XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH TINH TRÙNG VÀ PHÔI ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ sinh sản trên gia súc đã và đang được áp dụng ngày càng phổ biến trên thế giới, đặc biệt là trên bò sữa, vì khả năng sinh sản ít với khoảng 3.
XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH TINH TRÙNG VÀ PHƠI ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ sinh sản gia súc áp dụng ngày phổ biến giới, đặc biệt bị sữa, khả sinh sản với khoảng 3-4 bê đời, thường sinh sản suất sữa tăng cao Chăn ni bị sữa VN khuyến khích phát triển mạnh, có khoảng 227 ngàn với 125 ngàn bò vắt sữa (10/2014) quy hoạch phát triển lên 300 ngàn vào năm 2020 Sinh sản bò sữa gặp nhiều vấn đề khó khăn với tuổi phối giống lần đầu cao, biến động lớn (16-36 tháng), khoảng cách lứa đẻ kéo dài (14-18 tháng), hệ số phối đậu cao nhiều bệnh sinh sản Vì vậy, để góp phần giải tình trạng sinh sản đàn bò sữa, việc áp dụng kỹ thuật sinh sản công nghệ cấy truyền phôi, tinh phân tách… cần thiết, nhằm giúp tăng nhanh đàn bò cái, đảm bảo đạt số lượng 300 ngàn vào năm 2020 I Giới thiệu sơ lược NST giới tính Nhiễm sắc thể giới tính gì? Khác tinh trùng X Y Các nhóm trước nói rõ khác tinh trùng X Y Ở cần nắm rõ phần tinh trùng X to nặng tinh trùng Y, tinh trùng Y bơi nhanh X tinh trùng X tích điện (-) cịn Y (+) Khác phôi -Ở động vật lưỡng bội tế bào soma người, có cặp nhiễm sắc thể có mối quan hệ trực tiếp với việc định giới tính, gọi nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể khác thường gọi nhiễm sắc thể thường -Có nhiều lồi giống đực giống có số lượng nhiễm sắc thể giới tính khác nhau, gọi tắt dị số nhiễm sắc thể giới tính Nhiễm sắc thể giới tính có hình dạng khác nhau, khác hình thái chất lượng -Ở người lồi động vật có vú khác, chế xác định giới tính xác định nhiễm sắc thể X Y Giới có kiểu nhiễm sắc thể XX giới đực có kiểu nhiễm sắc thể XY Nhiễm sắc thể XY người có phần tương đồng rõ nằm hai đầu mút nhiễm sắc thể giúp chúng tiếp hợp với q trình giảm phân, cịn phần cịn lại (rất lớn) khơng tương đồng (trên X có gen Y khơng có gen tương ứng) -Năm 1990, nhà khoa học Anh phát gen gọi SRY (sex determining of Y) nằm đầu nhiễm sắc thể Y quy định phát triển tinh hồn Gen quy định prơtêin có chức điều hòa hoạt động gen khác tham gia vào trình hình thành đặc điểm giới tính nam Nếu khơng có gen phơi phát triển buồng trứng hình thành thể nữ -Mặc dù giới tính người động vật có vú khác xác định theo kiểu XX - giới XY - giới đực chế có số điểm khác biệt sau: - Nhiễm sắc thể Y lại giữ vai trò quan trọng việc quy định nam tính người Khi có nhiễm sắc thể Y cho nam giới, khơng có Y nữ giới - Trong hai nhiễm sắc thể X nữ giới có nhiễm sắc thể X hoạt động nhiễm sắc thể bị bất hoạt mặt di truyền (hầu hết gen không hoạt động) Ở ruồi giấm, chế xác định giới tính theo kiểu XX - giới XY - giới đực động vật có vú Tuy nhiên, nhiễm sắc thể Y ruồi giấm lại khơng có chức việc xác định giới tính động vật có vú (có nhiêm sắc thể Y phát triển thành đực, khơng có Y phát triển thành cái) Nếu phơi ruồi giấm có 2X phát triển thành cái, cịn phơi có nhiễm sắc thể X phát triển thành đực Cơ chế xác định giới tính kiểu X - O Ở số loài châu chấu, dế số loài trùng khác, có hai nhiễm sắc thể X cịn đực có nhiễm sắc thể X Giới tính cá thể phụ thuộc vào việc trứng thụ tinh tinh trùng có mang nhiễm sắc thể X hay không Cơ chế xác định giới tính kiểu XX - giới đực XY - giới Ở chim số loài cá số lồi trùng, có nhiễm sắc thể X Y cịn đực có nhiễm sắc thể XX Như vậy, giới tính cá thể phụ thuộc vào nhiễm sắc thể giới tính trứng Nếu trứng có nhiễm sắc thể Y kết hợp với tinh trùng mang X cái, trứng mang nhiễm sắc thể X kết hợp với tinh trùng mang X cho đực Cơ chế xác định giới tính kiểu đơn bội - lưỡng bội Ở hầu hết lồi ong kiến, tế bào khơng có nhiễm sắc thể giới tính riêng giới tính xác định mức bội thể Nếu trứng thụ tinh hợp tử (2n) cho (ong chúa ong thợ) cịn trứng khơng thụ tinh (n) cho ong đực II Mục đích việc xác định giới tính tinh trùng phơi Trong sản xuất nhằm tạo đời có giới tính mong muốn phục vụ sản xuất Trong y học giúp gia đình sinh có giới tính mong muốn (một số nước khơng cho phép việc ảnh hưởng đến cân giới tính) Trong nghiên cứu nhằm phục hồi động vật có nguy tuyệ chủng, tạo nguồn gen mang giới tính xác định phục vụ cho nghiên cứu III Bằng cách thay đổi giới tính theo ý muốn Kiểm sốt giới tính động vật có vú nghiên cứu nhiều chục năm nay, ví dụ kích thích tố mang tính ứng dụng, thay đổi độ PH dịch thể, dinh dưỡng, nguyên tố kim loại khác nhau, thay đổi môi trường đường sinh dục, giết chết làm tác dụng tinh trùng mang nhiễm sắc thể đó… cách thay đổi tỷ lệ giới tính định, khơng đạt mục đích kiểm sốt giới tính hồn tồn Hơn kết thường không ổn định thiếu tính chép Hiện phương pháp kiểm sốt giới tính chủ yếu giám định giới tính phơi thai tinh trùng X, Y Các phương pháp xác định giới tính phơi: - Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST - Phản ứng miễn dịch kháng nguyên chuyên biệt giới tính -Phân tích truyền TB để xác định giới tính 1.Giám định giới tính phơi thai Giám định giới tính phơi thai thường sử dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Đây phương pháp xác định giới tính cách khuếch đại đoạn DNA đặc trưng cho giới tính đực diện NST Y Phương pháp có độ tin cậy cao nhạy tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ Thực chất phương pháp kỹ thuật kiểm tra gen định giới tính nằm nhiễm sắc thể X hay nhiễm sắc thể Y tức sử dụng phận cấu thành gen SRY đoạn đặc biệt nhiễm sắc thể Y làm vật dẫn, điều kiện định tiến hành phản ứng gia tăng PCR, cá thể có khả tăng đoạn mục tiêu đực, ngược lại -PCR( phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) thực chất phương pháp tạo dòng ống nghiệm.Nghĩa thu lượng lớn trình tự xác định Cơ sở PCR đặc tính hoạt động DNA polymerase Các polymerase có khả tổng hợp mạch từ khuôn kể tự đoạn mồi bắt cặp sẵn với khuôn -PCR gồm bước: +Biến tính phân tử DNA +Bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn +Tổng hợp mạch bước lập thành chu kì lặp lại nhiều lần( mục đích để làm tăng tối đa nguyên liệu dùng cho phản ứng nhân bản) =>Hiện nay, kỹ thuật ứng dụng PCR giám định giới tính phơi thai sử dụng rộng rãi, phương pháp đơn giản dễ làm Ngồi phương pháp PCR, cịn có phương pháp huỳnh quan miễn dịch gián tiếp, tìm DNA đặc biệt nhiễm sắc thể Y, phân tích hình thái nhân…, so với phương pháp PCR, phương pháp phát triển chậm tính chuẩn xác khơng cao (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA Bước gọi biến tính, phá vỡ cầu nối hydrogen nối sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hoàn toàn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút (2)Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống để mồi gắn vào sợi DNA đơn Bước gọi gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào đoạn mồi thường thấp nhiệt độ biến tính 50 °C (45-60 °C) Sử dụng sai nhiệt độ giai đoạn dẫn đến việc đoạn mồi khơng gắn hồn tồn vào DNA mẫu, hay gắn cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Bước gọi kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian bước phụ thuộc vào DNA-polymerase chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như quy tắc …, 1000bp/ phút *PCR để xác định vân tay, kiểm tra huyết thống, chẩn đốn bệnh di truyền, tách dịng gen 2.Kỹ thuật phân tách tinh trùng X tinh trùng Y Phân tách tinh trùng X, Y dùng thụ tinh nhân tạo phương pháp đơn giản có tính khả thi cao nhất.Tinh trùng X tinh trùng Y có chút khác mật độ, thể tích, đặc tính vận động, xung điện, kháng nguyên bề mặt hàm lượng DNA, theo nhiều cách phân tách tinh trùng mà người tạo ra, chia phương pháp phân tách tinh trùng thành phân tích vật lý, phương pháp miễn dịch phương pháp phân tích tế bào dịng chảy (Flow Cytometry) A Phương pháp phân tách tinh trùng Flow Cytometry (phân tích tế bào dịng chảy) Phương pháp phân tách tinh trùng Flow Cytometry (phân tích tế bào dịng chảy) phương pháp khác biệt hàm lượng DNA hai loại tinh trùng X Y để tiến hành phân tách Thông thường, nhiễm sắc thể tinh trùng X lớn nhiễm sắc thể tinh trùng Y, có hàm lượng DNA cao người, khác 2.8%, gia súc 3-4.2%, ví dụ lợn 3.6%, bị 3.8% Phương pháp thực hiện, nhuộm màu tinh dịch nhiên liệu huỳnh quang hoạt thể Hoechst33342 Cho dung dịch vào máy, tạo thành dòng chảy hệ thống ống liên hợp khép kín máy Đầu tiên, dung dịch qua tạo giọt, nhờ xung điện, dung dịch tạo thành nhiều giọt nhỏ nối tiếp mà giọt có chứa tinh trùng, chứa vật thể khác có dung dịch (có lẽ cách hoạt động mà người ta đặt tên cho máy) Tiếp theo, dòng giọt qua chiếu tia lazer, tuỳ theo mức độ nhuộm màu mà giọt hấp phụ phát sáng từ tia lazer khác nhau, giọt chứa tinh trùng X phát sáng nhiều so với giọt chứa tinh trùng Y Những giọt khác không hấp phụ màu không phát sáng Sau chiếu tia lazer, dòng giọt qua tích điện, tuỳ theo mức độ phát sáng giọt mà tích điện âm (–) điện dương (+); giọt khác không phát sáng không tích điện Cuối chúng chảy qua phân tách, lúc giọt mang điện tích – (chứa tinh trùng X) chảy phía cực + đổ vào cốc chứa tinh trùng cái; giọt mang điện tích + (chứa tinh trùng Y) phía cực – đổ vào cốc chứa tinh trùng đực; giọt cịn lại, khơng mang điện tích (khơng chứa tinh trùng) chảy thẳng, rơi vào cốc chứa chất thải Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll dựa theo kích thước khác nhiễm sắc thể X nhiễm sắc thể Y động vật có vú để tiến hành phân tách (cũng phản ánh khác mật độ hai loại tinh trùng) Percoll chất dẫn gradient mật độ, khơng có màng tế bào, không gây hại cho tinh trùng Phương pháp thực hiện, dùng dung dịch sinh lý phù hợp để tinh trùng sống sót trộn với Percoll thành dung dịch gradient mật độ không liên tục 7-12 lớp, từ lên trên, dung dịch ngấm dần vào lớp tâm quản, hình thành ống phân tách, cho tinh dịch pha loãng vào ống phân tách, sau thời gian tốc độ định, tinh trùng dồn vào lớp dung dịch gradient lớp đáy ống phân tách, tinh trùng tầng thấp chứa nhiều tinh trùng X, tinh trùng tầng cao chứa nhiều tinh trùng Y ... thể giới tính riêng giới tính xác định mức bội thể Nếu trứng thụ tinh hợp tử (2n) cho (ong chúa ong thợ) trứng không thụ tinh (n) cho ong đực II Mục đích việc xác định giới tính tinh trùng phôi. .. giới tính -Phân tích truyền TB để xác định giới tính 1.Giám định giới tính phơi thai Giám định giới tính phôi thai thường sử dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Đây phương pháp xác định. .. tách tinh trùng X tinh trùng Y Phân tách tinh trùng X, Y dùng thụ tinh nhân tạo phương pháp đơn giản có tính khả thi cao nhất .Tinh trùng X tinh trùng Y có chút khác mật độ, thể tích, đặc tính