Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (plateletderived growth factor – PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO NGHIỆM THU TÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Plateletderived growth factor – PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường TÊN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS.TS Đặng Thị Phương Thảo THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Plateletderived growth factor-PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường Mã số đề tài: 219/2013/HĐĐH-SKHCN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 MỤC LỤC TĨM TẮT DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH Bảng tóm tắt nội dung cơng việc đăng ký kết đạt được…….…… I Báo cáo thống kê kết thực nghiệm đề tài………………… …… Tổng quan tài liệu………………………………………………………….9 1.1 Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu- Platelet-derived growth factor (PDGF) 1.1.1 Cấu trúc…………………………… ……………………… 1.1.2 Thụ thể PDGF (PDGFR)……………….……… ………10 1.1.3 Con đường tác động PDGF…………….………….……12 1.1.3.1 Con đường PI3K/Akt (Phosphatidylinositol-3-Kinase/ Protein kinase B)……………………….… ……… …13 1.1.3.2 Con đường RAS-MAPK………………….……….………14 1.1.4 Chức in vivo PDGF…………………….…… …….16 1.1.4.1 Q trình lành hóa vết thương…………….… …… 16 1.1.4.2 Hoạt động hệ thống mạch máu……… ……… 18 1.1.4.3 Sự hình thành phát triển phơi…….…… ……… 19 1.2 Tiềm ứng dụng tình hình nghiên cứu rhPDGF-BB…… …….20 1.2.1 Tiềm ứng dụng………………………………… ……20 1.2.2 Tình hình nghiên cứu……………………………… ………21 1.3 Thử nghiệm sinh học PDGF in vitro………………… … ……….21 1.3.1 Thử nghiệm hoạt tính sinh học…………….…………… ….21 1.3.2 Thử nghiệm sinh học in vitro……… ………………… ….22 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến thử ngiệm sinh học tăng sinh…… 23 1.4 Hệ thống biểu P pastoris……….……………………………26 1.5 Thu nhận tinh chế protein tái tổ hợp……………….…… ……27 1.5.1 Các phương pháp thu nhận protein…………….…… ……27 1.5.1.1 Phương pháp sử dụng amicon……………….… ……28 1.5.1.2 Phương pháp tủa protein ammonium sulfate… 28 1.5.1.3 Phương pháp lọc tiếp tuyến……………………….… 28 1.5.2 Tinh chế protein tái tổ hợp…………………….…… … 29 1.5.2.1 Giới thiệu chung………………………….……… ….29 1.5.2.2 Các phương pháp sắc ký dung tinh chế protein tái tổ hợp……………………………………………………………………………… ……29 1.5.2.3 Các yếu tố cần khảo sát để tối ưu hóa quy trình tinh chế… 34 1.6 Các phương pháp tinh chế hPDGF nghiên cứu ứng dụng… 35 1.7 Tình hình nghiên cứu sản xuất rhPDGF-BB VN…… …….…37 Kết thảo luận Nội dung 1: Tạo dòng tế bào nấm men P pastoris mang biển gene pdgf ….39 2.1 Vật liệu – Phương pháp……………… ……………….… … 40 2.1.1 Hóa chất môi trường… …………………… ….….… 40 2.1.2 Phương pháp .44 2.1.3 Kết - Biện luận .54 2.1.3.1 Tạo dòng plasmid mang biểu gene hpdgf Pichia pastoris 54 2.1.3.2 Cấu trúc chủng nấm men P Pastoris X33 biểu protein PDGF .58 2.1.3.3 Kiểm tra kiểu hình kiểu gen thể biến nạp 59 2.1.3.4 Xác định số gen pdgf gen P pastoris phương pháp PCR bán định lượng………………………………….63 2.1.3.5 Đánh giá khả tăng trưởng thể biến nạp.… 67 2.1.3.6 Kiểm tra khả biểu PDGF thể biến nạp67 2.1.4 Kết luận…………………………………………………….71 Nội dung 2: Nghiên cứu thu nhận hPDGF tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp……………………….…….……………………………… …72 3.1 Phương pháp………………………….….………………….…….73 3.2 Kết - Biện luận………………………………………….76 3.2.1 Kiểm tra khả biểu chủng P pastoris X33::pdgf-b……………………………………………………………….……76 3.2.2 Khảo sát điều kiện biểu hPDGF-BB…… ….78 3.2.3 Khảo sát quy trình thu nhận rhPDGF-BB phương pháp tủa ammonium sulfate (NH4)2SO4 lọc tiếp tuyến…………… ……… 90 3.3 Kết luận………………………………………….………… 97 Nội dung 3: Nghiên cứu tinh protein hPDGF tái tổ hợp………….…… 98 4.1 Phương pháp……………………………………………….… 99 4.1.1 Khảo sát quy trình tinh chế rhPDGF-BB sắc kí trao đổi cation sắc kí kị nước………………………………………………….….…99 4.1.2 Khảo sát số yếu tố quy trình tinh chế rhPDGFBB sắc kí trao đổi cation……………………………………………………100 4.2 Kết quả, Biện luận………………………………… ……… 102 4.2.1 Bước đầu khảo sát quy trình tinh chế rhPDGF-BB sắc kí trao đổi cation sắc kí kị nước……………………………………… …102 4.2.2 Khảo sát điều kiện bám cột li giải sắc kí trao đổi cation106 4.3 Kết luận………………………………………………….……118 Nội dung 4: Kiểm tra hoạt tính sinh học protein PDGF tái tổ hợp….…….….….119 5.1 Nguyên vật liệu, phương pháp…………………………….…….….120 5.2 Kết quả, thảo luận ……………………………………….…….… 135 5.2.1 Khảo sát ảnh hưởng bước đồng hoá lên đáp ứng tế bào kích thích rhPDGF-BB …………… ……….135 5.2.2 Khảo sát tối ưu hóa thơng số cho quy trình định tính hoạt tính rhPDGF-BB in vitro……………………………………… …138 5.2.3 Khảo sát tối ưu đánh giá hiệu quy trình định lượng hoạt tính rhPDGF-BB…………………………………………………… 146 5.2.4 Ứng dụng quy trình định tính định lượng rhPDGFBB in vitro xây dựng vào đánh giá hoạt tính rhPDGF-BB sản xuất phịng thí nghiệm…………………………… ……149 5.3 Kết luận…………………………………………………….……,,,152 Nội dung 5: Xây dựng tiêu chuẩn cho protein PDGF tái tổ hợp theo qui định dược điển……………………………………….………………….… .153 6.1 Cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn đánh giá sản phẩm hPDGF-BB tái tổ hợp……………………………………………………………………………….154 6.2 Bộ tiêu chuẩn đánh giá sản phẩm hPDGF-BB kết kiểm định sản phẩm PDGF đề tài…………………………………… 158 Nội dung Bước đầu thử ứng dụng protein PDGF tái tổ hợp để chữa trị vết thương mơ hìnhchuột đái tháo đường…………………………… …… 159 7.1 Vật liệu… 160 7.2 Phương pháp…160 7.2.1 Xây dựng tiêu chí đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe chuột…160 7.2.2 Khảo sát quy trình cảm ứng streptozotocin tạo mơ hình chuột đái tháo đường….162 7.2.3 Đánh giá mơ hình chuột đái tháo đường mang vết thương da….164 7.2.4 Thử ứng dụng điều trị tăng cường làm lành vết thương mơ hình chuột đái tháo đường rhPDGF-BB….165 7.3 Kết quả… 165 Sản phẩm đề tài…………………………………………………….……….168 Kết luận đề nghị……………………………………………………… ……169 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT ATCC THUẬT NGỮ American Type Culture Collection CS Calf serum CV Coefficient of variation CV Column Volume DMEM/F12 DMSO Dulbecco’s modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Dimethyl sulfoxide ĐTĐ Đái tháo đường FBS Fetal bovine serum FPLC Fast Protein Liquid Chromatography IS International Standard LMW Low Molecular Weight LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification MAPK MTT Native-PAGE NP-HPLC Mitogen-activated protein kinase 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Normal-Phase High-performance Liquid Chromatography OD Optical Density PBS Phosphate buffer saline PDGF Platelet-derived growth factor PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase rhPDGF rhPDGF-BB Recombinant human platelet-derived growth factor Recombinant human platelet-derived growth factor-BB RP-HPLC Reverse-Phase High-performance Liquid Chromatography RS Reference Standard SD Standard deviation SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE STZ TEMED TFA Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis Streptozotocin Tetramethylethylenediamine Trifluoroacetic acid TGF-β Transforming Growth Factor beta TNF-α Tumor Necrosis Factors alpha UV VEGF Ultraviolet Vascular endothelial growth factor v/v volume/volume w/v weight/weight DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 2.1 Kết hiệu suất biến nạp 59 2.2 Thống kê kiểu hình sử dụng methanol 20 thể biến nạp 62 2.3 Số lượng pPICZα/pdgf gen 20 thể biến 65 nạp 3.1 3.2 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 5.1 5.2 5.3 5.4 Hiệu suất thu hồi độ tinh hPDGF-BB tủa nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa khác Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau lọc tiếp tuyến tốc độ lọc khác Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau tinh chế cột SP FF 5ml phương pháp dung li theo dạng gradient Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB sau tinh chế cột Phenyl Sepharose 5ml phương pháp dung li theo dạng gradient Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB cột SP FF 5ml với đệm cân bằng: A1, A2, A3 A4 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB cột SP FF 5ml với đệm cân bằng: A5, A1 A6 Hiệu suất thu hồi hPDGF-BB cột SP FF 5ml với đệm li giải: B1 B3 Bốn nhóm quy trình thử nghiệm áp dụng khảo sát ảnh hưởng bước đồng hoá tế bào lên đáp ứng tế bào kích thích với rhPDGF-BB Thiết kế 18 nghiệm thức cho khảo sát ma trận ba yếu tố: nồng độ FBS môi trường thử nghiệm, thời gian xử lý rhPDGF-BB mật độ tế bào đầu vào Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 xử lý với rhPDGF-BB so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) ở bố n quy triǹ h khảo sát ảnh hưởng bước đồ ng hoá tế bào Đáp ứng tăng sinh của tế bào NIH-3T3 xử lý với rhPDGFBB so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) quy trình ở các môi trường thử nghiê ̣m chứa nồ ng đô ̣ FBS khác 92 95 104 105 109 112 115 126 130 136 140 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 7.1 7.2 7.3 Đáp ứng tăng sinh tế bào NIH-3T3 xử lý rhPDGFBB so với chứng âm và đô ̣ ở n định (%CV) quy trình sử dụng mật độ tế bào đầu vào khác Đáp ứng tăng sinh tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) quy trình xử lý tế bào với rhPDGF-BB thời gian khác Đáp ứng tăng sinh tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) quy trình cách kết hợp khác thông số mật độ tế bào đầu vào thời gian ủ rhPDGF-BB môi trường thử nghiệm chứa 0,5%FBS Giá trị độ nghiêng đường cong đáp ứng hai thông số sử dụng mật độ tế bào đầu vào 5x103 104 tế bào/giếng Đáp ứng tăng sinh tế bào NIH-3T3 so với chứng âm và đô ̣ ổ n định (%CV) quy trình cho tế bào đáp ứng với mẫu rhPDGF-BB khác Phiếu đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe chuột 142 Tổng hợp số liệu đánh giá thành viên màu da, tình trạng long khả di chuyển chuột Đánh giá tình trạng vết thương điều trị với phân đoạn nước cao phối trộn 162 143 146 147 149 161 166 Quy trình tiến hành Quy trình khái quát tạo mơ hình chuột ĐTĐ tiêm STZ: Chuột đực Mus musculus 10 con/ nghiệm thức Nuôi ổn định tuần Cho đói (22h30 – 7h30), cân trọng lượng, đánh giá cảm quan đo đường huyết Chọn chuột đạt tiêu chuẩn sức khỏe để tiêm STZ với lượng tiêm 100, 125 150 mg/dl lô đối chứng tiêm BF tuần, tuần tuần sau tiêm Cho đói (22h30 – 7h30), cân trọng lượng, đánh giá cảm quan đo đường huyết Chuột Mus musculus nuôi ổn định tuần, với lồng Trước tiêm STZ, chuột cho đói - 12 tiếng từ 22h30 đêm đến 7h30 sáng hôm sau, tiến hành cân trọng lượng, đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe đo đường huyết STZ, dạng bột đông khô, công ty Sigma, Hoa Kì bảo quản tủ âm 30°C Khi sử dụng, STZ hòa tan vào dung dịch sodium citrat buffer 0.1 M pH = 4.5 tiêm vào màng bụng cho chuột vòng phút sau hòa tan Tiến hành khảo sát lượng tiêm STZ sau: Nhóm đối chứng tiêm buffer, Nhóm tiêm 100 mg/kg STZ Nhóm tiêm 125 mg/kg STZ Nhóm tiêm 150 mg/kg STZ 163 Sau tuần, tuần tuần chuột cho đói – 12 tiếng từ 22h30 đêm đến 7h30 sáng hôm sau, tiến hành cân trọng lượng, đánh giá cảm quan tình trạng sức khỏe đo đường huyết Kết đánh giá thông qua - Tỉ lệ chuột theo mức đường huyết tương ứng lượng tiêm - Tỉ lệ chuột bị ĐTĐ tỉ lệ chuột ĐTĐ đạt chuẩn sức khỏe tương ứng với lượng tiêm STZ 7.2.3 Đánh giá mơ hình chuột đái tháo đường mang vết thương da Những chuột đạt chuẩn sức khỏe sau đánh giá cảm quan tinh trạng sức khỏe tiến hành phẫu thuẫn tạo vết thương Chuẩn bị Các dụng cụ phẫu thuật, nước muối sinh lý, y tế hấp khử trùng trước sử dụng Dọn dẹp sẽ, khử trùng khu vực làm thí nghiệm, đèn cồn bật suốt trình phẫu thuật Tiến hành phẫu thuật Bước 1: Chuột gây mê tiêm vào bắp đùi dung dịch hỗn hợp ketamin xylazine với liều 80 mg/kg ketamine 10 mg/kg xylazine pha nước muối sinh lý Thể tích tiêm 0.1 ml Bước 2: Chuột tiến hành cạo lông lưng, khoảng ½ diện tích lưng phía cạo dao lam Bước 3: Sát trùng bề mặt da với cồn 70° Đồng thời, với đường kính xác định 12 mm, tiến hành tạo vết thương cắt bỏ hoàn toàn, tức loại vùng da sâu xuyên qua lớp paniculus carnosus Giai đoạn hậu phẫu Chuột giữ ấm bẳng cách đặt gần đèn cồn tỉnh lại Giai đoạn lành vết thương: Hằng ngày vết thương rửa nước muối sinh lý Chuột chụp hình tính diện tích phần mềm ImageJ vào ngày 0, 3, 6, 164 7.2.4 Thử ứng dụng điều trị tăng cường làm lành vết thương mơ hình chuột đái tháo đường rhPDGF-BB Chuột ĐTĐ đạt chuẩn sức khỏe tạo vết thương da lưng theo phương trình bày mục 2.2.3 rhPDGF-BB tinh 95% thẩm tách qua đêm với PBS cô mẫu amicon Sau trộn với PEG 5%, bảo quản 0°C trước sử dụng Trị liệu: Hằng ngày, vết thương rửa nước muối sinh lý nhỏ dung dịch rhPDGF-BB với lượng dùng 7.07 μg/vết thương pipet, thể tích 20 μl 7.3 Kết hPDGF-BB nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu tác dụng kích thích làm lành vết thương thơng qua thu hút đại thực bào, nguyên bào sợi làm tăng sinh mơ hạt, tái tạo mạch máu Qua rhPDGF-BB thúc đẩy làm lành vết thương nhanh rhPDGF-BB cục quản lí dược phẩm thực phẩm Hoa kì cơng nhận có hiệu điều trị tăng cường lành vết thương Dựa sản phẩm thương mại hóa Regranex gel với lượng dùng rhPDGF-BB 6.25μg/cm2 Hình 7.1 Biểu đồ (%) diện tích vết thương chưa đóng chuột ĐTĐ khơng trị liệu chuột ĐTĐ trị liệu rhPDGF-BB theo thời gian 165 Kết % diện tích vết thương chưa đóng (hình 7.1) cho thấy, theo thời gian, tỉ lệ % diện tích vết thương chưa đóng chuột ĐTĐ trị liệu rhPDGF-BB thấp so với không trị liệu Như trị liệu rhPDGF-BB cho thấy hiệu mốc thời gian khảo sát Đồng thời, quan sát tình trạng vết thương (hình 7.2) cho thấy, vết thương chuột ĐTĐ trị liệu rhPDGF-BB có thời gian lành sớm so với khơng trị liệu Hình 7.2 Hình chụp vết thương chuột ĐTĐ khơng trị liệu (trên) chuột ĐTĐ trị liệu rhPDGF-BB (dưới) vào ngày 0, 3, 6, 7, 9, 10 11 Như vậy, kết thử nghiệm bước đầu cho thấy rhPDGF-BB có hiệu tăng cường làm lành vết thương mơ hình chuột ĐTĐ Tuy nhiên, kết cần tiếp tục đánh giá thông qua tổ chức mơ học bề mặt vết thương, tiêu chí quan trọng đánh giá chất lượng lành vết thương Đánh giá tình trạng vết thương điều trị hPDGF Kết thí nghiệm điều trị vết thương với hPDGF cho thấy khác biệt tình trạng vết thương chuột ĐTĐ lô trị liệu với hPDGF tốt so với lô chứng âm tất tiêu đánh giá Kết phù hợp với kết trước khả co vết thương Bảng 7.3: Đánh giá tình trạng vết thương điều trị với phân đoạn nước cao phối trộn Chỉ tiêu Mức Số tổng số chuột (n=5) Chứ hPDGF ng âm 166 Mặt vết thương Vàng nhạt 2/5 3/5 Hồng 2/5 2/5 Nâu 1/5 0/5 ngày 4/5 0/5 ngày 1/5 4/5 >3 ngày 0/5 1/5 Liền 3/5 2/5 Đứt gãy 2/5 3/5 Dày 3/5 0/5 Mỏng 2/5 5/5 Lần 2/5 0/5 Lần 3/5 2/5 Lần 0/5 3/5 Ướt, đỏ, có máu 2/5 5/5 Khơ, hồng 3/5 0/5 Khô, trùng màu da 0/5 0/5 ngày 4/5 0/5 9-10 ngày 2/5 0/5 10-11ngày 0/5 1/5 12 ngày 0/5 4/5 M Màu sắc ngày đầu Thời gian khô mặt vết thương Bờ vết thương Kéo mày Mày thứ cấp Mặt vết thương sau bong mày Thời gian bong mày sơ cấp 167 SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI Trong trình thực đề tài, chúng tơi hồn tất sản phẩm theo u cầu hợp đồng khoa học sau: Sản phẩm khoa học công nghệ dạng kết III IV bao gồm: TT Tên tài liệu Số lượng Báo cáo khoa học kết nghiên cứu (toàn văn tóm tắt) Báo cáo kết kiểm định PDGF tái tổ hợp Bài báo khoa học Đào tạo đại học Đào tạo sau đại học 08 01 báo cáo 04 06 01 Các sản phẩm khoa học công nghệ dạng I II bao gồm: TT Tên sản phẩm Vector tái tổ hợp mang biểu gene pdgf nấm men Pichia pastoris Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Bản đồ vector, vị trí chèn gene pdgf Dịng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp biểu PDGF người tái tổ hợp Quy trình cảm ứng biểu protein PDGF từ chủng nấ m men Pichia pastoris Bảng tiêu chuẩn sở đánh giá sản phẩm protein tái tổ hợp PDGF Protein tái tổ hợp PDGF có hoạt tính sinh học 5mg 168 Đặc điểm tăng trưởng sinh tổng hợp pdgf chủng Sản xuất PDGF ổn định Các thông số thời điểm, thời gian cảm ứng, chất cảm ứng… Các tiêu đánh giá theo dược điển tiêu cho sản phẩm hPDGF thương mại Protein PDGF với thông số độ tinh (>95%), hoạt tính riêng IV Kết luận đề nghị Kết luận Trong trình thực đề tài, chúng tơi hồn tất nội dung đề sau: i) Đã tạo dòng tế bào nấm men P pastoris mang biển gene pdgf Chúng thu vector tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein PDGF dịng tế bào nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp mang biểu gene mã hoá cho protein PDGF ii) Đã nghiên cứu phương pháp thu nhận hPDGF tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp thu nhận sản phẩm hPDGF tái tổ hợp thô từ dịch lên men iii) Đã nghiên cứu tinh protein hPDGF tái tổ hợp, tìm phương pháp thích hợp để tinh chế protein PDGF từ dịch tiết nấm men Pichia pastoris thu protein PDGF tinh 99% iv) Đã xây dựng chuẩn hố qui trình kiểm tra hoạt tính sinh học protein PDGF tái tổ hợp nhận thấy protein tái tổ hợp PDGF thu nhận có hoạt tính kích thích tăng sinh tế bào nguyên bào sợi NIH 3T3 tương đương với sản phẩm thương mại (Biolegend) v) Đã tìm hiểu qui chuẩn cho protein tái tổ hợp từ dược điển Mỹ, châu Âu… xây dựng tiêu chí đánh giá sản phẩm protein tái tổ hợp PDGF Sử dụng tiêu chí chúng tơi thu kết kiềm định cho sản phẩm protein tái tổ hợp thu từ nội dung đề tài vi) Đã thử nghiệm sản phẩm protein tái tổ hợp điều trị vết thương chuột đái tháo đường thấy hiệu thúc đẩy nhanh trình làm lành vết thương chuột 2.Đề nghị: Với kết thu nhận được, chúng tơi kính đề nghị: i) Được nghiệm thu đề tài ii) Được hỗ trợ đăng ký patent cho sản phẩm đề tài nhằm tạo tảng pháp lý cho nghiên cứu phát triển, ứng dụng thương mại hoá sản phẩm rhPDGF sau 169 iii) Được hỗ trợ cấp kinh phí cho pha đề tài nhằm sản xuất phát triển sản phẩm từ protein PDGF tái tổ hợp bao gồm nội dung sau: 3.1 Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất nguyên liệu dược phẩm hPDGF qui mô 1200mg – 2400mg hPDGF 95% tinh sạch/ mẻ (nguyên liệu cần cho 800-1600 tube thuốc tương đương Regarnex / mẻ sản xuất) Các nội dung chi tiết dự kiến thực bao gồm: - Nghiên cứu xây dựng tối ưu qui trình lên men thu nhận hPDGF qui mô 5l 10l nhằm thu nhận hPDGF đạt hiệu suất 400mg protein hPDGF thô/1l dịch lên men - Nâng cao qui mô hiệu suất tinh chế hPDGF độ tinh >95% hiệu suất thu hồi >60% - Nghiên cứu bảo quản nguyên liệu protein hPDGF 3.2 Nghiên cứu phát triển sản phảm dược phẩm nhằm điều trị vết thương từ nguyên liệu hPDGF tái tổ hợp 170 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Fredriksson, L., et al., (2004) "The PDGF family: four gene products form five dimeric isoforms", Cytokine & growth factor reviews, 15(4): 197-204 [2] Chen, P.-H., et al., (2012) "Platelet-derived growth factors and their receptors: Structural and functional perspectives", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics [3] Abramsson, A., et al., (2007) "Defective N-sulfation of heparan sulfate proteoglycans limits PDGF-BB binding and pericyte recruitment in vascular development", Genes & development, 21(3): 316-331; Lindblom, P., et al., (2003) "Endothelial PDGF-B retention is required for proper investment of pericytes in the microvessel wall", Genes & development, 17(15): 1835-1840 [4] Reigstad, L J., et al., (2005) "Structural and functional specificities of PDGF‐C and PDGF‐D, the novel members of the platelet‐derived growth factors family", Febs Journal, 272(22): 5723-5741 [5] Heldin, C.-H and B Westermark, (1999) "Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor", Physiological reviews, 79(4): 12831316 [6] Russell, R B., et al., (1992) "Conservation analysis and structure prediction of the SH2 family of phosphotyrosine binding domains", FEBS letters, 304(1): 15-20 [7] Hemmings, B A and D F Restuccia, (2012) "Pi3k-pkb/akt pathway", Cold Spring Harbor perspectives in biology, 4(9): a011189 [8] Kolch, W., (2005) "Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors", Nature reviews Molecular cell biology, 6(11): 827-837 [9] Diegelmann, R F and M C Evans, (2004) "Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing", Front Biosci, 9(1): 283-289 [10] Barrientos, S., et al., (2008) "Growth factors and cytokines in wound healing", Wound Repair and Regeneration, 16(5): 585-601 171 [11] Lynch, S E., et al., (1987) "Role of platelet-derived growth factor in wound healing: synergistic effects with other growth factors", Proceedings of the National Academy of Sciences, 84(21): 7696-7700 [12] Blatti, S P., et al., (1988) "Induction of fibronectin gene transcription and mRNA is a primary response to growth-factor stimulation of AKR-2B cells", Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(4): 1119-1123 [13] Ivarsson, M., et al., (1998) "Type I collagen synthesis in cultured human fibroblasts: regulation by cell spreading, platelet-derived growth factor and interactions with collagen fibers", Matrix biology, 16(7): 409-425 [14] Schöenherr, E., et al., (1991) "Effects of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-b1 on the synthesis of a large versican-like chondroitin sulfate proteoglycan by arterial smooth muscle cells", J Biol Chem, 26: 17640-17647 [15] Heldin, P., et al., (1989) "Effect of growth factors on hyaluronan synthesis in cultured human fibroblasts", Biochem J, 258: 919-922 [16] Clark, R., et al., (1989) "Platelet isoforms of platelet-derived growth factor stimulate fibroblasts to contract collagen matrices", Journal of Clinical Investigation, 84(3): 1036 [17] Bauer, E., et al., (1985) "Stimulation of in vitro human skin collagenase expression by platelet-derived growth factor", Proceedings of the National Academy of Sciences, 82(12): 4132-4136 [18] Oh, S.-J., et al., (1998) "Platelet-derived growth factor-B induces transformation of fibrocytes into spindle-shaped myofibroblasts in vivo", Histochemistry and cell biology, 109(4): 349-357 [19] Sato, N., et al., (1993) "Platelet-derived growth factor indirectly stimulates angiogenesis in vitro", The American journal of pathology, 142(4): 1119; Lindahl, P., et al (1999) Role of platelet-derived growth factors in angiogenesis and alveogenesis Tissue Repair and Fibrosis, Springer: 27-33; Nicosia, R F., et al., (1994) "Vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and insulin-like growth factor-1 promote rat aortic angiogenesis in vitro", The American journal of pathology, 145(5): 1023 172 [20] Beitz, J G., et al., (1991) "Human microvascular endothelial cells express receptors for platelet-derived growth factor", Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(5): 2021-2025 [21] Marx, M., et al., (1994) "Modulation of platelet-derived growth factor receptor expression in microvascular endothelial cells during in vitro angiogenesis", Journal of Clinical Investigation, 93(1): 131 [22] Brown, D M., et al., (1995) "Platelet-derived growth factor BB induces functional vascular anastomoses in vivo", Proceedings of the National Academy of Sciences, 92(13): 5920-5924 [23] Lindahl, P., et al., (1997) "Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice", Science, 277(5323): 242-245 [24] Berk, B C., et al., (1986) "Vasoconstriction: a new activity for plateletderived growth factor", Science, 232(4746): 87-90 [25] Cunningham, L D., et al., (1992) "Platelet-derived growth factor receptors on macrovascular endothelial cells mediate relaxation via nitric oxide in rat aorta", Journal of Clinical Investigation, 89(3): 878 [26] Ikeda, M., et al., (1997) "PDGF-BB decreases systolic blood pressure through an increase in macrovascular compliance in rats", American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 273(4): H1719-H1726 [27] Leveen, P., et al., (1994) "Mice deficient for PDGF B show renal, cardiovascular, and hematological abnormalities", Genes & development, 8(16): 1875-1887 [28] Soriano, P., (1994) "Abnormal kidney development and hematological disorders in PDGF beta-receptor mutant mice", Genes & development, 8(16): 18881896 [29] Soriano, P., (1997) "The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites", Development, 124(14): 2691-2700 [30] Ataliotis, P., et al., (1995) "PDGF signalling is required for gastrulation of Xenopus laevis", Development, 121(9): 3099-3110 173 [31] Boström, H., et al., (1996) "PDGF-A signaling is a critical event in lung alveolar myofibroblast development and alveogenesis", Cell, 85(6): 863-873 [32] Hollinger, J O., et al., (2008) "Recombinant human platelet-derived growth factor: biology and clinical applications", The Journal of Bone & Joint Surgery, 90(Supplement 1): 48-54 [33] Alexander, D M., et al., (1992) "Isolation and purification of a biologically active human platelet-derived growth factor BB expressed in Escherichia coli", Protein Expr Purif, 3(3): 204-211; Karumuri, N N., et al., (2007) "Simple, rapid, high-purity preparation of recombinant human plateletderived growth factor-BB", Biotechnol Lett, 29(9): 1333-1339 [34] Wang, Y., et al., (2009) "High-level secretory production of recombinant human platelet-derived growth factor BB by Saccharomyces cerevisiae under the non-selective conditions", Prikl Biokhim Mikrobiol, 45(2): 176-180 [35] Choi, J H., et al., (2011) "Expression and production of therapeutic recombinant human platelet-derived growth factor-BB in Pleurotus eryngii", Appl Biochem Biotechnol, 165(2): 611-623 [36] Giese, N., et al., (1989) "Expression and purification of biologically active v-sis/platelet-derived growth factor B protein by using a baculovirus vector system", J Virol, 63(7): 3080-3086 [37] Deepa, K., et al., (2013) "Transgenic expression and functional characterization of human platelet derived growth factor BB (hPDGF-BB) in tobacco (Nicotiana tabacum L.)", Appl Biochem Biotechnol, 171(6): 1390-1404 [38] Khanh, V C., et al (2014) A study on constructing and screening of multi-copy pdgf recombinant Pichia pastoris clones producing high yield of PDGFBB (platelet derived growth factor BB) [39] Duy, D L., et al (2015) Optimization of fermentation conditions for the production of recombinant hpdgf-bb in Pichia pastoris [40] Thanh Thanh, V K., et al., (Accepted) "Purification of recombinant human Platelet – Derived Growth Factor-BB (rhPDGF-BB)", Journal of Biology (Vietnam), 174 [41] Meager, A., (2006) "Measurement of cytokines by bioassays: theory and application", Methods, 38(4): 237-252 [42] Thomson, A W and M T Lotze (2003) The Cytokine Handbook, TwoVolume Set, Gulf Professional Publishing [43] Chen, C.-H and S C Chen, (1981) "Cell growth factor activity: new quantitative method in cell culture assay", Experimental cell research, 136(1): 4351 [44] Ashihara, T and R Baserga, (1979) "[20] Cell synchronization", Methods in enzymology, 58: 248-262 [45] Blakeley, D M., et al., (1989) "Bombesin and platelet-derived growth factor stimulate formation of inositol phosphates and Ca2+ mobilization in Swiss 3T3 cells by different mechanisms", Biochem J, 258: 177-185 [46] Brooks, R F., et al., (1990) "Failure of platelet-derived growth factor plus insulin to stimulate sustained proliferation of Swiss 3T3 cells Requirement for hydrocortisone, prostaglandin E1, lipoproteins, fibronectin and an unidentified component derived from serum", Journal of cell science, 97(1): 71-78 [47] Rankin, S and E Rozengurt, (1994) "Platelet-derived growth factor modulation of focal adhesion kinase (p125FAK) and paxillin tyrosine phosphorylation in Swiss 3T3 cells Bell-shaped dose response and cross-talk with bombesin", Journal of Biological Chemistry, 269(1): 704-710 [48] Chen, Y., et al., (1997) "Vitamin A in serum is a survival factor for fibroblasts", Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(19): 1020510208 [49] De Donatis, A., et al., (2008) "Proliferation Versus Migration in Plateletderived Growth Factor Signaling THE KEY ROLE OF ENDOCYTOSIS", Journal of Biological Chemistry, 283(29): 19948-19956 [50] Brooks, R and P Riddle, (1988) "The 3T3 cell cycle at low proliferation rates", Journal of cell science, 90(4): 601-612 [51] Tallquist, M and A Kazlauskas, (2004) "PDGF signaling in cells and mice", Cytokine Growth Factor Rev, 15(4): 205-213 175 [52] He, C., et al., (1999) "Effects of chronic wound fluid on the bioactivity of platelet‐derived growth factor in serum‐free medium and its direct effect on fibroblast growth", Wound Repair and Regeneration, 7(2): 97-105 [53] Li, H., et al., (2013) "High level expression, efficient purification and bioactivity assay of recombinant human platelet-derived growth factor AA dimer (PDGF-AA) from methylotrophic yeast< i> Pichia pastoris", Protein expression and purification, 91(2): 221-227 [54] Reed, G F., et al., (2002) "Use of coefficient of variation in assessing variability of quantitative assays", Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(6): 1235-1239 [55] Rankin, S and E Rozengurt, (1994) "Platelet-derived growth factor modulation of focal adhesion kinase (p125FAK) and paxillin tyrosine phosphorylation in Swiss 3T3 cells Bell-shaped dose response and cross-talk with bombesin", J Biol Chem, 269(1): 704-710 [56] Choi, J.-H., et al., (2011) "Expression and production of therapeutic recombinant human platelet-derived growth factor-BB in Pleurotus eryngii", Applied biochemistry and biotechnology, 165(2): 611-623 [57] De Donatis, A., et al., (2008) "Proliferation versus migration in plateletderived growth factor signaling: the key role of endocytosis", J Biol Chem, 283(29): 19948-19956 [58] Li, H., et al., (2013) "High level expression, efficient purification and bioactivity assay of recombinant human platelet-derived growth factor AA dimer (PDGF-AA) from methylotrophic yeast Pichia pastoris", Protein expression and purification, 91(2): 221-227 [59] Pledger, W., et al., (1977) "Induction of DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells by serum components: reevaluation of the commitment process", Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(10): 4481-4485 [60] Li, H., et al., (2013) "High level expression, efficient purification and bioactivity assay of recombinant human platelet-derived growth factor AA dimer (PDGF-AA) from methylotrophic yeast Pichia pastoris", Protein Expr Purif, 91(2): 221-227 176 [61] Minion, D J., et al., (1999) "The proliferative response to plateletderived growth factor of smooth muscle cells isolated from synthetic vascular grafts in a canine model", Journal of vascular surgery, 29(5): 845-851 [62] Mire-Sluis, A R., et al., (1995) "Quantitative cell line based bioassays for human cytokines", Journal of immunological methods, 187(2): 191-199 [63] Zetterberg, A., et al., (1984) "The relative effects of different types of growth factors on DNA replication, mitosis, and cellular enlargement", Cytometry, 5(4): 368-375 177 ... Hội đồng nghiệm thu) TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Plateletderived growth factor- PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường Mã số đề tài: 219/2013/HĐĐH-SKHCN... kiểm tra khả tiết hPDGF tái tổ hợp chủng nấm men tái tổ hợp Nghiên cứu thu nhận hPDGF tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp Nghiên cứu tinh protein hPDGF tái tổ hợp Sản phẩm cầ n đa... TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Với mục tiêu nghiên cứu sản xuất protein PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) tái tổ hợp làm hoạt chất sinh học ứng dụng điều trị loét bàn chân đái tháo đường, sau hướng