45 TC DD & TP 15 (4) 2019 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME ĐỂ NÂNG CAO HIỆU SUẤT TRÍCH LY RESVERATROL TỪ DÂY GẮM Nguyễn Thị Hồng Lĩnh1, Nguyễn Mạnh Đạt2, Đỗ Thị Thủy Lê2, Đỗ Thị Thanh Huyền1, Bùi Thị Hồng P[.]
TC.DD & TP 15 (4) - 2019 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME ĐỂ NÂNG CAO HIỆU SUẤT TRÍCH LY RESVERATROL TỪ DÂY GẮM Nguyễn Thị Hồng Lĩnh1, Nguyễn Mạnh Đạt2, Đỗ Thị Thủy Lê2, Đỗ Thị Thanh Huyền1, Bùi Thị Hồng Phương1 Resveratrol polyphenol tự nhiên, tìm thấy nhiều lồi thực vật như: cốt khí củ, dâu tằm, lạc, nho, lựu, dâu tây Nhưng resveratrol thương mại resveratrol thu nhận chủ yếu từ cốt khí củ nho Dây Gắm gần biết đến nguồn dược liệu chứa hàm lượng resveratrol cao Trong nghiên cứu tiến hành xác định yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm vùng Yên Bái phương pháp sử dụng enzyme Q trình trích ly sử dụng enzyme Cellulast từ chủng Aspergillus niger với nồng độ 0,2%(w/w), nhiệt độ 500C, thời gian 60 phút, pH = 5,5, tỷ lệ bổ sung nguyên liệu/nước: 1/5, tốc độ khuấy 150 vịng/phút Hiệu suất trích ly thu tăng từ 56,56% không dùng enzyme lên 84,43% dùng enzyme Cellulast Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng enzyme Cellulast để xử lý ban đầu làm tăng hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm Từ khóa: Dây Gắm, resveratrol lợi ích sức khỏe, enzyme cellulast, hiệu suất trích ly II ĐẶT VẤN ĐỀ Resveratrol chứng minh đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, tốt cho người bệnh tiểu đường, hệ tim mạch, có tính kháng khuẩn cao, đặc biệt liên quan đến khả hạ axit uric máu tốt cho bệnh xương khớp Resveratrol polyphenolic tự nhiên có hoạt chất sinh học cao, tìm thấy nhiều lồi thực vật (ít khoảng 72 loài) mà phần lớn loài sử dụng đông y bữa ăn hàng ngày như: cốt khí củ, dâu tằm, lạc, nho, lựu, dâu tây [1] Các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có thực vật thường có nồng độ nhỏ muốn thu hồi hợp chất ThS Viện Công nghiệp thực phẩm Email: honglinh1683@yahoo.com.vn ĐT: 0973864798 TS Viện Công nghiệp thực phẩm phải sử dụng lượng lớn dung môi hữu để tách chiết Việc sử dụng lượng lớn dung mơi hữu địi hỏi kéo theo thời gian xử lý dài sản phẩm cuối hàm lượng tồn dư dung mơi lớn dẫn đến làm giảm chất lượng sản phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng Điều chứng tỏ tìm kiếm phương pháp trích ly thích hợp hiệu an toàn để khai thác hợp chất sinh học quan trọng Trích ly hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật phương pháp sử dụng enzyme phương pháp thay lý tưởng cho phương pháp trích ly vật lý hay hóa học khác truyền thống Ngày gửi bài: 1/8/2019 Ngày phản biện đánh giá: 20/8/2019 Ngày đăng bài: 30/9/2019 45 TC.DD & TP 15 (4) - 2019 dùng Trích ly enzyme dựa đặc tính đặc trưng enzyme để xúc tác phản ứng với độ chọn lọc, đặc hiệu cao sử dụng điều kiện phản ứng khơng địi hỏi dung môi phản ứng phức tạp Ở Việt Nam trích ly resveratrol từ thực vật nói chung từ dây Gắm nói riêng phương pháp enzyme lĩnh vực nhà nghiên cứu Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu lựa chọn điều kiện sử dụng enzyme để nâng cao hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu: - Dây Gắm lấy từ vùng Lục Yên (Yên Bái) - Các enzyme: Cellulast, Viscozyme L, Pectinex Ultra Clear hãng Sigma (Mỹ) Enzyme Xuất xứ Hoạt tính Cellulast Aspergillus niger ≥ 800U/g Viscozyme L Aspergillus sp ≥ 100 FBGU/g Pectinex Ultra Clear Aspergillus aculeatus ≥ 3300 PGNU/ml 2.2.Phương pháp nghiên cứu : 2.2.1.Phương pháp Hóa sinh xác định loại enzyme thích hợp cho q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm: 100g dây Gắm nghiền nhỏ thành mảnh có kích thước (3mm – 10mm), nhiệt độ 500C, dung môi nước tỷ lệ 1:5 (g/ml), thời gian 60 phút, sau dùng dung mơi ethanol tỷ lệ 1:12 (g/ml), thời gian 120 phút, khuấy 150 vịng/phút Thử nghiệm khả trích ly resveratrol với loại chế phẩm enzyme: Cellulast, Viscozyme L, Pectinex Ultra Clear với nồng độ 0,2% (w/w) (theo quy trình dự kiến LI Mengqing cs)[2] Nhằm tối ưu hóa q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm có sử dụng enzyme với phương pháp chiết động (50- 250 46 pH Nhiệt độ 4,5 - 45-600C 3-5 40- 500C - 6,5 45- 550C vòng/phút) điều kiện nguyên liệu/ nước (1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7 (w/v, g/ml), bổ sung enzyme Cellulast nồng độ 0,10,3% (w/w), nhiệt độ từ 40-700C, thời gian trích ly 40- 80 phút Lọc thu dịch sau trích ly Cơ quay đuổi dung mơi thu dịch tích 100 ml Đo hàm lượng resveratrol HPLC để tính hiệu suất trích ly 2.2.2.Phương pháp làm giàu chế phẩm resveratrol từ dây Gắm Cao chiết thu sau q trình quay loại dung môi dịch chiết dây Gắm với cồn tiến hành bổ sung thêm dung môi etyl axetat với tỷ lệ cao chiết/ethyl axetat =1/2(m/v) nhiệt độ 600C khuấy thời gian 20 phút Lọc cô đuổi dung môi thu cao dây Gắm hàm lượng resveratrol cao TC.DD & TP 15 (4) - 2019 Hiệu suất trích ly resvertrol (%) 2.2.3.Phương pháp phân tích Hóa lý 2.2.3.1.Phân tích định tính resveratrol phương pháp sắc ký mỏng TLC (Thin Layer Chromatography Sử dụng mỏng sắc ký Silica gel 60 F254 Dung môi chạy sắc ký toluen:ethyl acetate:acid acetic tỷ lệ 15:3:1 (v/v) Hòa tan chất chuẩn resveratrol (Sigma, 99%), cao chiết thí nghiệm thu dung môi methanol cho nồng độ chất chuẩn 50µg/ml, nồng độ cao chiết mg/ml Bản mỏng quan sát đèn UV 254 so sánh với vệt chất chuẩn 2.2.3.2 Xác định hàm lượng resveratrol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chất chuẩn resveratrol (Sigma, 99%) Máy sắc ký lỏng hiệu cao - PDA Cột sắc ký C18 Pha động: MeOH:H2O = 90:10 (v/v), tốc độ dịng F=1ml/phút Detector UV-vis bước sóng 306 nm, nhiệt độ cột: 350C III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp Khi sử dụng enzyme cho q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm, loại enzyme có hoạt độ khác thường tham gia xúc tác cho loại chất Vấn đề đặt xác định enzyme thích hợp để hỗ trợ trình phá hủy thành tế bào dây Gắm giúp cho dung môi ethanol dễ dàng tiếp xúc với hoạt chất dây Gắm, q trình trích ly resveratrol đạt hiệu suất cao Các loại enzyme sử dụng nghiên cứu bao gồm: Cellulast, Viscozyme L, Pectinex Ultra Clear bổ sung với tỷ lệ 0,2% so với khối lượng dây Gắm khơ Tiến hành thí nghiệm mơ tả mục 2.2.1 Hiệu suất trích ly resveratrol (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 C: Chất chuẩn resveratrol M1: Enzyme Cellulase M2: Enzyme Viscozyme L M3: Enzyme Pectinex Ultra Clear Không dùng enzyme Pec Ce Vis Chế phẩm enzyme Hình ảnh TLC chế phẩm enzyme Hình 1:Biểu đồ minh họa ảnh hưởng chế phẩm enzyme Kết thu cho thấy hiệu suất trích ly resveratrol cao đạt giá trị 84,43% sử dụng enzyme Cellulast, cao nhiều so với mẫu đối chứng không sử dụng enzyme cao mẫu bổ sung Viscozyme L, Pectinex Ultra Clear Điều giải thích sau, thành tế bào loại nói chung dây Gắm nói riêng chứa chủ yếu thành phần: cel47 TC.DD & TP 15 (4) - 2019 lulose, hemicellulose pectin cellulose thành phần chiếm chủ yếu Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên Cellulase cắt liên kết β-1,4- glucosid cellulose, phá vỡ khung tế bào, giúp dung môi dễ dàng tiếp xúc với nguyên liệu dây Gắm hỗ trợ giải phóng hoạt chất tốt so với chế phẩm cịn lại Do vậy, chúng tơi chọn enzyme Cellulase cho thí nghiệm 3.2.Nghiên cứu điều kiện thích hợp trích ly resveratrol có sử dụng enzyme 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất trích ly resveratrol Phản ứng enzyme phản ứng thuận nghịch, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nồng độ enzyme có ảnh hưởng đặc biệt tới khả phân giải chất enzyme Khi nồng độ enzyme lớn (bão hoà với nồng độ chất), tiếp tục tăng nồng độ enzyme vận tốc phản ứng tăng chậm khơng Hiệu suất trích ly resveratrol Hiệu suất trích ly resveratrol (%) Hiệu suất t ly resveratrol (%) 100 thay đổi Để tìm nồng độ enzyme Cellulast thích hợp cho q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm việc cần thiết cho phép sử dụng enzyme cách hiệu mặt kinh tế lẫn kỹ thuật Tiến hành khảo sát nồng độ sử dụng enzyme: 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3% (w/w) tương ứng với hoạt độ enzyme Cellulast (0,8; 1,2; 1,6; 2,0; 2,4 U/g) Tiến hành thí nghiệm mơ tả mục 2.2.1 Kết trình bày nồng độ 0,1% hiệu suất trích ly resveratrol thu thấp 64,7%, tiếp tục tăng nồng độ lên 0,15% hiệu suất trích ly tăng lên 72,66% tăng không đáng kể Và hiệu suất đạt cao 86,7% nồng độ 0,2% Tuy nhiên nồng độ enzyme tăng lên 0,25%, 0,3% hiệu suất tăng nồng độ 0,2% không nhiều Như vậy, xét mặt chất lượng dịch sau trích ly hiệu kinh tế chúng tơi chọn nồng độ 0,2% để tiến hành thí nghiệm Kết trùng hợp với phát LI Meng-qing cs [3] 80 60 40 100 80 60 40 20 20 0 0% 0,10% 0,15% 0,20% 0,25% 0,30% Nồn g độ e nzyme 100 Hiệu suất trích ly resveratrol (%) Hiệu suất trích ly resveratrol (%) 100 80 60 40 60 40 0 45 50 55 60 Nh i ệt độ xử l ý e nzyme 70 40 50 60 70 80 Th ời gi an xử lý enzyme (phút) 100 Hiệu suất trích ly resveratrol (%) 100 Hiệu suất trích ly resveratrol (%) 80 20 20 80 60 40 20 1:03 1:04 1:05 1:06 1:07 Tỷ l ệ n guyên liệu : du ng m ôi (g/ml) 80 60 40 20 5,5 pH củ a m ôi trường 50 100 150 200 250 Tốc độ khuấy trộn (vịng/phút) Hình 2: Đồ thị miêu tả yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly resveratrol enzyme Cellulast 48 TC.DD & TP 15 (4) - 2019 3.2.2 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/nước tới hiệu suất trích ly resveratrol Tỷ lệ nguyên liệu/nước ảnh hưởng đến khả phân tán enzyme vào chất Nếu lượng nước ban đầu đưa vào không đủ để enzyme tiếp xúc với chất, nhiều gây tốn lượng cho q trình trích ly thu hồi resveratrol Hơn resveratrol khơng tan tan nước nên xử lý enzyme môi trường tiền đề để phá vỡ thành tế bào giúp cho trình trích ly dùng ethanol Nếu sử dụng lượng dung môi lớn dẫn tới nồng độ cồn khối dịch q trình trích ly thấp, điều làm khả trích ly resveratrol cuối thấp Do vậy, việc tìm tỷ lệ ngun liệu/nước thích hợp quan trọng, góp phần làm tăng hiệu suất trích ly resveratrol dây Gắm Các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khảo sát là: 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7 (w/v, g/ml) Từ kết cho thấy hiệu suất trích ly resveratrol tăng dần theo tỷ lệ nguyên liệu/nước Trong tỷ lệ 1/5 cho hiệu suất cao điều giải thích với tỷ lệ nguyên liệu/nước phù hợp cho trình thủy phân thành tế bào enzyme Cellulase triệt để, sau bổ sung ethanol 96% với tỷ lệ 1/12 (g/ml) để trích ly tiếp tạo chung thành dung mơi ethanol có nồng độ khoảng (67 ± 1%) trích ly resveratrol tốt Với tỷ lệ: 1/6, 1/7 ta thấy hiệu suất trích ly lại giảm với hàm lượng nước bổ sung vào nhiều làm cho nồng độ enzyme lỗng hoạt lực enzyme giảm Hơn bổ sung nước nhiều lại làm giảm bớt nồng độ cồn khối dung mơi trích ly sau khả trích ly resveratrol hơn, dẫn tới hiệu suất trích ly cuối khơng cao 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất trích ly resveratrol Trạng thái cân (hòa tan) tốc độ truyền khối (hệ số khuếch tán) ảnh hưởng nhiệt độ trích ly Xử lý nhiệt làm tăng khả hòa tan khuếch tán hợp chất, giảm độ nhớt dung môi, tăng khả truyền khối xâm nhập dung môi vào tế bào Nghiên cứu cho thấy hợp chất phenolic dễ bị biến tính nhiệt độ lớn 500C[4] Đồng thời, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme Vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng theo chiều tăng nhiệt độ giới hạn định, vượt giới hạn vận tốc phản ứng xúc tác enzyme giảm Với q trình trích ly có sử dụng enzyme dung mơi phải lựa chọn nhiệt độ cho vừa chọn nhiệt độ mà enzyme hoạt động tối ưu lại vừa với hợp tính chất dung mơi lựa chọn để trích ly Dựa vào đặc tính enzyme Cellulast sử dụng dựa vào đặc tính dung mơi dùng để trích ly ethanol nên mức nhiệt độ khảo sát: 450C, 500C, 550C, 600C,700C Kết cho thấy hiệu suất trích ly resveratrol đạt giá trị cao nhiệt độ 500C 83,83% Nhiệt độ cao không làm tăng hàm lượng resveratrol trích ly mà cịn làm giảm dần nhiệt độ cao enzyme bị bất hoạt Với mục đích nâng cao hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm chúng tơi lựa chọn nhiệt độ trích ly 500C 49 TC.DD & TP 15 (4) - 2019 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian tới hiệu suất trích ly resveratrol Đối với q trình xử lý có sử dụng enzyme yếu tố thời gian yếu tố quan tâm đến thời gian dài làm giảm khả chịu nhiệt enzyme Ngay enzyme hoạt động điều kiện tối ưu thể hoạt độ cao khoảng thời gian định Vượt thời gian hoạt lực enzyme bị yếu dần bị vơ hoạt Thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng resveratrol hiệu suất trích ly hoạt chất Nếu thời gian trích ly ngắn, lượng hoạt chất sinh học khơng trích ly hồn tồn dẫn đến hàm lượng resveratrol thu thấp, thời gian dài hoạt chất bị oxy hóa, chất lượng số lượng hoạt chất giảm Để tiến hành tìm khoảng thời gian xử lý enzyme thích hợp chúng tơi tiến hành khảo sát từ 40, 50, 60, 70, 80 phút Kết thu cho thấy khoảng thời gian từ 40 - 60 phút hiệu suất thu nhận resveratrol tăng dần đạt cao thời gian 60 phút, sau có chiều hướng giảm dần Do chúng tơi lựa chọn thời gian 60 phút để tiến hành cho thí nghiệm 3.2.5 Ảnh hưởng pH tới hiệu suất trích ly resveratrol pH mơi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá chất đến độ bền protein enzyme Protein enzyme có tính chất lưỡng tính Các nhóm axít kiềm enzyme có khả ion hố Khi thay đổi pH mơi trường phản ứng, nhóm liên kết với H+ OH- 50 mức ion hố nhóm axít kiềm phân tử enzyme bị thay đổi Nếu nhóm đóng vai trị trung tâm hoạt động enzyme tạo thành liên kết enzyme-cơ chất bị ức chế, ảnh h¬ưởng tới q trình thuỷ phân pH dung môi yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme, enzyme hoạt động định pH xác định gọi pH hoạt động tối ưu enzyme pH tối ưu Cellulast khoảng 4.5-6 Ngồi ra, resveratrol thuộc nhóm phenol - chất chống oxy hóa mạnh nên dễ oxy hóa pH cao [5], pH thấp ức chế q trình oxy hóa hợp chất polyphenol hàm lượng thu cao Vì để nghiên cứu xác định độ pH thích hợp cho q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm, chúng tơi tiến hành thực trích ly với dịch trích ly pH khác là: 4,0; 5; 5,5; 6,0; 7,0 Khi tiến hành thay đổi pH môi trường từ 4,0 đến 7,0 kết cho thấy hiệu suất tăng dần đạt cao pH 5,5 pH tối ưu enzyme cellulase hoạt động, hiệu suất giảm dần pH tăng đến 7, pH môi trường kiềm làm ức chế hoạt động enzyme cellulase Do chúng tơi lựa chọn pH cho thí nghiệm pH= 5,5 3.2.6 Ảnh hưởng tốc độ khuấy tới hiệu suất trích ly resveratrol Tốc độ khuấy yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến q trình trích ly resveratrol từ dây Gắm Qúa trình khuấy trộn làm tăng khả tiếp xúc enzyme chất dẫn đến làm tăng khả hòa tan resveratrol vào ethanol Do để xác TC.DD & TP 15 (4) - 2019 3.3.Đánh giá chất lượng chế phẩm resveratrol từ dây Gắm Dịch trích ly resveratrol dây Gắm sau trích ly phương pháp enzyme kết hợp với ethanol tiến hành tinh chế cách sử dụng dung môi ethyl axetat Hàm lượng resveratrol phân tích phương pháp HPLC Sắc ký đồ thể hình Kết thu cho thấy chế phẩm resveratrol từ dây Gắm dạng bột làm giàu, hàm lượng resveratrol đạt chế phẩm khô > 16% định tốc độ khuấy thích hợp cho q trình xử lý tốc độ khảo sát: 50, 100, 150, 200, 250 v/ph Qua kết thu cho thấy tốc độ khuấy trộn nguyên liệu khác có ảnh hưởng khác tới hiệu suất thu nhận resveratrol Xét mặt kinh tế, đề tài chọn tốc độ khuấy 150 vòng/phút cho thí nghiệm với hiệu suất trích ly đạt 83,3%, phù hợp với kết Lin cs [3] 25 20 Resveratrol/1.452 30 mAU 125 306nm,4nm (1.00) Resveratrol/1.450 mAU 306nm,4nm (1.00) 35 100 75 15 50 10 25 0 0.5 1.0 mAU 306nm,4nm (1.00) 175 150 125 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 1.0 mAU 306nm,4nm (1.00) 300 250 200 100 1.5 2.0 2.5 3.0 150 75 100 50 50 25 0 -25 0.0 0.5 Resveratrol/1.431 0.0 Resveratrol/1.441 -5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 -50 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Hình 3: Pic chạy HPLC A: resveratrol chuẩn, B:Dịch trích ly ethanol C: Dịch trích ly enzyme Cellulast + ethanol, D: Chế phẩm khô giàu resveratrol IV KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy trình kết hợp sử dụng enzyme cellulast để xử lý nguyên liệu sau dùng ethanol để trích ly resveratrol từ dây Gắm cho hiệu suất cao so với quy trình dùng dung mơi ethanol để trích ly Enzyme cellulast sử dụng nồng độ 0,2% (w/w), nhiệt độ 500C, thời gian 60 phút, pH = 5,5, tỷ lệ bổ sung nguyên liệu/nước:1/5, tốc độ khuấy150 vịng/phút Hiệu suất trích ly tăng từ 56,56% lên 84,43% Như sử dụng enzyme Cellulast trình xử lý ban đầu làm tăng hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm 51 ... resveratrol từ thực vật nói chung từ dây Gắm nói riêng phương pháp enzyme lĩnh vực nhà nghiên cứu Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu lựa chọn điều kiện sử dụng enzyme để nâng cao hiệu suất. .. mục đích nâng cao hiệu suất trích ly resveratrol từ dây Gắm chúng tơi lựa chọn nhiệt độ trích ly 500C 49 TC.DD & TP 15 (4) - 2019 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian tới hiệu suất trích ly resveratrol Đối... chất enzyme Khi nồng độ enzyme lớn (bão hoà với nồng độ chất), tiếp tục tăng nồng độ enzyme vận tốc phản ứng tăng chậm khơng Hiệu suất trích ly resveratrol Hiệu suất trích ly resveratrol (%) Hiệu