí nghi m s đ c r a s ch, đ ráo và g t v

Hóa ch t trong nghiên c u

The study utilizes various chemical compounds, including Folin-Ciocalteu's phenol, casein, hydrochloric acid (HCl), and ethanol, alongside sodium phosphate buffers such as Na2HPO4.12H2O and NaH2PO4.7H2O Additionally, trichloroacetic acid (TCA), sodium hydroxide (NaOH), cysteine, tyrosine, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and dithiothreitol (DTT) are employed The experiment is conducted at a Tris-HCl buffer with a pH of 6.8, using a 30% acrylamide solution, a 10% SDS solution, along with 10% ammonium persulfate (APS) and TEMED for polymerization.

D ng c và thi t b

D ng c

Bình đnh m c 50ml, 100ml, 1000ml; erlen 250ml; micropipet (20 ậ200 l, 100 - 1000 l,

1 ậ 5 ml), ph u th y tinh, đ a th y tinh, nhi t k , thau, r , dao, th t, bình hút chân không, ng nghi m, cuvet.

Thi t b

Thi t b khu y t , pH k , máy quang ph UV-VIS, máy ly tơm, cơn đi n t 2 và 4 s l , t đông, t mát, máy siêu âm, t s y, ầ

Ph ng pháp nghiên c u

S đ nghiên c u

Phân tích thành ph n c a c g ng t i

Trích ly protease b ng môi tr ng n c

- Th i gian trích ly (30-150 phút; 30 phút)

Trích ly protease b ng môi tr ng n c k t h p siêu âm

- HƠm l ng protein t ng (mg/g ch t khô c a nguyên li u)

- Ho t tính ginger rhizome proteolytic enzyme (UI/g ch t khô c a nguyên li u)

Ki m tra ch t l ng ch ph m enzym

- Phân t l ng b ng s c kỦ đi n di SDS Page

- Nhi t đ và pH ho t đ ng thích h p

Thu nh n protease b ng ph ng pháp k t t a b i ethanol và th m tích qua màng cellophan có

- HƠm l ng ethanol trong dung môi

Quy trình thí nghi m

Thuy t minh quy trình

M c đích: m b o đ ng nh t ch t l ng enzyme t o ra s d ng cho m i thí nghi m

Thành phần của sản phẩm phải còn nguyên vẹn, lành lặn, không bị hư hỏng hay phân hủy do tác động của môi trường Sản phẩm không có mùi hay vị lạ, có cấu trúc chắc chắn, không bị trầy xước, và được bảo quản trong điều kiện khô ráo Khi thu hoạch, sản phẩm cần phải được làm khô hoàn toàn và không có tạp chất nhìn thấy bằng mắt thường.

G ng sau khi mua v đ c s d ng ngay ho c dùng d n trong tu n và b o qu n n i thoáng mát, tránh ánh n ng tr c ti p

M c đích: Lo i s ch đ t cát, b i b n, h n ch làm nhi m t p ch t vào dung d ch trích ly

Th c hi n: G ng khi s d ng làm thí nghi m s đ c r a s ch, đ ráo và g t v

M c đích: Gi m kích th c vƠ lƠm đ ng đ u kích th c nguyên li u, h tr quá trình nghi n

Th c hi n: G ng sau khi đ ráo và g t v s đ c c t nh ra thành t ng lát nh v i kích th c đ dày x r ng x cao t ng đ ng 1 x 2 x 2 (mm).

M c đích: Gi m kích th c nguyên li u, t ng di n tích ti p xúc gi a dung môi v i nguyên li u, trích ly m t ph n enzyme có trong nguyên li u

Th c hi n: L y 15g g ng t i đư g t v cho vào máy xay sinh t cùng v i m t l ng dung môi bao g m đ m phosphat (pH 7,0), EDTA (pH 7,0) vƠ cystein xay đ u trong vòng

1 phút 30 giây (30 giây xay ậ ngh 30 giây)

Mục đích của quá trình tách chi t là sử dụng sóng siêu âm để đẩy nhanh việc giải phóng các protein và polyphenol từ tế bào và nhu mô thông qua hiệu ứng xâm thực (cavitation).

Th c hi n: S d ng thi t b siêu âm d ng đ u dò Các đi u ki n kh o sát: nhi t đ , công su t, th i gian siêu âm

M c đích: T o dòng l u ch t chuy n đ ng liên t c đ dung môi ti p xúc đ c v i nguyên li u

Th c hi n: Nguyên li u sau khi đ c đ ng hóa v i kích th c nh ti p t c đ c khu y đ o v i cá t m c 5 trên thi t b khu y t

M c đích: Lo i b bã g ng lƠ các x không tan.

Th c hi n: Dùng gi y l c Whatman cho vào thi t b l c chân không, ti n hành l c l y d ch trích và b bã Dch trích sau đó đ c đ a đi lƠm l nh đ h nhi t đ xu ng 4

M c đích: Tách m t ph n tinh b t và bã không tan còn sót l i c a quá trình l c thô

Th c hi n: Dch trích sau khi đ c làm l nh 4 s đ c cho vào ng ly tâm (50ml) quay ly tâm 5000 vòng trong 30 phút

M c đích: B c đ u thu nh n và tinh s ch ginger rhizome proteolytic enzyme

Thí nghiệm sử dụng dung môi ethanol với các nồng độ khác nhau được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 0-5 độ C nhằm tối ưu hóa quá trình kết tủa Các yếu tố quan trọng cần kiểm soát bao gồm: hàm lượng ethanol, tỷ lệ ethanol và dung dịch trích, cùng với thời gian kết tủa.

M c đích: Lo i b ph n d ch l ng đ thu nh n ph n ginger rhizome proteolytic enzyme k t t a

Th c hi n: Cho d ch l ng vào ng ly tâm (50ml) quay ly tâm 3600 vòng trong 30 phút

Mục đích của nghiên cứu này là tổng hợp tinh chất từ củ gừng, cụ thể là enzyme proteolytic, với các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa, bao gồm amino acid, khoáng chất và muối, có mặt trong cả phần rễ và phần ngoài của củ gừng.

Th c hi n: S d ng màn th m tích cellophane, kích th c 35mm Cho m u vào túi cellophane và hòa loãng v i đ m phosphat (pH 7,0), đ t túi vào trong c c n c c t vƠ đ t lên thi t b khu y t trong 24 gi nhi t đ 3 -5

Ph ng pháp b trí thí nghi m

2.3.4.1 Kh o sát nh h ng c a các y u t đ n quá trình trích ly enzyme tr c khi có s h tr c a siêu âm

 Thí nghi m 1: Kh o sát t l dung môi: nguyên li u đ n hi u su t trích ly

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

 Thí nghi m 2: Kh o sát nh h ng c a th i gian khu y đ o đ n hi u su t trích ly Các y u t c đnh:

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- T l nguyên li u: đ m: theo k t qu thí nghi m 1

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t (phút): 0; 10; 20; 30; 40

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

 Thí nghi m 3: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ khu y đ o đ n hi u su t trích ly

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 30 phút

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí ngi m 2

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

2.3.4.2 Kh o sát nh h ng c a các y u t đ n quá trình trích ly enzyme khi có s h tr c a siêu âm

 Thí nghi m 4: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ siêu ơm đ n hi u su t quá trình trích ly

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Th i gian siêu âm (phút): 5

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2

- Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

 Thí nghi m 5: Kh o sát nh h ng c a công su t siêu ơm đ n hi u su t quá trình trích ly

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4

- Th i gian siêu âm (phút): 5

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2

- Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

 Thí nghi m 6: Kh o sát nh h ng c a th i gian siêu ơm đ n hi u su t quá trình trích ly

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4

- Công su t siêu âm: theo thí nghi m 5

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2

- Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Th i gian siêu âm (phút): 0; 5; 10; 15; 20

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

2.3.4.3 Kh o sát nh h ng c a dung môi đ n quá trình k t t a protein

 Thí nghi m 7: Kh o sát nh h ng c a n ng đ c n đ n hi u su t quá trình k t t a protein

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây, ngh 30 giây gi a m i 30 giây đ ng hóa

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4

- Công su t siêu âm: theo thí nghi m 5

- Th i gian siêu âm: theo thí nghi m 6

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2

- Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

 Thí nghi m 8: Kh o sát nh h ng c a th i gian k t t a đ n hi u su t quá trình k t t a

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1

- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4

- Công su t siêu âm: theo thí nghi m 5

- Th i gian siêu âm: theo thí nghi m 6

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2

- Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3

- Th i gian ly tâm: 20 phút

- T l d ch trích: c n: theo thí nghi m 8

- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme

Ho t tính enzyme Ginger proteolytic đ c xác đ nh b ng ph ng pháp Anson c i ti n

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym ginger proteolytic, sau đó vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic (TCA) Nhờ vào phản ứng thủy phân, các sản phẩm được tạo thành sẽ có màu với thuốc thử Folin Đặc biệt, hàm lượng sản phẩm được xác định dựa trên tiêu chuẩn của Tyrosin, cho thấy mức độ sản phẩm do enzym xúc tác tạo ra.

Mức độ enzym Anson có khả năng phân hủy casein trong điều kiện thí nghiệm 35,5 độ C và pH 7,6, tạo ra sản phẩm hòa tan trong TCA chỉ trong 1 phút Phản ứng với thuốc thử Folin cho phép xác định nồng độ Tyrosin thông qua việc đo OD tại bước sóng 660nm, tương ứng với 1 µM Tyrosin trong dung dịch chuẩn.

Hoạt động của protease được xác định thông qua các yếu tố như thể tích hỗn hợp trong quá trình thí nghiệm (ml), thể tích dịch lỏng thu được (ml), thời gian thí nghiệm (phút) và khối lượng mẫu enzym được sử dụng để xác định hoạt tính (g).

L: đ pha loãng enzym àM Tyrosin: l ng àM Tyrosin trong v (ml) suy ra t đ ng chu n

2.3.4.4 Kh o sát ph m vi ho t đ ng c a enzyme Ginger proteolytic

 Xác đnh nhi t đ ho t đ ng t i u c a enzyme

Cho 0,1mL dch trích vƠo 0,6mL đ m phosphate (pH 7,0) 100mM và 1,0mL dung dch casein 1%, sau đó h n h p trên l n l t 4, 7, 10, 30, 40, 50, 60, 70 và 80 o C trong

20 phút trong b n c vƠ đo ho t tính b ng ph ng pháp Anson c i ti n

Để xác định pH tối ưu của enzyme, cần chuẩn bị các dung dịch đệm với pH khác nhau: dung dịch citrate 100mM điều chỉnh pH 5,5; dung dịch potassium phosphate 100mM điều chỉnh pH 6,0, 6,5 và 7,0; dung dịch tris-HCl 100mM điều chỉnh pH 7,5 và 8,0 Trong quá trình thí nghiệm, sử dụng dung dịch casein 1% ở 60 độ C trong 20 phút và đo hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson.

2.3.4.5 nh tính vƠ đ nh l ng enzyme proteolytic b ng ph ngpháp đi n di đ ng trên gel poly-acrylamide (PAGE)

SDS-PAGE là một kỹ thuật phân tách các protein trên gel polyacrylamide bằng cách sử dụng SDS, giúp làm biến tính và tích điện cho các phân tử Phương pháp này cho phép xác định trọng lượng phân tử protein, thành phần và đặc tính chất của protein trong quá trình tinh chế.

Trong quá trình tách protein, việc sử dụng chất tẩy SDS kết hợp với các tác nhân khử như mercaptoethanol hoặc DDT giúp làm giảm cấu trúc bậc 2, 3, 4 của protein thành bậc 1, tạo điều kiện cho protein di chuyển trong gel Khi di chuyển, các phân tử protein sẽ bị ảnh hưởng bởi kích thước của chúng: những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn so với những phân tử nhỏ hơn.

Ph ng pháp x lý s li u

T t c các thí nghi m đ c th c hi n l p l i ít nh t 3 l n D li u đ c phân tích ph ng sai (ANOVA) nh m ki m đ nh đ tin c y v i m c Ủ ngh a 5% đ đánh giá s khác bi t, s d ng ph n m m Minitab Statistical.

Các ph ng pháp phơn tích

- Xác đ nh hƠm l ng protein t ng b ng ph ng pháp Bradford

- Xác đnh ho t đ enzyme b ng ph ng pháp c a Anson c i ti n

- Xác đ nh hƠm l ng nit t ng (AOAC 2000)

- Xác đ nh hƠm l ng béo b ng ph ng pháp Soxhlet (AOAC 2000).

- Xác đnh m, hƠm l ng tro (AOAC 2000)

CH NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N

Thành ph n c b n c a c g ng

C g ng sau khi r a s ch, đ ráo r i đem phơn tích v thành ph n hóa h c c b n:

B ng 3 1 Thành ph n hóa h c trong c g ng t i

Tên ch tiêu HƠm l ng (%) m 85,85

Kết quả phân tích nguyên liệu nghiên cứu cho thấy hàm lượng dinh dưỡng có 85,85% chất khô và 14,15% độ ẩm, với 1,09% protein, 0,35% lipid, 0,71% tro và 12,0% carbohydrate Tính theo chất khô, hàm lượng protein trong nguyên liệu chiếm 7,7%.

K t qu này cho th y đi m t ng đ ng v i k t qu phân tích c a Srinivasan và c ng s (2017) v i 60-70% carbohydrates; 3-8% x thô; 9% protein; 8% tro; 3-6% lipid

Sự khác biệt giữa các hợp chất trong cộng đồng có thể xuất phát từ nhiều yếu tố như giá cả, giống cây trồng, thời gian thu hoạch, thời tiết, khí hậu và một số yếu tố khách quan khác.

nh h ng c a các y u t đ n quá trình trích ly enzyme protease tr c khi có s

nh h ng c a t l dung môi: nguyên li u

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 1 nh h ng c a t l dung môi: nguyên li u

Giá trị biểu diễn là trung bình lặp lại của 3 lần lấy mẫu, với các chỉ số thống kê được xác định chuẩn Các giá trị nghiệm thu có thể có các ký tự giống nhau, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt được đánh giá dựa trên phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

T l nguyên li u: đ mPro t ng Hp

Nghiên cứu cho thấy rằng khi tỉ lệ nguyên liệu ẩm là 1/5, nồng độ protein đạt 24,76 ± 0,06 mg/g chất khô và hoạt động enzyme đạt 127,47 ± 1,48 UI/g chất khô Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỉ lệ nguyên liệu ẩm lên 1/8, nồng độ protein và hoạt động enzyme giảm xuống so với các tỉ lệ 1/6 và 1/7, với giá trị lần lượt là 24,21 ± 0,13 mg/g chất khô và 24,08 ± 0,13 UI/g chất khô; 22,16 ± 0,27 mg/g chất khô và 126,82 ± 0,97 UI/g chất khô; 118,75 ± 2,24 mg/g chất khô và 73,90 ± 0,56 UI/g chất khô.

Hiệu suất trích ly phụ thuộc vào tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi Khi tỉ lệ này được điều chỉnh hợp lý, sự chênh lệch gradient nồng độ giữa nguyên liệu và dung môi sẽ tối ưu hóa quá trình trích ly Tuy nhiên, việc sử dụng dung môi quá nhiều có thể dẫn đến việc làm loãng dịch trích, gây ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu suất Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỉ lệ tối ưu giữa nguyên liệu và dung môi để đạt hiệu suất trích ly protein và hoạt động protein cao nhất là 1:5.

Thí nghiệm xác định tỉ lệ thích hợp giữa dung dịch đệm và nguyên liệu trong quá trình đông hóa diễn ra hiệu quả nhất với tỉ lệ 1:5 trong thời gian 1 phút 30 giây Do đó, chúng tôi quyết định chọn giá trị này để tiếp tục quy trình.

nh h ng c a th i gian khu y đ o

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 2 nh h ng c a th i gian khu y đ o

Giá trị trung bình được biểu diễn là trung bình lặp lại trong 3 lần lặp lại với 2 chất thử phân tích chuẩn Tuy nhiên, giá trị nghiệm thức có thể có các ký tự giống nhau mà không có sự khác biệt ý nghĩa với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt được đánh giá dựa vào phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Khi không sử dụng máy khuấy, hàm lượng protein và hoạt động enzyme trong nguyên liệu lần lượt là 21,65 ± 0,10 mg/g và 66,15 ± 1,48 UI/g chất khô Tuy nhiên, khi sử dụng máy khuấy, hai giá trị này tăng lên đáng kể, đạt mức cao nhất là 27,25 ± 0,06 mg/g và 194,59 ± 0,97 UI/g sau 30 phút khuấy Nếu tiếp tục khuấy thêm 10 phút, hai giá trị này sẽ giảm xuống còn 25,99 ± 0,04 mg/g và 149,73 ± 2,44 UI/g.

0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút

Th i gian (phút)Pro t ng Hp

Khu vực y đò giúp các cụm trong hành hình hợp chất lượng chuyển động hơn lớn, tăng khả năng tiếp xúc giữa các cụm cần trích ly với dung môi, làm tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên, nếu khu y đò trong một thời gian dài có sự tiếp xúc với không khí và các kim loại nặng, nguyên liệu có thể tạo ra các phản ứng không mong muốn do phân tách protein và pectin, dẫn đến hình thành khí lẫn bẩn trên bề mặt.

Thời gian khuấy động thích hợp cho quá trình trích ly đạt hiệu quả là 30 phút Chúng tôi quyết định chọn thời gian khuấy động này cho các thí nghiệm tiếp theo.

nh h ng c a nhi t đ khu y đ o

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 3 nh h ng c a nhi t đ khu y đ o

Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình lập lại 3 lần với 2 chất thử phân lập chuẩn Các giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa với mức Ủ nghĩa p< 0,05 Sự khác biệt được đánh giá dựa vào phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ được điều chỉnh từ 30 lên 40 độ C, hàm lượng protein và hoạt động enzyme tăng lên đáng kể, đạt mức 2,11 mg/g chất khô và 0,09 UI/g chất khô Tuy nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 40 lên 70 độ C, cả hàm lượng protein và hoạt động enzyme đều có xu hướng giảm, với giá trị thấp nhất ghi nhận là 27,80 mg/g chất khô và 218,79 UI/g chất khô sau 30 phút ở 70 độ C.

Khi nhiệt độ được nâng lên cao, sự giãn nở của các cấu trúc protein diễn ra, dẫn đến quá trình trích ly hiệu quả hơn Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, protein sẽ bị thoái hóa và hoạt động của enzym cũng giảm theo Kết quả này cho thấy tầm quan trọng của việc kiểm soát nhiệt độ trong quá trình trích ly.

1.3, hi u su t trích ly protein và ho t đ protein thu đ c cao nh t khi nhi t đ khu y đ o trong quá trình trích ly đ t 40

Chúng tôi đã xác định chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly DNA thông qua điều kiện 3.3, nhằm đảm bảo không làm ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, với nhiệt độ tối ưu là 40 độ C.

nh h ng c a các y u t đ n quá trình trích ly protease khi có s h tr c a siêu âm

nh h ng c a nhi t đ siêu âm

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian siêu âm (phút): 5

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 4 nh h ng c a nhi t đ siêu âm

Giá trị trung bình biểu diễn là trung bình lặp lại trong 3 lần, với 2 chất thí nghiệm được đánh giá Các giá trị nghiêm ngặt có ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt được đánh giá dựa trên phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Khi nhiệt độ tăng từ 20 lên 40 độ C, nồng độ protein và hoạt động enzyme đạt giá trị cao nhất lần lượt là 31,95 ± 0,29 mg/g và 282,72 ± 3,66 UI/g chất khô của nguyên liệu Tuy nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên 60 độ C, hai giá trị này giảm xuống còn 0,45 mg/g và 30,334 UI/g chất khô của nguyên liệu.

Nhiệt độ cao làm gia tăng áp suất khí bên trong nội bào, dẫn đến việc xâm thực khí vào cấu trúc tế bào Sự gia tăng nhiệt độ làm giảm độ bền của liên kết xenlullose, tạo ra nhiều bong bóng khí hơn.

20 ºC 30 ºC 40 ºC 50 ºC 60 ºC

Xâm thực khí diễn ra nhanh chóng, tuy nhiên, nếu công tăng nhiệt độ và áp suất xâm thực của bọt khí càng cao, sẽ gặp khó khăn trong việc cấu trúc bọt khí Điều này có thể dẫn đến thoái hóa protein do đứt gãy các liên kết, làm cho cấu trúc protein chuyển sang các bậc 1, bậc 2.

Thí nghiệm đã xác định được nhiệt độ siêu âm 40 cho hơm lắng protein và hoạt động cao nhất mặc dù 50 có ghi nhận sự gia tăng của hơm lắng protein và hoạt động protein Tuy nhiên, sự gia tăng này không có ý nghĩa về mặt thống kê Do đó, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ siêu âm 40 để tiếp tục các khảo sát tiếp theo.

nh h ng c a công su t siêu âm

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian siêu âm (phút): 5 phút

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 5 nh h ng c a công su t siêu âm

Giá trị trung bình được biểu diễn là trung bình lặp lại trong 3 lần với 2 chất thử phân tích chuẩn Tuy nhiên, giá trị nghiệm thực tế có thể có các ký tự giống nhau mà không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt có ý nghĩa được đánh giá dựa trên phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Khi siêu âm với công suất 25W/g, hàm lượng protein và hoạt động enzyme đạt giá trị cao nhất lần lượt là 35,70 ± 0,27 mg/g và 441,78 ± 5,9 UI/g trên chất khô của nguyên liệu.

Nguyên nhân gây ra sóng siêu âm có thể liên quan đến việc truyền năng lượng vào lòng chất lỏng, dẫn đến sự kích thích mạnh mẽ và hình thành các vortex Sóng siêu âm làm giảm ranh giới giữa các pha, từ đó tăng cường khả năng truyền khối và thúc đẩy sự khuếch tán mạnh mẽ trong môi trường mà khuynh hướng thông thường không đạt được.

41 đ c [29] D i tác d ng c a sóng siêu ơm cƠng t ng, các b t khí b kéo nén, s t ng áp su t và nhi t đ làm các b t khí b v , lƠm t ng s thoát ra c a các n i bào trong dung d ch

Công suất siêu âm cao làm tăng cường hiệu ứng xâm thực khí, dẫn đến việc cấu trúc tế bào bị phá vỡ nhiều hơn, từ đó nâng cao hiệu quả trích ly chất chiết xuất Tuy nhiên, protein là chất không bền nhiệt, vì vậy nếu công suất siêu âm quá cao, nhiệt độ tăng lên có thể làm biến tính protein, dẫn đến giảm hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch.

Chúng tôi quy t đ nh ch n công su t siêu âm m c 25W đ th c hi n nh ng thí nghi m ti p theo.

nh h ng c a th i gian siêu âm

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 6 nh h ng c a th i gian siêu âm

Giá trị trung bình biểu diễn là mức trung bình của ba lần lặp lại cho các chỉ số thống kê đã được chuẩn hóa Tuy nhiên, giá trị nghiệm thu có thể có các ký tự giống nhau mà không có sự khác biệt ý nghĩa với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt có ý nghĩa được đánh giá dựa trên phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Khi thời gian siêu âm tăng lên 10 phút, nồng độ protein và hoạt tính enzyme (tính theo chất khô) lần lượt đạt 38,93 ± 0,06 mg/g và 494,05 ± 1,48 UI/g, với mức tăng 1,1 lần Tuy nhiên, khi thời gian siêu âm kéo dài lên 20 phút, nồng độ protein và hoạt tính enzyme giảm xuống còn 31,82 ± 0,07 mg/g và 381,43 ± 2,56 UI/g, tương ứng với mức giảm 1,2 lần so với giá trị ở 10 phút.

Trong quá trình trích ly bằng siêu âm, các chất hòa tan tiếp xúc với dung môi, dẫn đến hiệu suất trích ly tăng cao nhờ thời gian tương tác dài giữa hai pha.

Thời gian siêu âm kéo dài sẽ làm tăng độ biến đổi của nguyên liệu do tác động của sóng siêu âm, nhưng nếu thời gian quá dài sẽ dẫn đến phân hủy các phân tử protein Điều này có thể gây ra sự trích ly các hợp chất không mong muốn như pectin và hydratcarbon, làm giảm hiệu quả của quá trình chiết xuất protein.

Trong quá trình xử lý siêu âm, thời gian tác động kéo dài giúp tăng cường hiệu suất trích ly protein từ nguyên liệu cồng kềnh nhờ vào việc dung môi khuếch tán vào bên trong nguyên liệu Tuy nhiên, nếu thời gian siêu âm quá lâu, có thể dẫn đến sự phân hủy protein, làm giảm khả năng hòa tan trong ethanol và gây thất thoát sản phẩm.

T đ th trên cho th y, th i gian siêu âm 10 phút là v a đ đ quá trình trích ly đ c di n ra t i u mƠ không lƠm th t thoát hay bi n tính protein và enzyme.

nh h ng c a dung môi đ n quá trình k t t a protein

nh h ng c a hƠm l ng ethanol (%(v/v))

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian siêu âm: 10 phút

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 7 nh h ng c a hàm l ng ethanol (% (v/v))

Giá trị trung bình biểu diễn là trung bình lặp lại 3 lần trong 2 chất thử phân định chuẩn Tuy nhiên, giá trị nghiệm thực có thể có các ký tự giống nhau mà không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt đáng kể được xác định thông qua phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Theo k t qu thu đ c t đ th hình 3.8 cho th y n ng đ protein t ng và hàm l ng protein t ng khi t ng n ng đ c n c th lƠ khi t ng n ng đ c n t 50 (% (v/v)) lên

Khi nồng độ ethanol đạt 80% (v/v), giá trị protein và hoạt động enzyme lần lượt là 1 và 1,5 lần, với giá trị cao nhất đạt 138,80 mg/g chất khô của nguyên liệu và 1110,09 UI/g chất khô của nguyên liệu Tuy nhiên, khi nồng độ ethanol tăng lên 90% (v/v), nồng độ protein và hoạt động enzyme có sự biến đổi đáng kể mà không có ý nghĩa thống kê.

Khi hƠm l ng ethanol t ng thì ho t tính enzyme sau t a c ng t ng, nh ng khi hƠm l ng ethanol v t quá cao thì ho t tính l i gi m

Khi nồng độ ethanol quá cao, lực căng bề mặt tăng lên, dẫn đến việc các phân tử enzyme bị biến tính, không còn hoạt động hiệu quả và không hòa tan trong nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa.

Chúng tôi ch n hƠm l ng ethanol (% (v/v)) là 80 (%(v/v)) đ th c hi n các thí nghi m ti p theo.

nh h ng c a th i gian k t t a

- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây

- Th i gian siêu âm: 10 phút

- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút

- Th i gian ly tâm: 20 phút

Hình 3 8 nh h ng c a th i gian k t t a

Giá trị biểu diễn là trung bình lặp lại của 3 lần lặp lại, với 2 chất thí nghiệm được phân bố đồng đều Tuy nhiên, giá trị nghiệm thực có thể có các ký tự giống nhau mà không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0,05 Sự khác biệt có ý nghĩa được đánh giá thông qua phân tích ANOVA và LSD theo phương pháp C.1.

Khi thời gian kết tủa từ 10 phút tăng lên 60 phút, nồng độ protein tăng 1,6 lần và hoạt động enzyme tăng 5,4 lần, với giá trị cao nhất đạt được là 174,54 ± 0,32 mg/g chất khô của nguyên liệu và 2007,20 ± 5,59 UI/g chất khô của nguyên liệu Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian kết tủa, hai giá trị này không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Khi thời gian kết tủa kéo dài, lượng enzyme thu nhận được tăng lên, nhưng việc kéo dài thời gian này cũng dẫn đến sự liên kết giữa lipit và protein, làm biến tính protein trong dung môi, từ đó giảm hiệu quả tinh sạch (Polaina và MacCabe, 2007).

Chúng tôi nhận thấy rằng 60 phút là thời gian phù hợp cho quá trình kết thúc hoàn toàn Khi so sánh với thời gian kết thúc ở dưới 60 phút, không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi nhận với mức ý nghĩa thống kê p