CH NG 1 : T NG QUAN
1.5 .T ng qua nv ph ng pháp tinh sch Ginger rhizome proteolytic enzyme
1.5.1. Ph ng pháp k t t a
Sau khi nh n đ c d ch chi t enzyme thô, các ph ng pháp khác nhau đư đ c s d ng đ tinh s ch enzyme. K t t a là m t k thu t tinh ch ph bi n đ c s d ng đ cô đ c và tinh s ch protein. K t t a protein là quá trình tách protein kh i dung d ch và thu nh n d i d ng ch t r n b ng cách thay đ i đ hịa tan c a dung d ch. Q trình k t t a th ng không t n kém và d áp d ng trên quy mơ l n. Có m t s ph ng pháp ho c h th ng đ th c hi n quá trình k t t a nh ng quan tr ng lƠ xác đ nh ph ng pháp nƠo phù h p nh t đ đ t đ c các m c đích mong mu n sau q q trình.
Trong nhóm các ph ng pháp truy n th ng có ph ng pháp k t t a b ng các tác nhơn khác nhau nh dung môi h u c , mu i trung tính, polymer, ch t đa đi n phân, k t t a t i đi m đ ng đi n, k t t a b ng ion kim lo i... Nhóm ph ng pháp nƠy có đ c đi m d th c hi n, tác nhân t a d ki m, ph bi n.
T a b ng dung mơi h u c có m t trong nhi u quy trình s n xu t. Tuy nhiên, dung mơi h u c có kh n ng lƠm bi n tính protein ngay c nhi t đ th ng. Do v y, quá trình t a protein b ng dung môi h u c ph i đ c th c hi n nhi t đ th p 0-5 và ch n l a dung mơi thích h p [21].
Các dung môi tan trong n c nh methanol, ethanol, n-butanol đư đ c nghiên c u đ k t t a whey protein và s y khô đ thu protein concentrate. Ethanol là dung môi an toƠn h n hai dung mơi cịn l i. Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan h n so v i protein concentrate k t t a t ethanol trong khi n-butanol cho whey protein concentrate ch a nhi u béo và lactose nên g n nh không tan trong n c.
Các y u t quan tr ng nh t nh h ng đ n đ hòa tan c a protein là c u trúc, kích th c, đi n tích và dung mơi. Sau khi protein đ c k t t a, nó có th đ c tách ra kh i dung d ch b ng cách ly tâm ho c l c. Sau đó, k t t a có th đ c hòa tan tr l i trong m t th tích nh h n đ cơ đ c ho c r a và phân gi i trong m t dung d ch khác đ thay đ i đi u ki n dung d ch.
14
1.5.2. Ph ng pháp th m tích qua màng cellophane 1.5.2.1. Gi i thi u chung 1.5.2.1. Gi i thi u chung
Th m tích là q trình khu ch tán c a các phân t t n i có n ng đ cao đ n n i có n ng đ th p thông qua m t màng bán th m (không th m đ i v i nh ng ch t keo hòa tan nh protein vƠ m t s các polysaccharide nh ng th m đ i v i các d ng dung d ch c a các tinh th ) [22].
Khi đ t tr ng thái cân b ng, các phân t di chuy n ra và vào l mƠng đ t cùng t c đ . Ng c l i, các phân t có kích th c l n h n kích th c l màng s không th đi qua màng bán th m vƠ đ c gi l i t i m t phía, n ng đ c a các phân t này khơng có s thay đ i gi a hai bên màng. Khi thay dung d ch th m tích bên ngồi màng bán th m s t o ra m t gradient n ng đ m i [23].
Trong quá trình tách chi t và tinh s ch protein, đ lo i b mu i ra kh i dung d ch protein, th ng cho dung dch protein vƠo các túi đ c hi u làm b ng nguyên li u bán th m (th ng dùng là màng cellophane). Protein là nh ng đ i phân t không th v t qua túi th m tích vƠ đ c gi l i trong túi. B ng cách thay đ i th ng xuyên dung d ch r a có th t y s ch mu i ra kh i protein. Có th t ng t c đ th m tích khi khu y dung d ch r a b ng máy khu y c h c hay máy khu y t ho c là quay ch m túi nh dao đ ng c không l n.
1.5.2.2. Các y u t nh h ng đ n q trình th m tích
Các y u t nh h ng đ n quá trình th m tích g m: th tích, thành ph n và s l n thay đ i dung d ch ngoài màng bán th m, th i gian, nhi t đ th m tích vƠ kích th c các phân t so v i kích th c l màng [23]. Các phân t có kích th c nh h n l màng nhi u l n s nhanh đ t đ c s cân b ng n ng đ h n các phơn t có kích th c g n v i kích th c l màng. Màng cellophane s d ng trong thí nghi m có c u trúc các l r ng xo n, do đó các phơn t nh có th đi xuyên qua d dƠng h n [23][24].
Trong quá trình th m tích, các phân t đi qua mƠng bán th m vƠ đ t tr ng thái cân b ng riêng, đ c l p v i các ch t khác d n đ n m u có th b pha lỗng [23]. Khi th m tích
15
các protein th ng ng i ta ti n hành t t c môi tr ng l nh 4 ậ 5oC, trong kho ng 6 ậ 8 gi và th tích dung d ch ngồi màng bán th m g p 200 ậ 500 l n th tích dung d ch trong túi th m tích [23][24]. Ngồi ra, m t s phân t có th bám lên màng bán th m d n đ n m t m u. S m t m u do bám mƠng lƠ không đáng k v i m u có n ng đ > 0,5mg/ml nh ng có khác bi t l n v i m u có n ng đ < 0,1mg/ml. Có th b sung ch t mang vào m u th m tích đ ng n ng a s m t m u do bám màng [23].
1.6. T ng quan v ph ng pháp đi n di đ ng trên gel poly-acrylamide (PAGE) 1.6.1. Nguyên t c