Kiểm tra kiểu hình và kiểu gen của các thể biến nạ- 123docz.net

I. Báo cáo thống kê kết quả thực nghiệm của đề tài

2. Kết quả và thảo luận

2.1.3. Kết quả Biện luận

2.1.3.3. Kiểm tra kiểu hình và kiểu gen của các thể biến nạp

Kiểm tra kiểu hình

Với cấu trúc của vector PICZαA, gene mục tiêu pdgf được chèn tại vùng

MCS, sau promoter AOX1. Do vậy, trong thể nấm men biến nạp gene pdgf sẽ hoạt động dưới sự điều hoà của promoter AOX1, là promoter được cảm ứng bởi methanol.

Chủng P. pastoris hoang dại X33 mang kiểu hình Mut+ do trong bộ gen của chúng chứa 2 gen mã hoá cho enzyme alcohol oxidase, AOX1 và AOX2. Tuy nhiên, khi DNA plasmid được biến nạp vào tế bào P. pastoris, khi dung hợp gene sát nhập vào bộ gene của tế bào chủ, gene AOX1 có thể bị loại bỏ, do vậy kiểu hình của thể biến nạp có thể được thay đổi tùy thuộc vào việc genAOX1 còn tồn tại hay bị loại bỏ. Nếu gene AOX1 khơng bị mất đi, kiểu hình các thể biến nạp thu được là Mut+

(có khả năng tăng trưởng tốt trên mơi trường methanol). Nếu gene AOX1 bị loại bỏ, trong quá trình tái tổ hợp tương đồng, thể nấm men biến nạp sẽ có kiểu hình MutS

(khơng sinh trưởng tốt trên mơi trường có methanol). Đối với q trình biểu hiện protein ngoại lai ở P. pastoris, chủng chủ mang kiểu hình sử dụng methanol khác

nhau sẽ có quy trình biểu hiện khác nhau. Do vậy, cần phải kiểm tra kiểu hình sử dụng methanol của thể biến nạp để chọn quy trình biểu hiện phù hợp.

Nguyên tắc của kiểm tra kiểu hình sử dụng methanol là dựa vào sự phát triển của nấm men trên hai môi trường MD và MM. Môi trường MD là mơi trường tối thiểu có chứa dextrose - nguồn carbon cần thiết cho sự tăng trưởng của nấm men. Trong khi đó, mơi trường MM là mơi trường tối thiểu chứa methanol như nguồn carbon duy nhất, do đó, chỉ các chủng P. pastoris mang gen AOX (AOX1 và AOX2), biểu hiện thành enzyme AOX, giúp biến dưỡng methanol mới có thể tăng trưởng trên môi trường MM. Trong đó, gen AOX1 chiếm phần lớn, khoảng 85%, hoạt tính AOX của tế bào. Vì vậy các thể biến nạp có kiểu hình Mut+ (mang cả hai gen AOX1 và AOX2 sẽ phát triển tốt và đồng đều trên cả hai mơi trường, trong khi đó các thể biến nạp có kiểu hình MutS (chỉ mang gen AOX2) sẽ phát triển tốt trên môi trường MD nhưng lại phát triển kém trên môi trường MM.

Các thể biến nạp được kiểm tra kiểu hình bằng cách ria đồng thời lên môi trường MD và MM. Kiểu hình được xác định dựa vào tốc độ phát triển của chúng trên cả hai môi trường này. Kết quả kiểm tra kiểu hình cho thấy tất cả các chủng nấm men tái tổ hợp X33::pdg fđều có kiểu hình Mut+ (hình 2.4.).

Hình 2.4. Kết quả kiểm tra kiểu hình thể biến nạp

A. môi trường MM, B. môi trường MD

Kiểm tra kiểu gen

Để xác nhận kết quả kiểm tra kiểu hình, DNA bộ gen của các thể biến nạp được tách chiết và thực hiện phản ứng PCR kiểm tra kiểu gen bằng cặp mồi 5’AOX1 – 3’AOX1. Các chủng X33 mang kiểu hình Mut+, trong bộ gen vẫn duy trì gen AOX1 hoạt động bình thường, trong khi các chủng MutS thì gen AOX1 đã bị

loại bỏ. Do vậy khi PCR kiểm tra bộ gen bằng cặp mồi 3’ – 5’ AOX1, các chủng Mut+ sẽ xuất hiện vạch DNA có kích thước khoảng 2,2Kb (genAOX1 có sẵn trong bộ gen của X33) cịn các chủng MutS thì khơng có. Đồng thời đối với các chủng có mang gen pdgf sẽ xuất hiện vạch DNA có kích thước tương ứng 875 bp. Kết quả

kiểm tra kiểu gen các thể biến nạp được trình bày ở hình 2.5 và bảng 2.2

Hình 2.5. Kết quả kiểm tra kiểu gen của thể biến nạp

Giếng 1: Thang chuẩn DNA 1kb plus Giếng 2: chứng âm (khơng có khn) Giếng 3: DNA bộ gen của chủng X33 hoang dại

Giếng 4-10: DNA bộ gen của thể biến nạp theo thứ tự 1-7

Giếng 11: pPICZα/pdgf tách chiết từ DH5α

Kết quả PCR kiểm tra bộ gen các khuẩn lạc tái tổ hợp bằng cặp mồi 3’ – 5’ AOX1 cho thấy ở tất các các dòng đều xuất hiện 2 vạch trên bản điện di. Vạch DNA có kích thước 875bp tương đương kích thước tổng của gen pdgf và vùng gen

AOX1 nằm trên plasmid. Trong khi đó vạch DNA khoảng 2,2Kb tương ứng với gen AOX1 có sẵn trong bộ gen của X33. Vạch này chỉ hiện diện ở các thể Mut+ vốn còn giữ lại gen AOX1 trong khi ở thể MutS thì khơng có. Các chủng này tiếp tục được phân tích nhằm xác định số lượng pPICZα/pdgf được sát nhập vào bộ gen

Từ kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen, chúng tôi đã thu được 20 thể biến nạp Mut+ (bảng 2.2.). Các chủng này tiếp tục được phân tích nhằm xác định số lượng pPICZα/pdgf được sát nhập vào bộ gen.

Bảng 2.2. Thống kê kiểu hình sử dụng methanol của 20 thể biến nạp

Mẫu Mut+ MutS

X33 20 0

Như vậy, chúng tôi đã tạo thành cơng các dịng nấm men P. pastoris tái tổ hợp mang gen pdgf sát nhập vào bộ gen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2,2kb 875bp 2500bp 1000bp 10.000bp 2000bp 750bp 250bp