Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật doc

Experimental Methods 2006 2Mục tiêu • Sau khi học bài này, sinh viên có thể: – Thế nào là nuôi cấy mô và các kiểu nuôi cấy mô – Ứng dụng của nuôi cấy mô – Thuận lợi và bất lợi của mỗi k

Giới thiệu về nuôi cấy tế

bào động vật

Phạm văn Phúc

PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc

Bộ môn Động vật-Sinh lí Động vật

Experimental Methods 2006 2

Mục tiêu

• Sau khi học bài này, sinh viên có thể:

– Thế nào là nuôi cấy mô và các kiểu nuôi cấy mô

– Ứng dụng của nuôi cấy mô

– Thuận lợi và bất lợi của mỗi kiểu nuôi cấy mô

– Một số khái niệm cơ bản

Experimental Methods 2006 3

Nuôi cấy mô là gì?

• Nuôi cấy In vitro (duy trì và/hay tăng sinh) các tế bào, mô và các cơ quan

• Các kiểu nuôi cấy mô

– Nuôi cấy cơ quan

– Nuôi cấy mô

– Nuôi cấy tế bào

Experimental Methods 2006 4

Nuôi cấy cơ quan

• Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể

• Thuận lợi

– Chức năng sinh lí bình thường được duy trì

– Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn

Experimental Methods 2006 5

Nuôi cấy mô

• Các mảnh của mô được phát triển trong môi

trường nuôi cấy

• Thuận lợi

– Một số chức năng bình thường được duy trì

– Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)

• Bất lợi

– Tổ chức ban đầu của mô mất

Experimental Methods 2006 6

Nuôi cấy tế bào

• Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết

là bằng enzyme, thành huyền phù tế bào được nuôi cấy in vitro như monolayer hay nuôi cấy huyền phù

EMP04 7

Experimental Methods 2006 8

Tại sao cần nuôi cấy mô?

• Nghiên cứu

– Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như:

• Các tác động của các mô xung quanh

• Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật

– Giảm các động vật sử dụng

• Sản xuất các sản phẩm thương mại

– vaccine, antibody, hormone

– Tế bào sử dụng cho cấy ghép

Các kiểu nuôi cấy tế bào

1 Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)

– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu

như

• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy

• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

• Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức

• Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

2 Nuôi cấy thứ cấp

– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp

• Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy

tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy

– Thường chứa kiểu êế bào đơn

– Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ

– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

• Dòng tế bào

• Dòng tế bào liên tục

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Experimental Methods 2006 12

1) Dòng tế bào

• Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần

cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia)

• Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ

biệt hóa

• Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng

Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Experimental Methods 2006 13

2) Dòng tế bào liên tục

• Có thể tăng sinh không hạn định

• Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:

Experimental Methods 2006 14

Chuyển dạng (Transformation)

Và Chuyển nhiễm (Transfection)

– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay

đổi DNA và sự biểu hiện gen

Experimental Methods 2006 15

Khởi sự một nuôi cấy

Mô

Nuôi cấy tế bào sơ cấp

Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục

Phân tách

Cấy chuyền

Hạn định số lượng Không hạn định số lượng

Experimental Methods 2006 16

Hình dạng tế bào khi nuôi

• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:

– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)

• Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)

– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi

• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial

MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal

BAE1-Endothelial

Experimental Methods 2006 17

Special types of Cell culture

Cells in the culture can be grown to

adopt in vivo characteristic

Experimental Methods 2006 18

Sinh học của tế bào nuôi cấy

• Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc:

– Trạng thái tự nhiên của tế bào

– Môi trường nuôi cấy

Experimental Methods 2006 19

Chu kì tế bào

M Mitosis

G1 Gap1

G2 Gap2

G0

S Synthesis

Metaphase check point

• chromosome align on spindle

Experimental Methods 2006 20

Chu kì tế bào

• Interphase:

– Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú

– Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích

thước

• Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia

• Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có

1 G1 Checkpoint

• S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra

• Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới

Có 1 G2 Checkpoint

• Mitosis hay M Phase:

– Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng

– Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.

– Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ

– Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase

Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia.

Experimental Methods 2006 22

Nhân tố ảnh hưởng đến sự

biệt hóa

• Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các

chức năng tế bào bình thường

• Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào:

• Các phân tử bám dính tế bào:

– Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins– Tương tác tế bào-chất nền: integrin,

transmembrame proteoglycan

• Phức hợp nối chặt (Tight junctional

complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào.

Experimental Methods 2006 25

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào

Experimental Methods 2006 26

Pha rắn

• Tế bào cần bám dính vào một giá thể

để sinh trưởng và di chuyển

• Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene

plastic

• Những cơ chất khác như glass, filter

wells

• Bề mặt có têể được xử lí với:

– Phủ với cơ chất nền như Collagen,

poly-l-lysine, matrigel

– Lớp feeder: monolayer of supporting cells,

perhaps promote cell growth and

differentiation by cell contact and

substance secreted

• Neurons on glial cell feeder layers

Experimental Methods 2006 27

Phase lỏng

• Thành phần của môi trường

– Muối vô cơ

• Cân bằng áp suất thẩm thấu

• Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium

và calcium ions

• Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor

– Carbohydrate

• Hầu hết chứa 4-20 mM glucose

• Nguồn năng lượng: glycolysis

Experimental Methods 2006 28

Phase lỏng

– Proteins and Peptides

• Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg transferrin, fibronectin

– Amino acids

• Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa

• glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle

– Fatty Acids and Lipid

• Quan trọng trong môi trường serum free

media e.g cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt

• Tiền chất cho các co-factors

• Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin

Experimental Methods 2006 30

Phase lỏng

– Hệ đệm

• Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4

• Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:

– Hệ thống đệm bicarbonate/CO2– Hệ đệm hóa chất: HEPES

• Môi trường nuôi cấy thương mại như pH

Experimental Methods 2006 31

Phase lỏng

– Huyết thanh

• Nhân tố không xác định: albumins, growth

factors và growth inhibitors

• Gia tăng khả năng đệm

• Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc

• Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp

• Biến thiến từng mẻ

• Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm

NAD+ NADH

+ CO2

Pyruvate Dehydrogenase

pyruvate acetyl-CoA

Experimental Methods 2006 33

Nhiệt độ

– Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài

• Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận

• Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body)

• Hóa chất và môi trường

Experimental Methods 2006 35

Đông lạnh dòng tế bào

• The aim of cryopreservation is to enable stocks

of cells to be stored to prevent the need to have all cell lines in culture at all times

• Reduced risk of microbial contamination

• Reduced risk of cross contamination with other cell lines

• Reduced risk of genetic drift and morphological changes

• Work conducted using cells at a consistent

passage number

• Reduced costs (consumables and staff time)

Đông lạnh dòng tế bào

Method Advantages Disadvantages

Electric (-135ºC) Freezer  Ease of maintenance

 Steady temperature

 Low running costs

 Requires liquid nitrogen back-up

 Mechanically complex

 Storage temperatures high relative to liquid nitrogen

Liquid Phase Nitrogen  Steady ultra-low

(-196ºC) temperature

 Simplicity and mechanical reliability

 Requires regular supply

of liquid nitrogen

 High running costs

 Risk of contamination via the liquid nitrogen

cross- - 196ºC

Vapor Phase Nitrogen

 No risk of contamination from liquid nitrogen

cross- Low temperatures achieved

 Simplicity and reliability

 Requires regular supply

of liquid nitrogen

 High running costs

 Temperature fluctuations between - 135ºC and - 190ºC