I. Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài
2. Kết quả và thảo luận
2.1.3. Kết quả Biện luận
2.1.3.4. Xác định số bản sao của gen pdgf trong bộ gen của P.
phương pháp PCR bán định lượng
Xây dựng đường tương quan giữa DNA khuôn mẫu và cường độ sáng vạch sản phẩm PCR
Số lượng bản sao là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong P. pastoris. Do đó, xác định số lượng bản sao của vector trong bộ gen của các thể biến nạp sẽ giúp chọn lọc được các thể biến nạp tiềm năng có khả năng biểu hiện mạnh protein mục tiêu. Phương pháp PCR bán định lượng được dùng để xác định số bản sao bằng cách so sánh số lượng bản sao DNA được khuếch đại từ phản ứng PCR dựa trên cường độ sáng của sản phẩm PCR trên gel agarose. Cường độ sáng của các vạch sản phẩm được tham chiếu với đường tương quan giữa hàm lượng DNA và độ sáng của băng DNA được thực hiện song song. Trong một khoảng giới hạn xác định, cường độ phát sáng của vạch DNA trên bản điện di tăng tuyến tính với lượng sản phẩm DNA khuếch đại, nói cách khác, tỷ lệ với lượng khuôn mẫu ban đầu.
Chúng tôi tiến hành xây dựng đường tương quan giữa cường độ sáng của băng DNA sản phẩm PCR và lượng DNA khn mẫu, từ đó xác định khoảng giới hạn trong đó vẫn cịn duy trì sự tuyến tính giữa lượng DNA khn mẫu và cường độ sáng vạch sản phẩm PCR. Đây là cơ sở để xác định lượng DNA đầu vào cho phản ứng bán định lượng cũng như phân tích số lượng bản sao. Để xây dựng đường tương quan trên, chúng tôi tiến hành PCR với khn mẫu là bộ gene dịng nấm men tái tổ hợp với nồng độ khn mẫu pha lỗng bậc 2 trong khoảng từ 6.255ng – 800ng. Kết quả được phân tích bằng phần mềm Image J và trình bày trong hình 2.6 và hình 2.7.
Kết quả điện di cho thấy trong khoảng nồng độ từ 12.5ng – 400ng, cường độ sáng của vạch mục tiêu tỉ lệ thuận với nồng độ DNA khn mẫu. Trong khi đó ở nồng độ thấp hơn 12.5ng hay cao hơn 400ng khơng có sản phẩm PCR tạo thành. Điều này có thể giải thích là do lượng DNA khuôn mẫu nạp vào quá ít dẫn tới không đủ lượng sản phẩm khuếch đại để phát hiện trên bảng điện di hay quá nhiều dẫn tới ức chế phản ứng PCR.
64 2500bp 750bp 10.000bp 1000bp 250bp 2000bp 2200bp
Như vậy từ đường tương quan trên, chúng tôi chọn nồng độ DNA khuôn cho phản ứng PCR là 25ng để dùng trong phân tích số lượng bản sao vì đây là lượng DNA thấp nhất cho sản phẩm khuếch đại nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn.
Hình 2.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với lượng DNA bộ gen khác nhau
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1kb plus; Giếng 2: chứng âm; Giếng 3-8: lượng DNA bộ gen cho phản ứng PCR lần lượt là 12,5ng; 25ng; 50ng; 100ng; 200ng; 400ng
Hình 2.7. Đường chuẩn bộ gen X33 ứng với lượng DNA bộ gen khác nhau
Xác định số lượng bản sao của gen pdgf trong bộ gen các thể biến nạp
Nhận thấy, ứng với 25ng DNA khuôn mẫu ban đầu, vạch 2,2kb của các thể biến nạp sẽ có độ sáng khoảng 5.500.000 pixel. Trong tự nhiên, bộ gen của chủng
1 2 3 4 5 6 7 8 Cường độ sang (pixel) 12,5 25 50 100 200 400 Lượng DNA (ng)
65
X33 hoang dại chỉ chứa 1 gen AOX1. Do đó, độ sáng DNA dài 2.2kb ln thể hiện lượng DNA được khuếch đại từ một bản sao trên DNA bộ gene. Khi hàm lượng DNA khuôn mẫu tăng, tức là số DNA bộ gene trong phản ứng tăng, sản phẩm PCR 2.2kb và cường độ sáng trên gel agarose sẽ tăng trong khoảng tuyến tính như đã nêu trên. Ngược lại, đối với các thể biến nạp nấm men kiểu hình Mut+, khi thực hiện phản ứng với mồi AOX1, bên cạnh sản phẩm PCR là gene AOX1 có kích thước 2.2kb, phản ứng cịn cho sản phẩm DNA dung hợp chứa gene mục tiêu dài khoảng 875bp (hình 2.7A). Dung hợp DNA chứa gene mục tiêu này có nguồn gốc từ plasmid tái tổ hợp và được sát nhập vào bộ gene của tế bào nấm men trong quá trình biến nạp. Do vậy, số lượng các bản sao DNA chèn vào bộ gene là hoàn toàn ngẫu nhiên. Nếu bộ gene thể nấm men biến nạp chứa 1 bản sao DNA dung hợp, cường độ băng sản phẩm DNA 875bp sẽ tương tương với cường độ băng sản phẩm DNA là gene AOX1 2.2kb. Điều này có nghĩa là nếu thể biến nạp chỉ chứa 1 bản sao gene chèn trong bộ gen thì sản phẩm PCR với kích thước 875bp thu được từ phản ứng với 25ng DNA khuôn mẫu cũng có độ sáng khoảng 5.500.000 pixel. Bộ gene thể biến nạp nấm men chứa càng nhiều bản sao của dung hợp DNA mục tiêu thì độ sáng của vạch 875bp càng mạnh. Bằng cách tính tỉ lệ giữa độ sáng của vạch 875kb và độ sáng của vạch 2,2kb ta có thể xác định tương đối số lượng bản sao của thể biến nạp.
Hình 2.7A.Vị trí mồi AOX1 trên bộ gene Mut+ và các sản phẩm PCR dự kiến
Kết quả điện di xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp được thể hiện trên hình 2.7B, hình 2.8 và bảng 2.3.
Bảng 2.3. Số lượng bản sao của pPICZα/pdgf trong bộ gen của 20 thể biến nạp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 5’ AOX1 3’ 5’AOX 1 PDGF TT ZeoR 3’AOX1 5’AOX1 3’AOX1 5’AOX1
66 X3 3 1 6 1 1 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Hình 2.7B. Kết quả điện di xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1kb plus Giếng 2: chứng âm
Giếng 3-8: bộ gen của X33 lần lượt ứng với 12,5ng; 25ng; 50ng; 100ng; 200ng; 400ng Giếng 9-14: bộ gen của các thể biến nạp 1, 3, 4, 6, 7, 9
Giếng 15: pPICZα/pdgf
Giếng 16: pPICZα
Hình 2.8. Số lượng bản sao của pPICZα/pdgf trong bộ gen của 20 thể biến nạp
67
Như vậy, trong 20 thể biến nạp X33 thu được, có 2 thể biến nạp, 1 và 4, chứa nhiều trình tự vector trong bộ gen. Do có nhiều bản sao của vector nên có khả năng 2 thể biến nạp này sẽ biểu hiện mạnh protein PDGF tái tổ hợp.
2.1.3.5. Đánh giá khả năng trăng trưởng của các thể biến nạp
Việc chứa nhiều bản sao của vector trong bộ gen có thể sẽ ảnh hưởng tới sức sống của các thể biến nạp. Vì vậy, cần đánh giá khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp này. Khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp được đánh giá bằng sự so sánh đường cong tăng trưởng của các thể biến nạp và chủng X33 hoang dại. Kết quả được thể hiện trên hình 2.9.
Hình 2.9. Đường cong tăng trưởng của X33 hoang dại, X33 chứa pPICZα và các thể biến
nạp
Kết quả cho thấy rằng, đường cong tăng trưởng của X33 hoang dại, X33 mang pPICZα và các thể biến nạp 1, 3,4 đều có dạng giống nhau, thời gian pha log, pha ổn định như nhau. Giá trị OD600 cao nhất đều đạt khoảng 10 - 15 sau 48 giờ cảm ứng. Như vậy, dù chứa nhiều bản sao của vector trong bộ gen, đặc biệt thể biến nạp 1 chứa tới 16 vector nhưng khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp này không khác biệt nhiều so với chủng X33 hoang dại.
2.1.3.6. Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp
Các thể biến nạp được hoạt hố, ni cấy và cảm ứng biểu hiện protein PDGF trong BMMY pH 4. Đồng thời, chúng tôi cũng thực hiện mẫu đối chứng bao gồm:
Giờ Mật độ tế
68
-Chủng P. pastoris X33 mang plasmid pPICZα, kiểu hình Mut+ được cảm ứng bằng methanol.
-Chủng P. pastoris X33 mang plasmid pPICZα/pdgf, kiểu hình Mut+ khơng được cảm ứng bằng methanol (methanol được thay bằng glycerol trong suốt q trình ni cấy).
Dịch ni cấy được thu nhận,ly tâm loại sinh khối và dùng làm mẫu phân tích sự biểu hiện protein PDGF bằng phương pháp SDS-PAGE và Western blot.Kích thước dự đốn của protein rhPDGF ở dạng monomer là 12-18kDa và dạng dimer là 28-35kDa. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc và được thể hiện trên hình 2.10.
Hình 2.10. Kết quả điện di SDS-PAGE: A. Dưới điều kiện biến tính, B. Dưới điều
kiện khơng biến tính
1: Thang phân tử lượng, 2: X33 pPICZα, cảm ứng methanol, 3-9: thể biến nạp 1-7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 20,1 14,4 30 kDa A B
69
Kết quả này cho thấy, tại các giếng nạp dịch cảm ứng của các thể biến nạp (giếng 3-9) xuất hiện 1 vạch protein có kích thước trong khoảng 17kDa trong điều kiện biến tính và 31kDa trong điều kiện khơng biến tính, trong khi mẫu đối chứng khơng có vạch này. Protein PDGF khi xử lý biến tính sẽ trở thành dạng monomer, có kích thước nằm trong khoảng 17kDa cịn ở dạng tự nhiên thì có cấu trúc dimer với kích thước khoảng 31 kDa. Như vậy, vạch protein trên có thể là rhPDGF được biểu hiện từ các thể biến nạp. Theo đánh giá cảm quan ban đầu, chúng tôi nhận thấy vạch protein này đậm và nhiều hơn hẳn ở giếng 3 và 6, giếng được nạp mẫu của thể biến nạp 1, 4 và đậm nhất ở giếng 3, mẫu cảm ứng của thể biến nạp 1.
Các vạch protein có kích thước tương ứng protein mục tiêu này được phân tích bằng phần mềm Quantity One để xác định giá trị phần trăm tương đối so với tổng protein tiết ra ngồi mơi trường (hình 2.11). Tương tự kết quả đánh giác cảm quan, chúng tôi nhận thấy trong các thể biến nạp thu được, thể biến nạp 1 cho hiệu quả tiết protein mục tiêu nhiều nhất, 44,5% so với tổng lượng protein tiết của tế bào. Kết quả này cũng phù hợp với dự đoán từ kết quả kiểm tra số lượng bản sao pPICZα/pdgf trước đó. Dịng tái tổ hợp 1 với số lượng bản sao pdgf sát nhập nhiều nhất dẫn đến có khả năng biểu hiện protein mục tiêu mức độ cao nhất. Do đó, dịng tái tổ hợp 1 được tiếp tục sử dụng để phân tích khả năng biểu hiện protein PDGF
70
Các mẫu cảm ứng từ dòng tái tổ hợp 1 thu nhận sau 24, 48, 72 giờ được tiến hành điện di SDS-PAGE, phân tích bằng phần mềm Quantity One và lai Western để phân tích sự biểu hiện PDGF. Kết quả được thể hiện trên hình 2.12 và hình 2.13.
Hình 2.12. Kết quả xác nhận protein PDGF bằng phương pháp lai Western blot
Giếng 1: Thang phân tử lượng thấp
Giếng 2: X33 chứa pPICZα, cảm ứng methanol Giếng 3: thể biến nạp 1, nuôi trong glycerol
Giếng 4-6: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Giếng 7: thể biến nạp 4, nuôi trong glycerol
Giếng 8-10: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Hình 2.13. Kết quả được phân tích hiệu quả tiết tại 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ của thể biến nạp
1 và 4 trên gel polyacrylamide bằng phần mềm Quantity One Giếng 1: Thang chuẩn protein
Giếng 2: X33 chứa pPICZα cảm ứng methanol Giếng 3: thể biến nạp 1 trên môi trường glycerol
1 2 3 4 5 6
71
Giếng 4,5,6: thể biến nạp 1, cảm ứng methanol sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
Kết quả trên bản phim cho thấy có 3 vạch tương ứng với 3 vị trí phát sáng trên màng lai, khơng xuất hiện bất kỳ vạch tạp nào khác. Trong đó, vị trí, độ đậm và độ to của vạch tín hiệu trên phim tương ứng với vị trí, độ đậm và độ to của vạch 31kb trên bảng điện di. Điều này giúp khẳng định vạch 31kb biểu hiện vượt mức trên bảng điện di chính là protein PDGF dạng dimer.
Phân tích các vạch protein mục tiêu bằng phần mềm Quantity One, chúng tôi nhận thấy trong khoảng thời gian từ 24-72 giờ nuôi cấy, hiệu quả biểu hiện và tiết PDGF của thể biến nạp 1 ngày càng tăng. Tại thời điểm 72 giờ, protein PDGF được tiết ra chiếm tới 55,6% so với tổng protein tiết của tế bào.
Với những kết quả trên, chúng tơi nhận thấy có mối tương quan giữa số lượng bản sao gen pdgf sát nhập và khả năng biểu hiện của dòng tái tổ hợp. Dòng đa bản sao pdgf đã được sáng lọc thành công bằng phương pháp PCR bán định lượng và được chứng minh là có khả năng biểu hiện PDGF vượt trội. Dịng này sẽ được sử dụng cho quy trình sản xuất PDGF về sau.
2.1.4. KẾT LUẬN
Chúng tôi đã thực hiện tái tổ hợp nhiều bản sao gen pdgf trên pPICZα vào bộ gen nấm men P. patoris để biểu hiện PDGF dạng tiết ở mức độ cao. Với những kết quả thực nghiệm được trình bày trong phần 4, chúng tơi rút ra một số kết luận như sau:
- Đã cấu trúc thành công chủng nấm men Pichia patoris X33 mang đa bản sao gen pdgf.
- Các chủng đa bản sao có khả năng tăng trưởng tương tự như chủng X33 hoang dại và biểu hiện mạnh protein PDGF dạng tiết với mức độ cao.
- Khảo sát, xây dựng quy trình thu nhận hPDGF tái tổ hợp có độ tinh sạch cao từ dịch lên men.
72
NỘI DUNG 2
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN hPDGF
73
3.1. Phương pháp
Kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng P. pastoris X33::pdgf-b
Theo khuyến cáo của nhà cung cấp Invitrogen, quy trình biểu hiện protein mục tiêu ở dạng tiết được tiến hành như sau: [19]
- Dùng khuẩn lạc đơn cấy vào 25ml môi trường MGY, BMG (pH 6.0) hay BMGY (pH 6.0) trong erlen 250ml. Ni cấy lắc ở 30oC (200vịng/phút) cho đến khi đạt OD600 = 2 - 6 (pha tăng trưởng, khoảng 16 - 18 giờ).
- Thu tế bào bằng cách ly tâm 1500 - 3000 x g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối trong môi trường BMMY (pH 6.0) với mật độ tế bào ban đầu tương ứng giá trị OD600 bằng 1 để cảm ứng biểu hiện. Việc biểu hiện tiến hành ở 30oC, tốc độ lắc 200vòng/phút.
- Bổ sung methanol để đạt nồng độ cuối 0,5% sau mỗi 24 giờ để duy trì việc cảm ứng.
- Sau mỗi 12 giờ kể từ khi cảm ứng, chuyển 1ml dịch nuôi cấy vào eppendorf 1,5ml để phân tích mức độ biểu hiện và đánh giá thời điểm thu mẫu tối ưu. Ly tâm với tốc độ cao nhất ở nhiệt độ phòng trong 2 - 3 phút.
- Chuyển dịch nổi vào một eppendorf khác. Giữ ở -80oC. Như vậy, theo khuyến cáo của nhà cung cấp, việc biểu hiện protein mục tiêu bằng hệ thống P. pastoris được thực hiện với những thông số sau: Nhiệt độ 30oC, pH 6.0, OD600 ban đầu 1.0, methanol nồng độ cuối 0.5%, tốc độ lắc, tốc độ lắc 200vòng/phút.
Khảo sát các điều kiện biểu hiện trong phịng thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành khảo sát một số nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất hPDGF của chủng P. pastoris X33::pdgf-b.
- Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ hịa tan oxy trong mơi trường, từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng. Đồng thời, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của alcohol axidase, protease cũng như sự ly giải của tế bào chết, là những nhân tố tác động đến hiệu suất sản xuất protein [20, 19, 30]. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ thích hợp cho biểu hiện protein. Quy trình khảo sát nhiệt độ được thực hiện tương tự như quy trình kiểm tra khả năng biểu hiện trình bày ở mục trên, trong 72 giờ, với nhiệt độ được khảo sát ở 30oC và 25oC.
74
- pH
Dù P. pastoris có thể sinh trưởng ở dải pH rộng, từ 3 - 7, nhưng các giá trị pH thấp được chứng minh góp phần ức chế hoạt tính của protease, bảo vệ protein mục tiêu khỏi bị phân hủy khi được tiết ra mơi trường. Quy trình khảo sát pH là quy trình biểu hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất trong 72 giờ với thơng số nhiệt độ là nhiệt độ thích hợp đã khảo sát ở trên. Các giá trị pH được khảo sát là 3, 4, 5, 6.
- Tốc độ lắc