KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG VÀ ỨNG DỤNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC VĂN LANG ==== =================================================================================================================================================================Đề tài KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG, CÁC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC VĂN LANG ==== Đề tài: KỸ THUẬT ĐƠNG LẠNH TINH TRÙNG Nhóm: 03 Lớp: K20S2, Khoa CNSH GVHD: ThS.Trần Thị Minh Năm học: 2016-2017 Thành viên Nguyễn Ngọc Anh Thư Huỳnh Yến Phượng Trần Thị Hồng Đào Phạm Tuấn Anh Trần Nguyễn Quỳnh Như Hồ Thị Xuân Viên Trương Thị Ngọc Anh Lê Thị Thùy Anh Phạm Hồng Tố Qun Nợi dung I Khái niệm - Mục đích II Đặc điểm sinh học tinh trùng III Bảo quản tinh trùng Bước 1: Chuẩn bị tinh trùng Phương pháp Swim Up .6 Phương pháp gradient nồng độ Bước 2: đông lạnh tinh trùng 10 Môi trường đông lạnh .10 Cách 1: Hạ nhiệt độ chậm 11 Cách 2: Phương pháp thủy tinh hóa 14 IV Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công đông lạnh tinh trùng 15 V Một số thành công phương pháp đông lạnh tinh trùng 15 KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG I Khái niệm - Mục đích Khái niệm: Đông lạnh tinh trùng kỹ thuật bảo quản tinh trùng nhiệt đợ cực thấp để lưu trữ tinh trùng một thời gian dài Mục đích: - Đợng vật: nhằm lai tạo đàn giống với suất cao lưu trữ bảo tồn lâu dài nguồn gen quí - Người: lưu trữ khả sinh sản thời gian dài Đối tượng cần đông lạnh tinh trùng? - Những bệnh nhân ung thư định trữ lạnh tinh trùng trước bắt đầu điều trị bệnh họ phải xạ trị, hóa trị Tất nam giới chuẩn đốn ung thư tinh hồn khuyên trữ tinh trùng trước điều trị bệnh nhân có lượng tinh trùng bình thường, hóa trị, xạ trị ảnh hưởng nhiều đến khả sinh sản bệnh nhân - Người đàn ơng muốn triệt sản lấy tinh trùng để bảo quản phịng muốn có sau - Trữ lạnh cho vợ điều trị muộn Trữ lạnh tinh trùng định để tránh trường hợp vợ chọc hút noãn hay chuẩn bị nỗn mà khơng có tinh trùng để sử dụng - Người làm công việc liên quan đến môi trường đợc hại ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng Hiện tình trạng nhiễm mơi trường, thực phẩm bẩn lối sống không lành mạnh ảnh hưởng nhiều đến khả sinh sản - Các trường hợp hiến tinh trùng trữ lạnh ngân hàng tinh trùng để cung cấp cho trường hợp có nhu cầu xin tinh trùng Điều kiện để đông lạnh tinh trùng? Theo quy định, người cung cấp mẫu tinh trùng để đông lạnh phải 40 tuổi, gia đình đời khơng mắc bệnh di truyền Anh ta phải xét nghiệm HIV, viêm gan, giang mai, đặc biệt xét nghiệm nhiễm sắc thể Trên nguyên tắc, người hiến một lần đảm bảo giữ kín thơng tin cá nhân II Đặc điểm sinh học tinh trùng Tinh trùng dài khoảng 50 - 60 µm có phần: đầu, thân đuôi Đầu tinh trùng Giống giọt nước dẹt Đầu tinh trùng chứa nhân Nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội gồm 23 nhiễm sắc thể có nhiễm sắc thể giới tính (X Y) Khoảng 2/3 đầu tinh trùng bao phủ thể cực đầu Thể cực đầu chứa nhiều enzyme hyaluronidase, neuramidase proterase khác, enzyme có tác dụng tiêu hủy chướng ngại vật xung quanh trứng lớp màng trứng để tinh trùng xâm nhập vào bên trứng thụ tinh trứng Thân tinh trùng Thân tinh trùng chứa nhiều ti thể thực chức chuyển hóa để cung cấp ATP cho vận động tinh trùng Đuôi tinh trùng Đi vận đợng giúp đẩy tinh trùng tiến phía trước Đuôi mỏng thon dần giúp cho tinh trùng quẫy di chuyển thuận lợi - Sức sống tinh trùng phụ thuộc áp suất thẩm thấu, độ pH, nhiệt độ, ánh sáng chất hóa học có tinh dịch Là sở để chế dung dịch bảo tồn có thành phần điểu kiện tương tự tinh dịch III Bảo quản tinh trùng Bước 1: Chuẩn bị tinh trùng Chuẩn bị tinh trùng dùng biện pháp kỹ thuật để tách tinh trùng khỏi tinh dịch, kỹ thuật dùng để thu nhận tinh trùng có chất lượng tốt Tại phải tách tinh trùng khỏi tinh dịch? Phần tinh dịch có chức trung hịa bảo vệ tinh trùng khỏi môi trường acid âm đạo, ổn định nuôi dưỡng tinh trùng Tuy nhiên người ta thấy có ảnh hưởng xấu tới khả thụ tinh tinh trùng, làm giảm sức sống, độ di động tinh trùng, tinh dịch chứa chất ngăn chặn hoạt hóa đầu tinh trùng, chứa loại vi khuẩn gây bệnh thường trú đường sinh dục nam Thông thường tinh trùng chuẩn bị phương pháp swim up gradient  Phương pháp Swim Up o Nguyên tắc: Chỉ tinh trùng di động tốt tự bơi lên thoát khỏi lớp tinh dịch phía o Điều kiện thực hiện: + Mẫu tinh trùng di động tốt + Độ nhớt không cao o Môi trường sử dụng: Ferticult Flushing o Phương pháp thực hiện: + Cho vào ống nghiệm 1,5ml môi trường cấy + Cho 1ml tinh dịch thật nhẹ nhàng xuống đáy lớp môi trường + Đặt ống nghiệm tủ cấy 45 - 60 phút, nghiêng 45 để tăng bề mặt tiếp xúc lớp tinh dịch môi trường nuôi cấy + Dùng Pipette pasteur hút khoảng 0,7-1ml mơi trường trên, cho vào ống nghiệm 5ml có sẵn 2ml môi trường nuôi cấy, trộn + Đem ly tâm 1200 vòng/phút 10 phút + Hút bỏ phần mơi trường phía trên, chừa lại 0,3-0,4ml cặn + Trộn phần cặn, lấy giọt cho vào buồng đếm kiểm tra mật độ độ di động + Phần cịn lại sẵn sàng thực kỹ thuật o Ưu điểm: + Đơn giản, dễ làm, rẻ tiền + Tinh trùng thu có chất lượng cao (>90% tinh trùng di đợng) + Tinh trùng có tỷ lệ hình dạng bình thường cao, lẫn chất cặn tế bào khác Nhựơc điểm + Chỉ áp dụng với mẫu tinh trùng tương đối tốt + Không thu hết số tinh trùng di động  Phương pháp gradient nồng độ - Là phương pháp dùng để tách tinh trùng có khả di đợng khỏi tinh dịch cặn tế bào dựa khả lọc qua thang nồng độ khác - Trong phương pháp này, tinh dịch ly tâm thang nồng đợ chứa hạt silica dạng keo, hạt giúp phân tách tinh trùng dựa tỉ trọng chúng O Điều kiện: + Thực với mẫu tinh trùng yếu + Độ nhớt cao o Phương pháp: - Pha dung môi percoll đẳng trương 40% 80% - Cho lớp dung môi percoll 40% 80% vào ống nghiệm: lớp 1.5ml, lớp 80% - Cho khoảng 1,5ml tinh dịch lên lớp percoll thật nhẹ nhàng - Ly tâm 1500 vòng/ 1’ 15 phút Tinh trùng bình thường có tỷ trọng lớn tập trung đáy ống nghiệm Các tinh trùng chết, dị dạng, di động thành phần tinh dịch có tỷ trọng nhỏ + Thu cặn rửa tinh trùng Cách rửa tta - Cặn thu cho vào ống nghiệm chứa 2ml môi trường - Ly tâm 1000 vòng/1’ - Hút bỏ lớp môi trường trên, trộn lại với môi trường - Rửa lần với môi trường cấy để loại bớt percoll - Ưu điểm: + Đơn giản, dễ thực + Thực với mẫu tinh trùng yếu o Nhược điểm: + Tinh trùng thu yếu so với tinh trùng phương pháp Swim up Bước 2: đông lạnh tinh trùng  Môi trường đông lạnh Thành phần môi trường bảo quản bao gồm: - Đường: cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng sống vận động, bảo vệ màng tinh trùng, tránh tượng tinh trùng bị tụ dính Có thể dủng đường glusoce, fructose, sacarose… - Muối: trì áp suất thẩm thấu cho tinh trùng có tác dụng đệm để ổn định pH môi trường Thường dùng muối natricitrat, natrikalitartrat Muối Trilon B (EDTA-B2) dùng để bảo tồn tinh dịch lợn 0C - Chất kháng sinh: vi sinh vật phát triển nhanh tinh dịch làm thay đổi đặc điểm lý hóa mơi trường sống tinh trùng cướp chất dinh dưỡng làm tinh trùng bị chết nhanh chóng Bổ sung chất kháng sinh vào mơi trường cần thiết Tuy nhiên chất kháng sinh định tính, định lượng phải vơ hại với tinh trùng Người ta thường bổ sung chất kháng sinh penicillin, streptomycin, tetracyline - Chất chống đông lạnh: nhiệt đợ thấp, q trình sống vận đợng, trao đổi chất tinh trùng bị ức chế nên kéo dài thời gian sống tinh trùng thể Song nhiệt độ thấp dễ làm tinh trùng bị sốc Để bảo tồn tinh dịch cần bổ sung chất chống lạnh vào mơi trường + Lịng đỏ trứng gà: chứa nhiều lecitine (7%) lipit có tác dụng bảo vệ tinh trùng, chống lại tượng sốc lạnh, làm tăng độ nhớt, độ dinh dưỡng cho môi trường Lecitine có khả chống lạnh cho tinh trùng cấu trúc phần tử có phần ưa nước phần kị nước, phần ưa nước bị hydrat hóa, phần kỵ nước khơng bị hydrat hóa liên kết với tạo thành hệ lưới vi thể dung dịch làm giảm hệ số tăng nhiệt mơi trường Do mà tinh trùng đỡ bị sốc nhiệt + Glycerin: có mặt glycerin làm hệ số truyền nhiệt bị giảm nhiều Glycerin cịn có tác dụng bảo vệ màng tế bào, ngăn ngừa tượng nước, giúp tế bào tránh tượng hóa đá điều kiện lạnh sâu Mơi trường đông tinh thường hay dùng Sperm freeze Đây mợt chất bảo quản đơng lạnh có nồng đợ cao, sử dụng để hạn chế ảnh hưởng q trình làm lạnh lên tế bào Sperm freeze có khả tan nước, tạo liên kết hydro với phân tử nước có khả xâm nhập vào bên tế bào thay cho nước bên tế bào, giúp làm giảm hình thành tinh thể nước đá bên tế bào giảm tổn thương gây nên tinh thể nước đá  Có cách đông lạnh tinh trùng Cách 1: Hạ nhiệt độ chậm Đông lạnh tinh trùng nitơ lỏng nhiệt độ -196C Ở nhiệt độ này, tế bào tinh trùng bị ngưng họat động – “chết giả” – tất họat động chủ yếu tạm dừng rã đông Sau rã đông, tinh trùng “hồi sinh” – quay trở trạng thái trước trữ Trữ lạnh tinh trùng không làm thay đổi hay thiệt hại mặt di truyền 1 Đánh giá mẫu tinh dịch - Tinh trùng thu được đặt tủ ấm để mẫu ly giải, thông thường khoảng 30 phút - Mẫu tinh trùng kiểm tra cẩn thận phịng lab với điều kiện vơ trùng Mẫu đạt chuẩn đơng tinh thơng báo cho chủ nhân để hoàn thiện hồ sơ trước đặt vào bình bảo quản.   Bổ sung mơi trường đơng tinh Cho giọt môi trường vào tinh dịch với tỉ lệ 1:1 Cẩn thận nghiêng ống tinh dịch lần nhỏ mơi trường Đóng nắp thật chặt lắc 20 lần, không để tạo bọt Để nhiệt độ phịng Đánh số, tên người đơng lạnh tinh trùng vào cryotube Sau tạo thành hỗn dịch đồng nhất, hỗn dịch cho vào cryotube Đông lạnh Làm lạnh chậm với nitơ lỏng để tránh tượng sốc nhiệt, giảm hình thành tinh thể bên tế bào, giảm tổn thương bào quan Đặt cryotube thẳng đứng xốp, xốp để bồn nito lỏng, tốc độ làm lạnh khoảng 10 C/phút (nếu sử dụng máy hạ nhiệt độ tự đợng khơng cần thực bước tốc độ làm lạnh cài đặt sẵn) Trữ lạnh tinh trùng Sau mẫu làm lạnh xuống -50C -80C cho vào nitơ lỏng -196C để trữ lạnh lâu dài Đây một mẫu đơng tinh bình nito lỏng Chúng đánh số, tên cẩn thận Mỗi tuýp nhỏ chứa khoảng 1,8 ml tinh trùng Khi cần để thụ tinh nhân tạo, thụ tinh ống nghiệm, bác sĩ cần sử dụng mợt nhỏ Chi phí lần thực kỹ thuật đông tinh 1,5 triệu đồng Phí gia hạn đơng tinh hàng năm 1,5 triệu đồng Phương pháp hạ nhiệt đợ chậm dẫn đến hình thành tinh thể nước đá bên tế bào hạ nhiệt độ từ -50C đến -150C Đây nguyên nhân gây vỡ màng suốt vỡ tế bào Chính mà phương pháp thủy tinh hóa (hạ nhiệt đợ nhanh) dần thay phương pháp Cách 2: Phương pháp thủy tinh hóa - Thủy tinh hóa q trình làm lạnh tinh trùng với thời gian nhanh Trong suốt trình hạ nhiệt đợ tồn bợ khối vật chất bên bên tế bào chuyển thành dạng khối đặc, suốt giống thủy tinh, đặc biệt khơng có hình thành tinh thể đá bên mẫu tế bào mơi trường bên ngồi q trình đơng lạnh Mẫu tinh trùng nhúng trực tiếp vào nito lỏng, khơng qua q trình hạ nhiệt đợ theo bước đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh phương pháp lớn, khoảng 20002500C sử dụng chất bảo vệ đông lạnh với nồng độ cao chất bảo vệ đông lạnh phương pháp hạ nhiệt độ chậm - Ưu điểm: nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng phương pháp đông lạnh chậm trước => giúp cho trình khử nước bên tế bào xảy nhanh Kết khơng có hình thành tinh thể đá bên tế bào, nhờ mà tế bào tránh tổn thương màng, bào quan tinh thể đá gây Phương pháp cho tỉ lệ sống sau rã đông cao nhiều so với phương pháp hạ nhiệt độ chậm - Nhược: Địi hỏi người thực phải thục xác kỹ thuật cao So sánh kĩ thuật Hạ nhiệt đợ chậm Thủy tinh hóa Lượng nito cần sử dụng 10 lít 0.5 lít Thời gian Khoảng (quá trình 15-20 phút nước cần diễn từ từ để hạn chế hình thành tinh thể đá Do thời gian để hồn tất q trình đơng lạnh kéo dài gấp 10 lần so với phương pháp thủy tinh hóa) Hệ thống hạ nhiệt tự đợng Cần (Để đảm bảo Khơng tốc độ hạ nhiệt, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt đợ tự đợng Chi phí đầu tư cho hệ thống cao, chưa kể đến chi phí Tỷ lệ sống sau rã đơng IV bảo trì sửa chữa hàng năm) Thấp phương pháp thủy tinh hóa Cao phương pháp hạ nhiệt đợ chậm Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công đông lạnh tinh trùng Các yếu tố giúp tinh trùng tồn sau đông lạnh: - Chất lượng tinh trùng: Số lượng tinh trùng di chuyển tốt trước tiến hành đông lạnh nhiều làm tăng tỷ lệ sống sót tinh trùng - Thành phần môi trường: Gồm chất đệm, chất chống lạnh cho tinh trùng (để tăng khả kháng lạnh, hạn chế tối đa tượng sốc nhiệt)… Nếu pha chế môi trường không phù hợp làm giảm hoạt lực, tăng tỷ lệ chết tinh trùng - Nhiệt độ đông lạnh Việc giảm nhiệt độ gây một số thay đổi xuất trạng thái hóa băng bên lẫn bên tế bào Đặc biệt việc hóa băng bên tế bào làm cho tinh trùng chết Do đó, việc điều chỉnh giảm nhiệt đợ mợt cách thích hợp giúp cho tinh trùng không bị chết V Một số thành công phương pháp đông lạnh tinh trùng Cậu bé sinh từ tinh trùng "già" giới Alex Powell – cha đứa bé – bị mắc bệnh ung thư, cần phải hóa trị Việc điều trị khiến anh bị vơ sinh Chính thế, Alex định đông lạnh tinh trùng năm 15 tuổi để có sau 23 năm sau, tinh trùng “rã đông”, thụ tinh nhân tạo Bé trai Xavier Powell kỷ lục Guinness công nhân đứa bé đời từ tinh trùng nhiều tuổi giới Chồn chân đen sinh từ tinh trùng đông lạnh Những chồn bên bờ vực tuyệt chủng thụ tinh nhân tạo tinh trùng đơng lạnh hai đực chết (hình) Chồn chân đen tuần Chồn sinh ngày 21/6/2008, chồn mẹ năm tuổi chồn bố chết năm 2000 Đông lạnh tinh trùng giúp cho việc bảo tồn gây giống lồi thú có nguy tuyệt chủng 3 Xây dựng ngân hàng tinh trùng Nhiều ngân hàng tinh trùng xây dựng, điển ngân hàng tinh trùng Cryos International Đan Mạch Ngân hàng gửi tinh trùng đến 80 quốc gia 27.000 em bé sinh nhờ người hiến tặng  ... phương pháp đông lạnh tinh trùng 15 KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH TRÙNG I Khái niệm - Mục đích Khái niệm: Đơng lạnh tinh trùng kỹ thuật bảo quản tinh trùng nhiệt độ cực thấp để lưu trữ tinh trùng mợt... tương tự tinh dịch III Bảo quản tinh trùng Bước 1: Chuẩn bị tinh trùng Chuẩn bị tinh trùng dùng biện pháp kỹ thuật để tách tinh trùng khỏi tinh dịch, kỹ thuật dùng để thu nhận tinh trùng có chất... nhập vào bên trứng thụ tinh trứng Thân tinh trùng Thân tinh trùng chứa nhiều ti thể thực chức chuyển hóa để cung cấp ATP cho vận đợng tinh trùng Đuôi tinh trùng Đuôi vận động giúp đẩy tinh trùng