CH NG 1 : T NG QUAN
2.3. Ph ng pháp nghiên cu
2.3.4. Ph ng pháp b trí thí ngh im
2.3.4.1. Kh o sát nh h ng c a các y u t đ n q trình trích ly enzyme tr c khi có s h tr c a siêu âm
Thí nghi m 1: Kh o sát t l dung môi: nguyên li u đ n hi u su t trích ly Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút - Nhi t đ khu y đ o: nhi t đ phòng ( ) - Th i gian ly tâm: 20 phút
Các y u t thay đ i:
- T l nguyên li u: đ m: 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8.
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
Thí nghi m 2: Kh o sát nh h ng c a th i gian khu y đ o đ n hi u su t trích ly Các y u t c đnh:
25 - T l nguyên li u: đ m: theo k t qu thí nghi m 1 - Nhi t đ khu y đ o: nhi t đ phòng ( ) - Th i gian ly tâm: 20 phút
Các y u t thay đ i:
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t (phút): 0; 10; 20; 30; 40. - Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
Thí nghi m 3: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ khu y đ o đ n hi u su t trích ly - Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 30 phút
- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí ngi m 2 - Th i gian ly tâm: 20 phút
Các y u t thay đ i:
- Nhi t đ khu y đ o ( ): 30; 40; 50; 60; 70.
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
2.3.4.2. Kh o sát nh h ng c a các y u t đ n q trình trích ly enzyme khi có s h tr c a siêu âm
Thí nghi m 4: Kh o sát nh h ng c a nhi t đ siêu ơm đ n hi u su t q trình trích ly
Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1
- Công su t siêu âm (W): 15W/g - Th i gian siêu âm (phút): 5
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2 - Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3
26 Các y u t thay đ i:
- Nhi t đ siêu âm ( ): 20; 30; 40; 50; 60
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
Thí nghi m 5: Kh o sát nh h ng c a công su t siêu ơm đ n hi u su t q trình trích ly
Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1
- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4 - Th i gian siêu âm (phút): 5
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2 - Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3
- Th i gian ly tâm: 20 phút Các y u t thay đ i:
- Công su t siêu âm (W/g): 10; 15; 20; 25; 30
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
Thí nghi m 6: Kh o sát nh h ng c a th i gian siêu ơm đ n hi u su t q trình trích ly
Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1
- Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4 - Cơng su t siêu âm: theo thí nghi m 5
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2 - Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3
- Th i gian ly tâm: 20 phút Các y u t thay đ i:
27 - Th i gian siêu âm (phút): 0; 5; 10; 15; 20
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
2.3.4.3. Kh o sát nh h ng c a dung mơi đ n q trình k t t a protein
Thí nghi m 7: Kh o sát nh h ng c a n ng đ c n đ n hi u su t quá trình k t t a protein
Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây, ngh 30 giây gi a m i 30 giây đ ng hóa
- T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1 - Nhi t đ siêu âm: theo thí nghi m 4 - Cơng su t siêu âm: theo thí nghi m 5 - Th i gian siêu âm: theo thí nghi m 6
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2 - Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3
- Th i gian ly tâm: 20 phút - T l d ch trích: c n: 1:1 - Th i gian k t t a: 10 phút Các y u t thay đ i:
- N ng đ c n (%(v/v)): 50; 60; 70; 80; 90
- Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
Thí nghi m 8: Kh o sát nh h ng c a th i gian k t t a đ n hi u su t quá trình k t t a
Các y u t c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - T l nguyên li u: đ m: theo thí nghi m 1
- pH: 7,0
28 - Cơng su t siêu âm: theo thí nghi m 5 - Th i gian siêu âm: theo thí nghi m 6
- Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : theo thí nghi m 2 - Nhi t đ khu y đ o: theo thí nghi m 3
- Th i gian ly tâm: 20 phút - N ng đ c n: theo thí nghi m 7
- T l d ch trích: c n: theo thí nghi m 8 Các y u t thay đ i:
- Th i gian k t t a (phút): 10; 20; 30; 40; 50; 60; 1h10; 1h20; 1h30 - Ch tiêu đánh giá: N ng đ protein t ng và ho t đ enzyme
2.3.4.4. Xác đnh ho t đ enzyme
Ho t tính enzyme Ginger proteolytic đ c xác đ nh b ng ph ng pháp Anson c i ti n. Ph ng pháp nƠy d a trên s th y phân protein casein b ng enzym Ginger proteolytic có trong d ch nghiên c u, sau đó vơ ho t enzym và k t t a protein ch a b th y phân b ng dung dch acid trichloracetic (TCA). nh l ng s n ph m đ c t o thành trong ph n ng th y phân b ng ph n ng màu v i thu c th Folin. D a vƠo đ th chu n c a Tyrosin đ tính l ng s n ph m do enzym xúc tác t o nên.
M t đ n v Anson lƠ l ng enzym t i thi u trong đi u ki n thí nghi m (35,5oC: pH 7,6 ầ) th y phân Casein trong 1 phút t o thành s n ph m hòa tan trong TCA, ph n ng v i thu c th Folin cho ta đ h p thu OD b c sóng 660nm t ng ng v i 1µM Tyrosin trong đ ng chu n.
Ho t đ protease =
V: t ng th tích h n h p trong ng th th t ho c ng th khơng (ml) v: th tích d ch l c đem phơn tích (ml)
t: th i gian th y phân (phút)
29 L: đ pha lỗng enzym
µM Tyrosin: l ng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra t đ ng chu n
2.3.4.4. Kh o sát ph m vi ho t đ ng c a enzyme Ginger proteolytic
Xác đnh nhi t đ ho t đ ng t i u c a enzyme
Cho 0,1mL dch trích vƠo 0,6mL đ m phosphate (pH 7,0) 100mM và 1,0mL dung dch casein 1%, sau đó h n h p trên l n l t 4, 7, 10, 30, 40, 50, 60, 70 và 80oC trong 20 phút trong b n c vƠ đo ho t tính b ng ph ng pháp Anson c i ti n.
Xác đnh pH ho t đ ng t i u c a enzyme
xác hi u ch nh pH kh o sát v m c mong mu n c n dùng m t s đ m sau: đ m citrate 100mM đ ch nh pH dung d ch v 5,5; đ m potassium phosphate 100mM đ ch nh dung d ch v pH 6,0; 6,5; 7,0 và tris-HCl 100mM đ đ a pH v 7,5 và 8,0. Cho vào m i thí nghi m dung d ch casein 1% 60oC trong 20 phút vƠ đo ho t tính b ng ph ng pháp anson c i ti n.
2.3.4.5. nh tính vƠ đ nh l ng enzyme proteolytic b ng ph ngpháp đi n di đ ng trên gel poly-acrylamide (PAGE) trên gel poly-acrylamide (PAGE)
Nguyên t c
SDS-PAGE lƠ m t k thu t đi n di trên gel polyacrymide v i SDS lƠ tác nhơn lƠm bi n tính vƠ tích đi n ơm các phơn t , ph ng pháp nƠy xác đ nh tr ng l ng phơn t protein, thƠnh ph n vƠ đ s ch ch ph m protein trong quá trình tinh ch [30].
Trong k thu t nƠy protein đ c x lỦ v i ch t t y SDS vƠ tác nhơn kh c u n i disulfit lƠ mercaptoethanol ho c DDT lƠm c u trúc b c 2,3,4 c a protein b bi n đ i thƠnh b c 1 vƠ tích đi n ơm. Do đó khi đi n di, các phơn t protein ch ph thu c vƠo kích th c khi di chuy n trong gel: nh ng phơn t có kích th c l n s di chuy n ch m h n nh ng phơn t có kích th c nh [30].
30
2.4. Ph ng pháp x lý s li u
T t c các thí nghi m đ c th c hi n l p l i ít nh t 3 l n. D li u đ c phân tích ph ng sai (ANOVA) nh m ki m đ nh đ tin c y v i m c Ủ ngh a 5% đ đánh giá s khác bi t, s d ng ph n m m Minitab Statistical.
2.5. Các ph ng pháp phơn tích
- Xác đ nh hƠm l ng protein t ng b ng ph ng pháp Bradford - Xác đnh ho t đ enzyme b ng ph ng pháp c a Anson c i ti n - Xác đ nh hƠm l ng nit t ng (AOAC 2000).
- Xác đ nh hƠm l ng béo b ng ph ng pháp Soxhlet (AOAC 2000). - Xác đnh m, hƠm l ng tro (AOAC 2000).
31
CH NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N
3.1. Thành ph n c b n c a c g ng
C g ng sau khi r a s ch, đ ráo r i đem phơn tích v thành ph n hóa h c c b n: B ng 3. 1. Thành ph n hóa h c trong c g ng t i
Tên ch tiêu HƠm l ng (%)
m 85,85 Protein 1,09 Lipid 0,35 Tro 0,71 Carbohydrate 12,0 Nh n xét:
K t qu c a b ng 3.1 cho th y nguyên li u nghiên c u có hàm m chi n 85,85% và hƠm l ng ch t khô chi m 14,15% g m 1,09% protein; 0,35% lipid; 0,71% tro; 12,0% carbohydrate. Qua đó ta có hƠm l ng protein tính theo ch t khơ trong ngun li u chi m kho ng 7,7%.
K t qu này cho th y đi m t ng đ ng v i k t qu phân tích c a Srinivasan và c ng s (2017) v i 60-70% carbohydrates; 3-8% x thô; 9% protein; 8% tro; 3-6% lipid.
S khác bi t v các h p ch t trong c g ng có th là do có s khác bi t v gi ng gùng, th nh ng, th i gian thu ho ch, th i ti t, khí h u và m t s y u t khách quan khác.
32
3.2. nh h ng c a các y u t đ n q trình trích ly enzyme protease tr c khi có s h tr c a siêu âm s h tr c a siêu âm
3.2.1. nh h ng c a t l dung môi: nguyên li u
i u ki n c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - Th i gian khu y đ o trên máy khu y t : 30 phút
- Nhi t đ khu y đ o: nhi t đ phòng (~30 ) - Th i gian ly tâm: 20 phút
Hình 3. 1. nh h ng c a t l dung môi: nguyên li u
Ghi chú: Giá tr bi u di n là trung bình l p l i 3 l n l y 2 ch s th p phân đ l ch chu n. Nh ng giá tr nghi m th c có các ký t gi ng nhau khơng có s khác bi t ý ngh a v m t th ng kê v i m c Ủ ngh a p< 0,05. C s đánh giá s khác bi t đ c d a vào b n phân tích ANOVA và LSD theo ph l c C.1
Nh n xét: 12.42d 24.76a 24.21b 24.08b 24.08b 50.66e 127.47a 126.82b 118.75c 73.90d 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 10.0 14.0 18.0 22.0 26.0 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 H o t đ t ng (U I/g) N ng đ prot ei n tng (m g/ g) T l nguyên li u: đ m Pro t ng Hp
33
T k t qu đ th 3.1 cho ta th y r ng t l nguyên li u vƠ đ m có nh h ng đáng k đ n n ng đ protein (mg/g ch t khô c a nguyên li u) và ho t đ (UI/g ch t khô c a nguyên li u). Khi t l nguyên li u vƠ đ m là 1/5 thì n ng đ protein t ng đ t giá tr cao nh t là 24,76 0,06 mg/g ch t khô c a nguyên li u và ho t đ đ t 127,47 1,48 UI/g ch t khô c a nguyên li u. Tuy nhiên khi ti p t c t ng t l nguyên li u: đ m lên 1/8 thì n ng đ protein và ho t đ c ng có giá tr th p h n so v i t l 1/6 và 1/7, giá tr l n l t là 24,21 0.13 mg/g ch t khô c a nguyên li u và 24,08 0.13UI/g ch t khô c a nguyên li u; 22,16 0.27 mg/g ch t khô c a nguyên li u và 126,82 0.97 UI/g ch t khô c a nguyên li u; 118,75 2,24 mg/g ch t khô c a nguyên li u và 73,90 0.56 UI/g ch t khô c a nguyên li u.
Gi i thích:
V nguyên t c, v i cùng m t kh i l ng nguyên li u, khi t ng l ng dung môi s d ng thì hi u su t trích ly t ng do t ng s chênh l ch gradient n ng đ c a c u t c n trích ly gi a nguyên li u và dung môi. Tuy nhiên, n u s d ng l ng dung môi quá l n thì s làm lỗng dch trích, đ ng th i c ng không gia t ng đáng k . Theo k t qu b ng 1.1, hi u su t trích ly protein và ho t đ protein thu đ c cao nh t t l nguyên li u và dung môi là 1:5.
K t lu n:
Thí nghi m đư xác đ nh đ c t l thích h p gi a dung dch đ m và nguyên li u đ q trình đ ng hóa di n ra hi u qu nh t là 1:5 trong th i gian 1phút 30 giơy, do đó chúng tơi quy t đnh ch n giá tr nƠy đ ti p t c qui trình.
3.2.2. nh h ng c a th i gian khu y đ o
i u ki n c đnh:
- Th i gian đ ng hóa v i dung dch đ m: 1 phút 30 giây - T l nguyên li u: đ m: 1/5
- Nhi t đ khu y đ o: nhi t đ phòng (~30 ) - Th i gian ly tâm: 20 phút
34
Hình 3. 2. nh h ng c a th i gian khu y đ o
Ghi chú: Giá tr bi u di n là trung bình l p l i 3 l n l y 2 ch s th p phân đ l ch chu n. Nh ng giá tr nghi m th c có các ký t gi ng nhau khơng có s khác bi t ý ngh a v m t th ng kê v i m c Ủ ngh a p< 0,05. C s đánh giá s khác bi t đ c d a vào b n phân tích ANOVA và LSD theo ph l c C.1
Nh n xét:
T k t qu đ th 3.2 cho ta th y khi không khu y đ o, hƠm l ng protein và ho t đ đ t giá tr th p nh t là 21,65 0.10 mg/g ch t khô c a nguyên li u và 66,15 1,48 UI/g ch t khô c a nguyên li u, tuy nhiên khi có s d ng máy khu y t đ khu y đ o dung d ch thì hai giá tr nƠy t ng lên đáng k vƠ đ t giá tr cao nh t là 27,25 0.06 mg/g ch t khô c a nguyên li u và 194,59 0.97 UI/g ch t khô c a nguyên li u v i th i gian khu y đ o là 30 phút n u ti p t c khu y đ o h n h p này thêm 10 phút thì hai giá tr nƠy sau đó gi m nh