Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến- 123docz.net

I. Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài

2. Kết quả và thảo luận

2.1.3. Kết quả Biện luận

2.1.3.6. Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp

Các thể biến nạp được hoạt hố, ni cấy và cảm ứng biểu hiện protein PDGF trong BMMY pH 4. Đồng thời, chúng tôi cũng thực hiện mẫu đối chứng bao gồm:

Giờ Mật độ tế

-Chủng P. pastoris X33 mang plasmid pPICZα, kiểu hình Mut+ được cảm ứng bằng methanol.

-Chủng P. pastoris X33 mang plasmid pPICZα/pdgf, kiểu hình Mut+ không được cảm ứng bằng methanol (methanol được thay bằng glycerol trong suốt q trình ni cấy).

Dịch nuôi cấy được thu nhận,ly tâm loại sinh khối và dùng làm mẫu phân tích sự biểu hiện protein PDGF bằng phương pháp SDS-PAGE và Western blot.Kích thước dự đoán của protein rhPDGF ở dạng monomer là 12-18kDa và dạng dimer là 28-35kDa. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc và được thể hiện trên hình 2.10.

Hình 2.10. Kết quả điện di SDS-PAGE: A. Dưới điều kiện biến tính, B. Dưới điều

kiện khơng biến tính

1: Thang phân tử lượng, 2: X33 pPICZα, cảm ứng methanol, 3-9: thể biến nạp 1-7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 20,1 14,4 30 kDa A B

Kết quả này cho thấy, tại các giếng nạp dịch cảm ứng của các thể biến nạp (giếng 3-9) xuất hiện 1 vạch protein có kích thước trong khoảng 17kDa trong điều kiện biến tính và 31kDa trong điều kiện khơng biến tính, trong khi mẫu đối chứng khơng có vạch này. Protein PDGF khi xử lý biến tính sẽ trở thành dạng monomer, có kích thước nằm trong khoảng 17kDa cịn ở dạng tự nhiên thì có cấu trúc dimer với kích thước khoảng 31 kDa. Như vậy, vạch protein trên có thể là rhPDGF được biểu hiện từ các thể biến nạp. Theo đánh giá cảm quan ban đầu, chúng tôi nhận thấy vạch protein này đậm và nhiều hơn hẳn ở giếng 3 và 6, giếng được nạp mẫu của thể biến nạp 1, 4 và đậm nhất ở giếng 3, mẫu cảm ứng của thể biến nạp 1.

Các vạch protein có kích thước tương ứng protein mục tiêu này được phân tích bằng phần mềm Quantity One để xác định giá trị phần trăm tương đối so với tổng protein tiết ra ngồi mơi trường (hình 2.11). Tương tự kết quả đánh giác cảm quan, chúng tôi nhận thấy trong các thể biến nạp thu được, thể biến nạp 1 cho hiệu quả tiết protein mục tiêu nhiều nhất, 44,5% so với tổng lượng protein tiết của tế bào. Kết quả này cũng phù hợp với dự đoán từ kết quả kiểm tra số lượng bản sao pPICZα/pdgf trước đó. Dịng tái tổ hợp 1 với số lượng bản sao pdgf sát nhập nhiều nhất dẫn đến có khả năng biểu hiện protein mục tiêu mức độ cao nhất. Do đó, dịng tái tổ hợp 1 được tiếp tục sử dụng để phân tích khả năng biểu hiện protein PDGF

Các mẫu cảm ứng từ dòng tái tổ hợp 1 thu nhận sau 24, 48, 72 giờ được tiến hành điện di SDS-PAGE, phân tích bằng phần mềm Quantity One và lai Western để phân tích sự biểu hiện PDGF. Kết quả được thể hiện trên hình 2.12 và hình 2.13.

Hình 2.12. Kết quả xác nhận protein PDGF bằng phương pháp lai Western blot

Giếng 1: Thang phân tử lượng thấp

Giếng 2: X33 chứa pPICZα, cảm ứng methanol Giếng 3: thể biến nạp 1, nuôi trong glycerol

Giếng 4-6: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Giếng 7: thể biến nạp 4, nuôi trong glycerol

Giếng 8-10: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ

Hình 2.13. Kết quả được phân tích hiệu quả tiết tại 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ của thể biến nạp

1 và 4 trên gel polyacrylamide bằng phần mềm Quantity One Giếng 1: Thang chuẩn protein

Giếng 2: X33 chứa pPICZα cảm ứng methanol Giếng 3: thể biến nạp 1 trên môi trường glycerol

1 2 3 4 5 6

Giếng 4,5,6: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ

Kết quả trên bản phim cho thấy có 3 vạch tương ứng với 3 vị trí phát sáng trên màng lai, không xuất hiện bất kỳ vạch tạp nào khác. Trong đó, vị trí, độ đậm và độ to của vạch tín hiệu trên phim tương ứng với vị trí, độ đậm và độ to của vạch 31kb trên bảng điện di. Điều này giúp khẳng định vạch 31kb biểu hiện vượt mức trên bảng điện di chính là protein PDGF dạng dimer.

Phân tích các vạch protein mục tiêu bằng phần mềm Quantity One, chúng tôi nhận thấy trong khoảng thời gian từ 24-72 giờ nuôi cấy, hiệu quả biểu hiện và tiết PDGF của thể biến nạp 1 ngày càng tăng. Tại thời điểm 72 giờ, protein PDGF được tiết ra chiếm tới 55,6% so với tổng protein tiết của tế bào.

Với những kết quả trên, chúng tơi nhận thấy có mối tương quan giữa số lượng bản sao gen pdgf sát nhập và khả năng biểu hiện của dòng tái tổ hợp. Dòng đa bản sao pdgf đã được sáng lọc thành công bằng phương pháp PCR bán định lượng và được chứng minh là có khả năng biểu hiện PDGF vượt trội. Dòng này sẽ được sử dụng cho quy trình sản xuất PDGF về sau.

2.1.4. KẾT LUẬN

Chúng tôi đã thực hiện tái tổ hợp nhiều bản sao gen pdgf trên pPICZα vào bộ gen nấm men P. patoris để biểu hiện PDGF dạng tiết ở mức độ cao. Với những kết quả thực nghiệm được trình bày trong phần 4, chúng tơi rút ra một số kết luận như sau:

- Đã cấu trúc thành công chủng nấm men Pichia patoris X33 mang đa bản sao gen pdgf.

- Các chủng đa bản sao có khả năng tăng trưởng tương tự như chủng X33 hoang dại và biểu hiện mạnh protein PDGF dạng tiết với mức độ cao.

- Khảo sát, xây dựng quy trình thu nhận hPDGF tái tổ hợp có độ tinh sạch cao từ dịch lên men.

NỘI DUNG 2

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN hPDGF

3.1. Phương pháp

Kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng P. pastoris X33::pdgf-b

Theo khuyến cáo của nhà cung cấp Invitrogen, quy trình biểu hiện protein mục tiêu ở dạng tiết được tiến hành như sau: [19]

- Dùng khuẩn lạc đơn cấy vào 25ml môi trường MGY, BMG (pH 6.0) hay BMGY (pH 6.0) trong erlen 250ml. Nuôi cấy lắc ở 30oC (200vòng/phút) cho đến khi đạt OD600 = 2 - 6 (pha tăng trưởng, khoảng 16 - 18 giờ).

- Thu tế bào bằng cách ly tâm 1500 - 3000 x g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối trong môi trường BMMY (pH 6.0) với mật độ tế bào ban đầu tương ứng giá trị OD600 bằng 1 để cảm ứng biểu hiện. Việc biểu hiện tiến hành ở 30oC, tốc độ lắc 200vòng/phút.

- Bổ sung methanol để đạt nồng độ cuối 0,5% sau mỗi 24 giờ để duy trì việc cảm ứng.

- Sau mỗi 12 giờ kể từ khi cảm ứng, chuyển 1ml dịch nuôi cấy vào eppendorf 1,5ml để phân tích mức độ biểu hiện và đánh giá thời điểm thu mẫu tối ưu. Ly tâm với tốc độ cao nhất ở nhiệt độ phòng trong 2 - 3 phút.

- Chuyển dịch nổi vào một eppendorf khác. Giữ ở -80oC. Như vậy, theo khuyến cáo của nhà cung cấp, việc biểu hiện protein mục tiêu bằng hệ thống P. pastoris được thực hiện với những thông số sau: Nhiệt độ 30oC, pH 6.0, OD600 ban đầu 1.0, methanol nồng độ cuối 0.5%, tốc độ lắc, tốc độ lắc 200vòng/phút.

Khảo sát các điều kiện biểu hiện trong phịng thí nghiệm

Chúng tơi tiến hành khảo sát một số nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất hPDGF của chủng P. pastoris X33::pdgf-b.

- Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ hịa tan oxy trong mơi trường, từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng. Đồng thời, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của alcohol axidase, protease cũng như sự ly giải của tế bào chết, là những nhân tố tác động đến hiệu suất sản xuất protein [20, 19, 30]. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ thích hợp cho biểu hiện protein. Quy trình khảo sát nhiệt độ được thực hiện tương tự như quy trình kiểm tra khả năng biểu hiện trình bày ở mục trên, trong 72 giờ, với nhiệt độ được khảo sát ở 30oC và 25oC.

- pH

Dù P. pastoris có thể sinh trưởng ở dải pH rộng, từ 3 - 7, nhưng các giá trị pH thấp được chứng minh góp phần ức chế hoạt tính của protease, bảo vệ protein mục tiêu khỏi bị phân hủy khi được tiết ra mơi trường. Quy trình khảo sát pH là quy trình biểu hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất trong 72 giờ với thông số nhiệt độ là nhiệt độ thích hợp đã khảo sát ở trên. Các giá trị pH được khảo sát là 3, 4, 5, 6.

- Tốc độ lắc

Tốc độ lắc quyết định lượng oxy hịa tan vào mơi trường. Lượng oxy này ảnh hưởng đến q trình sử dụng methanol của chủng, có ý nghĩa trong sinh trưởng của chủng cũng như giảm độc tính đối với tế bào. Thêm vào đó, oxy hịa tan cũng góp phần làm tăng hiệu suất sản xuất protein tái tổ hợp. Tuy nhiên tốc độ lắc cao khơng chỉ có thể khiến tế bào sinh trưởng mạnh và chết đi trước khi tiết protein ra mơi trường mà cịn tiêu tốn thêm năng lượng cho vận hành máy móc, thiết bị. Việc khảo sát tốc độ lắc được tiến hành theo quy trình biểu hiện với các thơng số nhiệt độ, pH thích hợp đã khảo sát trong 72 giờ. Tốc độ lắc được khảo sát ở 200vịng/phút và 150vịng/phút.

-Thời gian ni cấy

Thời gian nuôi cấy càng dài đồng nghĩa với thời gian xúc tác của protease càng tăng. Hơn nữa, nuôi cấy quá lâu khiến các tế bào chết có cơ hội để phân hủy và tiết protease nội bào. Điều này ảnh hưởng xấu đến hiệu suất sản xuất protein mục tiêu. Do đó địi hỏi phải khảo sát thời điểm thu mẫu sao cho thu được lượng protein tái tổ hợp cao nhất. Khảo sát thời gian ni cấy thích hợp theo quy trình biểu hiện protein nêu trên, với giá trị nhiệt độ và pH hiệu quả đã khảo sát ở mục. Việc nuôi cấy được tiến hành trong 96 giờ và thu mẫu ở các thời điểm 0; 12; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96 giờ kể từ thời điểm cảm ứng.

- Mật độ tế bào ban đầu

Mật độ tế bào ban đầu cao giúp rút ngắn thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, mật độ tế bào quá cao mà lượng oxy khơng được cung cấp đủ có thể gây chết tế bào, giải phóng protease nội bào. Việc khảo sát mật độ tế bào cũng được thực hiện theo quy trình biểu hiện như trên, trong 72 giờ, với giá trị nhiệt độ và pH thích hợp đã

khảo sát. Mật độ tế bào ban đầu được khảo sát ở các giá trị tương ứng với OD600 lần lượt là 1,0; 1,2; 1,5; 2,0.

- Nồng độ chất cảm ứng

Methanol có vai trị trong sự cảm ứng phiên mã gen aox1 [17]. Tuy nhiên,

quá trình biến dưỡng methanol sinh ra phụ phẩm H2O2 gây độc cho tế bào [27]. Do đó, cần khảo sát nồng độ methanol tối thích để tăng hiệu suất biểu hiện protein mục tiêu. Methanol được khảo sát ở các nồng độ cuối 0,25%, 0,5%, 1,0%, 1,5% cùng với quy trình biểu hiện protein như trên với các thông số nhiệt độ, pH và mật độ tế bào ban đầu thích hợp, thực hiện trong 72 giờ.

Khảo sát quy trình thu nhận rhPDGF-BB bằng phương pháp tủa bằng ammonium sulfate (NH4)2SO4 và lọc tiếp tuyến.

Thiết lập quy trình thu nhận rhPDGF-BB sau biểu hiện có hiệu quả để giảm tối đa thể tích mẫu, làm tăng nồng độ rhPDGF-BB trong dịch nuôi cấy, loại bỏ những protein không phải mục tiêu và ổn định hoạt tính của rhPDGF-BB nhằm thuận tiện cho các thí nghiệm tinh chế sau này, hạn chế số lượng cột sắc kí cần sử dụng, cũng như chọn được phương pháp có thời gian cơ mẫu ngắn, giá thành rẻ, có khả năng áp dụng ở quy mơ lớn. Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát quy trình thu nhận rhPDGF-BB, so sánh giữa 2 phương pháp cô mẫu là phương pháp tủa bằng (NH4)2SO4 và phương pháp lọc tiếp tuyến.

Quy trình tiến hành

Tủa với (NH4)2SO4

- 100ml dịch mẫu (dịch nuôi cấy biểu hiện rhPDGF-BB trong môi trường BMMY pH 4.0) khảo sát tủa với 40%, 50%, 60%, 70% (NH4)2SO4 bão hòa, khuấy từ ở 11oC trong 6 giờ.

- Thu tủa bằng cách li tâm 5000 vòng trong 20 phút. Giữ lại dịch nổi để điện di kiểm tra.

- Hòa tủa với 50 ml Tris-HCl 20mM pH7,5 để đổi đệm.

Lọc tiếp tuyến với màng lọc 10kDa

- Cho 200ml dịch mẫu vào bình chứa, chạy máy. Khảo sát hai tốc độ lọc là 125 và 150 vòng/phút ở 25oC trong 3 giờ. Chỉnh van áp suất sao cho áp suất phía trên cột khoảng 10 PSI. Giữ lại phần dịch chảy ra khỏi cột.

- Đến khi thể tích mẫu trong cột cịn một nửa so với ban đầu (khoảng 3 giờ) thì dừng, mở van xả để thu hết mẫu trong bình và trong đường ống. Rửa hệ thống bằng MiliQ.

- Mẫu thu được sau khi tủa (NH4)2SO4 và lọc tiếp tuyến được phân tích đánh giá bằng điện di SDS-PAGE, định lượng protein tổng bằng phương pháp đo Bardford và định lượng tương đối rhPDGF-BB bằng phần mềm ImageJ. Sau khảo sát, quy trình thu mẫu tối ưu và phù hợp nhất sẽ được chọn để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN

3.2.1. Kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng P. pastoris X33::pdgf-b

Chủng P. pastoris X33::pdgf-b được tiến hành cảm ứng biểu hiện theo quy trình đề nghị bởi nhà cung cấp (Invitrogen – Hoa Kỳ) [19]. Sự tăng trưởng của chủng đươc đánh giá thông qua đường cong tăng trưởng. Khả năng biểu hiện hPDGF-BB được đánh giá thông qua kết quả điện di SDS-PAGE và lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu cho hPDGF. Mẫu protein từ chủng P. pastoris

X33::pdgf-b nuôi cấy trong môi trường không chứa chất cảm ứng và P. pastoris

X33/pPICZα trong môi trường chứa chất cảm ứng được sử dụng làm mẫu đối chứng.

So sánh đường cong tăng trưởng của chủng P. pastoris X33::pdgf-b trong

môi trường không chứa chất cảm ứng và môi trường chứa chất cảm ứng, chúng tôi nhận thấy ở cả hai loại môi trường, tế bào đều tăng trưởng với mật độ cao. Sau 60 giờ nuôi cấy, tế bào đi vào pha cân bằng với mật độ tế bào trong điều kiện có và khơng có chất cảm ứng đạt giá trị OD 600nm lần lượt là 10 và 20. Sự sinh trưởng trong điều kiệu có chất cảm ứng kém hơn so với khơng có chất cảm ứng là do methanol vừa là nguồn dinh dưỡng vừa là chất độc đối với tế bào nấm men P. pastoris.

Hình 3.1. Sự tăng trưởng của chủng P. pastoris X33::pdgf-b.

Hình 3.2. Khả năng biểu hiện hPDGF của chủng nấm men tái tổ hợp.

Kết quả điện di SDS-PAGE ở hình 7 cho thấy có sự xuất hiện vạch protein kích thước 30kDa, tương ứng với kích thước của hPDGF ở cấu hình dimer (Antoniades và cộng sự, 1979; Deuel và cộng sự, 1981) trong khi các mẫu đối chứng âm khơng có. Tuy nhiên, vạch này chưa hẳn là hPDGF bởi đây có thể là vạch protein của tế bào có cùng kích thước. Để xác nhận vạch protein trên là PDGF, chúng tôi tiến hành lai với kháng thể đặc hiệu kháng PDGF. Kết quả cho thấy trên bản phim xuất hiện tín hiệu dương tính ở giếng 4 đã xác nhận khả năng biểu hiện hPDGF của chủng.

Như vậy, chủng X33 tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein mục tiêu. Quá trình biểu hiện này được kiểm soát chặt chẽ, thể hiện qua việc mẫu đối chứng âm là chủng tái tổ hợp nuôi cấy trong môi trường khơng chứa chất cảm ứng thì khơng có sự xuất hiện vạch protein hPDGF-BB (giếng 3). Tuy nhiên, trong dịch tiết, bên cạnh protein mục tiêu còn lẫn nhiều protein khác thể hiện qua các vạch tạp trên bảng điện di. Do đó cần phải tiến hành khảo sát điều kiện biểu hiện của chủng để tăng cường mức độ biểu hiện hPDGF-BB và giảm tối đa lượng protein lạ.

3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện hPDGF-BB.