Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (plateletderived growth factor – PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường

Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài

Tổng quan tài liệu

1.1 Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu-Platelet-derived growth factor (PDGF) 1.1.1 Cấu trúc

PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) là một yếu tố tăng trưởng quan trọng, chủ yếu ảnh hưởng đến các tế bào có nguồn gốc từ trung mô như nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn trong thành mạch máu, cũng như một số tế bào từ ngoại bì thần kinh như oligodendrocyte Trong cơ thể, PDGF hoạt động dưới dạng nhị phân (dimer), có thể là đồng nhị phân (homodimer) hoặc dị nhị phân (heterodimer), được hình thành từ liên kết disulfide giữa bốn loại đơn phân PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C và PDGF-D Đến nay, đã có năm dạng đồng phân nhị phân của PDGF được xác định, bao gồm PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC và PDGF-DD.

Mặc dù PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) được mã hóa bởi bốn gen khác nhau trên nhiễm sắc thể, tất cả các dạng đơn phân của nó đều giữ lại cấu trúc gọi là miền yếu tố tăng trưởng (growth factor domain), nằm trong vùng cystein knot Vùng cystein knot này có cấu trúc gấp cuộn đặc trưng, bao gồm tám cystein được sắp xếp thành các phiến β đối song và liên kết với nhau bởi ít nhất ba cầu nối disulfide.

Cấu trúc rotaxane được hình thành từ sáu trong tám cystein trong vùng này, tạo nên một đặc điểm nổi bật Cấu trúc này bao gồm chuỗi polypeptide nằm giữa hai cầu nối disulfide, tạo thành một vòng lặp, trong đó cầu nối disulfide thứ ba sẽ xuyên qua vòng lặp này.

Cấu trúc rotaxane không chỉ mang lại sự ổn định bền vững cho phân tử PDGF mà còn hỗ trợ hình thành cầu nối disulfide giữa hai cystein thứ 2 và thứ 4 Ngoài miền growth factor có tính bảo tồn, các vùng khác của các dạng đơn phân PDGF khác nhau thể hiện sự khác biệt rõ rệt về trình tự và miền PDGF hoạt động như một nhân tố tăng trưởng địa phương, được tiết ra trong khoảng gian bào.

N của mỗi loại đơn phân PDGF đều chứa một trình tự tiết khác nhau dài từ 18- 22 amino acid [1] Trong khi PDGF-A và PDGF-B chứa trình tự propeptide dài khoảng

PDGF-C và PDGF-D có thêm trình tự CUB (complement subcomponent) nằm giữa hai vùng trình tự tiết và vùng propeptide, bên cạnh 60 amino acid ngay sau trình tự tiết Trong khi đó, PDGF-A và PDGF-B ở đầu C của vùng tăng trưởng chứa trình tự đuôi từ 30-60 amino acid, chủ yếu là các amino acid tích điện dương.

Arginine và lysine đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác của PDGF với heparin và heparin sulfate proteoglycan (HSPG), góp phần vào sự phân bố của PDGF trong khoảng gian bào Mặc dù PDGF-C và PDGF-D không có vùng trình tự đuôi sau vùng tăng trưởng, nhưng sự tương tác giữa CUB và các protein hoặc carbohydrate trong chất nền ngoại bào sẽ điều chỉnh sự phân bố của hai loại PDGF này.

Hình 1 1 Bốn loại đơn phân PDGF và các domain của chúng

SP:peptide tín hiệu, PRO: trình tự proprotein, Cys-Knot: nút cystein [2]

1.1.2 Thụ thể của PDGF (PDGFR)

Thụ thể PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) thuộc lớp thụ thể tyrosine kinase III, bao gồm hai dạng protomer là PDGFRα và PDGFRβ PDGFR có năm vùng cấu trúc chính: vùng ngoại bào, vùng xuyên màng, vùng gần màng, vùng kinase và phần đuôi nội bào Vùng ngoại bào chứa năm domain tương tự globulin miễn dịch (D1-D5), có vai trò quan trọng trong việc nhận diện phối tử Khi phối tử tương tác với thụ thể PDGF, cấu hình của vùng ngoại bào sẽ thay đổi, và thông tin này được truyền vào vùng nội bào thông qua vùng xuyên màng dài khoảng 25 amino acid.

[2] Nối giữa vùng xuyên màng và vùng kinase là một đoạn polypeptide dài khoảng

Vùng gần màng của PDGFR chứa 40 amino acid, có vai trò duy trì trạng thái tự bất hoạt của tyrosine kinase khi chưa tương tác với phối tử Vùng kinase trong phần nội bào, còn được gọi là vùng effector domain, giúp PDGFR thực hiện chức năng bằng cách phosphoryl hóa và kích hoạt các phân tử khởi sự cho các con đường tín hiệu tiếp theo.

Trong vùng kinase của PDGFRα và PDGFRβ, có một đoạn chèn cung cấp vị trí bám cho các phân tử, trong khi phần đuôi ở đầu C chứa nhiều amino acid acid như serine và threonine Những amino acid này có liên quan đến quá trình ubiquitin hoá và điều hoà ức chế hoạt động của thụ thể PDGF.

Mỗi loại protomer PDGFR có mức độ ái lực khác nhau với các đơn phân PDGF Cụ thể, PDGFRα có ái lực cao và được kích hoạt bởi PDGF-A, PDGF-B và PDGF-C, trong khi PDGFRβ chủ yếu tương tác hiệu quả với PDGF-B.

Trong năm dạng đồng phân nhị phân của PDGF, chỉ có PDGF-BB có khả năng tương tác với cả ba dạng dimer của PDGFR, bao gồm PDGFR-αα, PDGFR-ββ và PDGFR-αβ (hình 1.3).

Hình 1 2 Cấu trúc nhị phân của PDGFR [5]

Hình 1 3 Sự tương tác chuyên biệt của năm dạng đồng phân nhị phân PDGF với ba dạng đồng phân nhị phân của PDGFR [2]

1.1.3 Con đường tác động của PDGF

PDGF tương tác với PDGFR trên màng tế bào đích để thực hiện chức năng của mình Khi PDGF dạng nhị phân bám vào hai PDGFR dạng protomer, nó kích hoạt thụ thể bằng cách đưa chúng lại gần nhau, tạo điều kiện cho sự phosphoryl hoá chéo giữa hai thụ thể Sự tự phosphoryl hoá của thụ thể đóng vai trò quan trọng: đầu tiên, phosphoryl hoá tại tyrosine trong vùng kinase (Tyr-849 ở PDGFRα và Tyr-857 ở PDGFRβ) làm tăng hoạt tính kinase của thụ thể; thứ hai, phosphoryl hoá các tyrosine bên ngoài vùng kinase tạo ra các vị trí bám cho các phân tử truyền tín hiệu nội bào có chứa SH2 domain.

Motif SH2 (Src Homology 2) là một cấu trúc bảo tồn gồm khoảng 100 amino acid, có khả năng bám vào tyrosine đã được phosphoryl hoá Đến nay, đã phát hiện nhiều protein chứa vùng SH2 tương tác với PDGFR, được chia thành hai nhóm: nhóm đầu tiên là các enzyme xúc tác phản ứng hóa học như PI3K và PLCγ, trong khi nhóm thứ hai bao gồm các protein không có hoạt tính enzyme như Grb2, hoạt động như các phân tử trung gian kết nối PDGFR với các enzyme khác trong con đường truyền tín hiệu Khi gắn vào thụ thể, mỗi phân tử chứa vùng SH2 khởi động những con đường truyền tín hiệu khác nhau.

13 đó, các con đường quan trọng và đã được mô tả khá rõ ràng là con đường PI3K/Akt và Ras/MAPK

1.1.3.1 CON ĐƯỜNG PI3K/AKT (PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE/ PROTEIN KINASE B)

Con đường PI3K/Akt đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của tế bào và được điều hoà chặt chẽ qua nhiều bước Sự kích hoạt con đường này bắt đầu khi PDGFR kích thích PI3K lớp 1 thông qua tiểu phần điều hoà p85, dẫn đến việc tiểu phần xúc tác p110 trong PI3K được hoạt hoá, giúp chuyển hoá PIP2 thành PIP3 PIP3 trên màng tế bào chất tương tác với PKB/Akt, huy động PDK1 đến màng tế bào để phosphoryl hoá T308 trong loop hoạt hoá của PKB/Akt, dẫn đến sự hoạt hoá một phần của PKB/Akt Akt sau đó phosphoryl hoá và bất hoạt PRAS40 và TSC2, từ đó kích hoạt mTORC1 Cơ chất của mTOR1 bao gồm 4E-BP1 và ribosomal protein S6 kinase polypeptide 1, có chức năng phosphoryl hoá S6/RPS6, kích thích tổng hợp protein và phân bào.

Hoạt tính đầy đủ của Akt được kích hoạt khi mTOR hoặc DNA-PK phosphoryl hóa Akt tại motif kỵ nước ở đầu C Akt, với hoạt tính hoàn chỉnh, phosphoryl hóa các cơ chất trong tế bào chất và nhân, liên quan đến nhiều đáp ứng tế bào như hình thành mạch máu, chuyển hóa, tăng trưởng, phân chia, sống sót, di chuyển, tổng hợp protein, phiên mã và apoptosis Tuy nhiên, sự dephosphoryl hóa T308 bởi PP2A và S473 bởi PHLPP1/2, cùng với sự chuyển đổi PIP3 thành PIP2 bởi PTEN, có thể ức chế tín hiệu Akt.

Hình 1 4 Sự hoạt hoá con đường PI3K/ Akt bởi thụ thể tyrosine kinase [7]

Hình 1 5 Các tín hiệu được hoạt hoá bởi PKB/Akt và các hoạt động của tế bào được điều hoà bởi PKB/Akt [7]