Bài viết Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu Bạch truật nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu Bạch truật. Bạch truật - tên khoa học Atractylodes macrocephala Koidz, cây thảo, sống lâu năm, cao 40 – 60 cm. Rễ Bạch truật được sử dụng làm dược liệu.
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO DƯỢC LIỆU BẠCH TRUẬT GS,TS.DS Phạm Xuân Sinh, TS.DS Hoàng Lê Sơn, ThS.DS Nguyễn Văn Hanh, ThS.DS Võ Tự Cường Khoa Y Dược - Trường Đại học Thành Đơng TĨM TẮT Chuyên đề nằm khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước, Mã số: 10/2017/HĐ-NVQG, ngày 20 tháng 10 năm 2017: “Nghiên cứu khai thác phát triển nguồn gen Bạch truật (Atractylodes macrocephala Koidz.) sâm Bố Chính (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc Đắk Lắk số tỉnh Tây Nguyên” Mục tiêu chuyên đề nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Bạch truật Bạch truật - tên khoa học Atractylodes macrocephala Koidz, thảo, sống lâu năm, cao 40 – 60 cm Rễ Bạch truật sử dụng làm dược liệu Nghiên cứu xây dựng TCCS cho dược liệu Bạch truật với tiêu giữ nguyên DĐVN V: Mô tả, vi phẫu, đặc điểm bột, độ ẩm, tro toàn phần, chất chiết được, định tính phương pháp sắc ký mỏng; Các tiêu giữ nguyên DĐVN Hong Kong: tro không tan acid; Các tiêu thay đổi, bổ sung: Dấu vân tay; Bổ sung tiêu 04 kim loại nặng (As, Pb, Cd, Hg), Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Benzen hexaclorid (BHC); Chỉ tiêu định lượng atractylenolide III (HPLC) qui định hàm lượng atractylenolide III ≥ 0,019 %; Phương pháp định lượng thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH Từ khóa: Tiêu chuẩn sở, dược liệu Bạch truật ABSTRACT This topic is a part of the State-level project with Code: 10/2017/ HĐ-NVQG dated on October 20, 2017: “Research, exploitation and development of Atractylis gene resources (Atractylodes macrocephala Koidz.) and Bo Chinh ginseng (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.) as raw materials for drug production in Dak Lak and some provinces in Tay Nguyen" The objective of the topic is to study and develop basic standards for atractylis herbal medicine Atractylis, scientific name Atractylodes macrocephala Koidz, is herbaceous, perennial, 40-60 cm high Atractylis root is used medicinally The research has established the TCCS for atractylis herbal medicine with the criteria keeping the same DVVN V: Description, microsurgery, powder characteristics, moisture, total ash, extractable substances, qualitative by thin layer chromatography method; The criteria to keep the Hong Kong DĐVN unchanged: ash insoluble in acid; Indicators changed and supplemented: Fingerprints; Adding indicators of 04 heavy metals (As, Pb, Cd, Hg), Residues of pesticides: Benzene hexachloride (BHC) Quantitative criteria of atractylenolide III (HPLC) specify atractylenolide III content ≥ 0.019 % The quantitative method was validated according to the ICH guidelines Keywords: basic standards, Atractylis herbal medicine MỞ ĐẦU macrocephala Koidz.) sâm Bố Chính Bạch truật có tên khoa học (Abelmoschus sagittifolius) (Kurz Merr.) Atractylodes macrocephala Koidz Cây thảo, sống lâu năm, cao 40 – 60 cm Bạch truật xuất xứ từ Trung Quốc, làm nguyên liệu sản xuất thuốc Đắk trồng nhiều Triết Giang, Hồ Nam Cây nhập vào Việt Nam đầu năm 2017, Bạch truật thu hái Đắk Lắk làm nguyên liệu nghiên cứu năm 60 trồng Sa Pa (Lai Châu), Bắc Hà (Lào Cai) Đến đầu làm thuốc Trong chuyên đề này, nhóm nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở năm 70, đưa trồng cho dược liệu Bạch truật với nội dung: Lắk số tỉnh Tây Nguyên”, Mã số: 10/2017/HĐ-NVQG, ngày 20 tháng 10 sản xuất vùng ngoại thành Hà Nội tỉnh lân cận Bạch truật thích nghi cao với khí hậu vùng nhiệt đới núi cao, chịu khí hậu lạnh, có tới 0oC thấp - Mô tả dược liệu, vi phẫu, đặc điểm bột, độ ẩm, tro tồn phần, định tính sắc ký mỏng (Áp dụng DĐVN V); Bạch truật dùng theo kinh nghiệm dân gian vị thuốc bổ dưỡng dùng để điều trị chứng bệnh đau dày, bụng trướng đầy, nôn mửa, chậm dụng DĐVN Hong Kong) tiêu, thấp nhiệt, tiêu chảy, phân sống, viêm ruột mạn tính, an thai trường hợp có thai đau bụng, ốm nghén nôn ọe, chữa sốt trường hợp sốt mồ hôi, phù thũng Liều dùng hàng ngày thực vật - Tro không tan acid (Áp - Định lượng hoạt chất chất - Xác định dư lượng kim loại nặng (As, Pb, Hg, Cd); dư lượng thuốc bảo vệ 2.TỔNG QUAN VỀ BẠCH TRUẬT 2.1 Mơ tả, phận dùng Bạch truật có tên khoa học Atractylodes macrocephala Koidz Cây thảo, sống lâu năm, cao 40 – 60 cm Thân hình trụ, mọc đứng, phía phân nhánh, phía hóa gỗ Lá mọc so le, phía có cuống dài, xẻ sâu thùy; khoảng – 12 g dạng thuốc sắc thuốc bột Các nghiên cứu dược lý Bạch truật có tác dụng chống loét dày mơ hình thực nghiệm làm giảm rõ rệt lượng dịch vị tiết gần có cuống ngắn, khơng chia thùy, mép có khía Cụm hoa mọc đầu cành, đầu gồm nhiều hoa hình Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu khai thác phát triển nguồn gen Bạch truật (Atractylodes ống màu tím Quả bế, hình cầu, 2.2 Thành phần hóa học bầu dục, dẹt Rễ Bạch truật chứa tinh dầu (khoảng 1,4 %) Thành phần tinh dầu chủ yếu gồm atractylon, acetoxy atractylon, hydroxy atractylon, atractylon kal… [3] Ngồi ra, rễ Bạch truật cịn chứa sesquiterpen: α – eudesmol, β – eudesmol; dẫn chất lacton atractylenolid I, II, III; polyacetylenes (tetradeca-4E,6E,12Etriene-8,10-diyne-1,3,14-triol đồng phân); coumarin (scopoletin); sitosterol acid palmitic [1] [5] [6] [7] Bộ phận dùng: Rễ củ thu hoạch vào tháng – tháng 12 Rễ củ đào về, cắt bỏ rễ con, rửa sạch, sấy hay phơi khô Dược liệu Bạch truật có hình dạng thay đổi, có nhiều mấu phình ra, phía thót nhỏ lại, dài – 10 cm, đường kính – cm Mắt ngồi màu nâu xám, có vân hình hoa cúc, nhiều nếp nhăn dọc Thể chất cứng chắc, khó bẻ gãy, ruột trắng ngà, rải rác có khoang tinh dầu, mùi thơm nhẹ [1] A B C Hình 2.1 Cấu trúc astractylenolide A – Atractylenolide I B – Atractylenolide II C – Atractylenolide III Theo y học Trung Quốc, Bạch truật dùng uống để chống phù, có tác dụng lợi tiểu làm tăng tiết mồ hôi; 2.3 Tác dụng sinh học - Tính vị, cơng năng: Bạch truật có vị đắng, mùi thơm nhẹ, tính ấm chữa ho dạng nước sắc hay phối hợp với số vị thuốc khác để chữa đái tháo đường Theo y học cổ truyền Nhật Bản, Bạch truật dùng làm thuốc lợi Có tác dụng kiện tỳ, táo thấp, tả, hòa trung, lợi thủy, an thai [1] - Công dụng: Bạch truật xem vị thuốc bổ, bồi dưỡng dùng điều trị chứng bệnh đau dày, bụng trướng đầy, nôn mửa, chậm tiêu, tiêu chảy, phân sống, viêm ruột mạn tính, an thai trường hợp có thai đau tiểu trường hợp tiểu ít, tiểu buốt, hoa mắt; tăng cường tiêu hóa; chữa đau mẩy, ho đờm nhiều bụng, ốm nghén nôn ọe, chữa sốt trường hợp sốt mồ hôi, phù thũng Ngày dùng - 12 g dạng thuốc sắc [1] có tác dụng ức chế lt dày rõ ràng qua mơ hình: Gây loét dày thực nghiệm, tạo nên tổn thương có bệnh sinh khác nhau; loét Shay - Tác dụng dược lý: Bạch truật cách thắt môn vị, có khả gây nên 3.2 Phương pháp nghiên cứu tình trạng ứ dịch vị dày tổn thương mạch máu loét nhịn đói 1) Mô tả: Kiểm tra cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu nguồn gốc tâm lý Cơ chế tác dụng Bạch truật làm giảm rõ rệt lượng dịch vị [6] 2) Vi phẫu: Thử theo Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), phụ lục 12.18 - Định tính dược liệu chế phẩm kính hiển vi Hoạt tính chống viêm Bạch truật thể rõ giai đoạn cấp 3) Soi bột: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 - Định tính dược liệu chế phẩm kính hiển vi tính phản ứng viêm qua mơ hình gây phù kaolin Ngồi ra, Bạch truật 4) Độ ẩm: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.13 thể tác dụng ức chế tạo thành tổ chức hạt mơ hình u hạt 5) Tro toàn phần: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8 thực nghiệm với amian cho thấy tác dụng giai đoạn bán cấp phản ứng viêm 6) Tro không tan acid: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.7 [6] Cơ chế tác dụng Bạch truật ức chế tác dụng nitric oxyd 7) Chất chiết dược liệu: Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10) Chất chiết dược liệu khơng % tính theo dược liệu khơ kiệt (NO), prostaglandin E2 (PGE2), làm giảm biểu cytokins (IL - 1β, IL 6…) [7] Ngoài ra, Bạch truật chứng minh có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi [8], tăng cường miễn dịch, bảo vệ tế bào gan, chống oxy hóa [9], giảm co bóp tử cung ức chế hình thành tế bào mỡ mơ hình thực 8) Kim loại nặng: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.4.11 9) Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.17 nghiệm [10] 10) Định tính: Thử theo DĐVN V, Phụ lục 5.4: Phương pháp sắc ký lớp mỏng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11) Dấu vân tay: Trên SKĐ dung dịch thử phải có pic với giá trị RRT 3.1 Đối tượng nghiên cứu Dược liệu dùng cho nghiên cứu rễ Bạch truật (Atractylodes macrocephala Koidz.), họ Cúc (Asteraceae) Mẫu nghiên cứu rửa thuộc khoảng chấp nhận pic tương ứng SKĐ dấu vân tay chuẩn sạch, thái nhỏ, sấy 60oC tủ sấy chân không Bảo quản nguyên liệu túi polyme, để nơi khơ thống, tránh ẩm mốc Phụ lục 5.3 - Phương pháp sắc ký lỏng Hàm lượng (%) atractylenolide III 12) Định lượng: Định lượng đồng thời atractylenolide III: Thử theo DĐVN V mẫu thử (tính theo dược liệu khơ kiệt) tính theo cơng thức sau: 4.2.Vi phẫu Lớp bần (1) gồm nhiều hàng tế bào xếp đặn Mô mềm gồm tế bào thành mỏng Rải rác mơ mềm có khoang chứa tinh dầu (3) (Hình 4.2) C x 100 x 100 X (%) = 106 x m x (100 – b) Trong đó: m: Khối lượng mẫu thử (g) Hình 4.2 Vi phẫu dược liệu Bạch truật b: Độ ẩm mẫu thử (%) C: Nồng độ chất chuẩn mẫu thử (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng Bần, Mô mềm, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Dược liệu dùng rễ phơi hay sấy khô Bạch truật [Atractylodes macrocephala Koidz], họ Cúc (Asteraceae) Khoang chứa tinh dầu 4.1 Đánh giá cảm quan 4.3 Bột Thân rễ to (quen gọi củ) có hình dạng thay đổi, hình chùy có nhiều mấu phình ra, phía thót nhỏ lại, khúc mập, nạc, dài - 10 cm, đường kính - cm Mặt ngồi màu nâu Bột có màu vàng nâu, mùi thơm đặc trưng, vị đắng nhẹ Quan sát nhạt xám, có nhiều mấu, có vân hình hoa cúc, có nhiều nếp nhăn dọc Chất cứng khó bẻ gãy, mặt cắt khơng phẳng, có màu vàng đến nâu nhạt, rải rác vách dày, có lỗ trao đổi (3,7) Mảnh mô mềm mang tinh bột (2) Mảnh mạch mạng hay mạch chấm (4) Tinh thể canxi oxalat hình khối Hạt tinh bột đơn kép (6) (hình 4.3) kính hiển vi thấy: Mảnh bần gồm tế bào hình đa giác, thành dày, màu nâu (1) Tế bào mơ cứng hình nhiều cạnh, có khoang chứa tinh dầu màu nâu vàng, mùi đặc trưng (Hình 4.1) Hình 4.3 Một số đặc điểm bột Bạch truật Mảnh bần; Mảnh mô mềm mang tinh bột; 3,7 Tế bào cứng; Mảnh mạch; Tinh thể canxi oxalat; Tinh bột Hình 4.1 Hình ảnh dược liệu Bạch truật nghiên cứu Nhận xét: Thấy rằng, mẫu Bạch mỏng, có khoang chứa tinh dầu rải truật nghiên cứu có đặc điểm mơ tả, vi phẫu đặc điểm bột yêu cầu rác có tinh thể calci oxalat hình kim Phía libe có đám tế bào mô DĐVN V Tiêu chuẩn đề xuất: Tiêu chí mơ tả, vi phẫu bột, giữ nguyên yêu cầu DĐVN V cứng đa số hóa sợi Tầng phát sinh libegỗ thành vòng rõ rệt Libe-gỗ xếp thành tia tỏa tròn Tia ruột hẹp Vi phẫu: Bột có màu vàng nâu, mùi thơm đặc trưng, vị đắng Soi kính Mơ tả: Thân rễ to (quen gọi củ) hiển vi thấy: Mảnh bần gồm tế bào hình nhiều cạnh, thành dày Tế bảo có hình dạng thay đồi, hình chùy có nhiều mấu phình ra, phía thót nhỏ lại, khúc mập, nạc, dài - 10 mơ cứng hình nhiều cạnh, thành dày, có lỗ trao đổi Mảnh mơ mềm chứa tinh thể cm, đường kính - cm Mặt ngồi màu calci oxalat hình cầu gai có khoang chứa tinh dầu có màu nâu đến nâu nhạt xám, có nhiều mấu, có vân hình hoa cúc, có nhiều nếp nhăn dọc Chất cứng khó bẻ gãy, mặt cắt khơng phẳng, có màu vàng đến nâu nhạt, rải rác nâu vàng Tinh thể calci oxalat hình kim có đầu nhọn nằm riêng rẽ hay thành có khoang chứa tinh dầu màu nâu vàng, mùi đặc trưng đám Mảnh mạch vạch, mạch mạng Khối nhựa màu vàng, nâu, đỏ Bột: Lớp bần gồm nhiều hàng tế bào xếp đặn Lớp mô mềm gồm 4.4 Độ ẩm Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.13 (1g, 1050C, 5h) tể bào hình nhiều cạnh, có thành Bảng 4.1 Kết phân tích độ ẩm mẫu dược liệu Bạch truật Tên mẫu M1 M2 M3 Kết luận (theo DĐVN V) Độ ẩm không 14,0 (%) 9,103 11,284 12,945 Đạt (≤ 14 %) 4.5 Tro toàn phần Nhận xét: Nhận thấy mẫu dược liệu Bạch truật nghiên cứu có độ ẩm 14 % đạt theo yêu cầu DĐVN V, chuyên luận Bạch truật Tiêu chuẩn sở: Độ ẩm không 14,0 % (theo yêu cầu DĐVN V) Thử theo DĐVN V, Phụ lục 9.8 - Xác định tro toàn phần Bảng 4.2 Kết phân tích tro tồn phần mẫu dược liệu Bạch truật Tên mẫu M1 M2 M3 Tro tồn phần khơng q 5,0 % 3,7 3,1 4,2 Kết luận (theo DĐVN V) Đạt (≤ 5,0 %) Bảng 4.4 Kết chất chiết mẫu dược liệu Bạch truật Nhận xét: Nhận thấy mẫu dược liệu Bạch truật nghiên cứu có tro tồn phần 5,0 % đạt theo yêu cầu DĐVN V, chuyên luận Bạch truật Tiêu chuẩn đề xuất: Tro toàn phần không 5,0% (theo yêu cầu DĐVN V) 4.6 Tro không tan acid Thử theo DĐVN V, Phụ lục 9.7Xác định tro không tan acid Bảng 4.3 Kết phân tích tro khơng tan acid mẫu dược liệu Bạch truật 0,1 0,2 0,1 M1 M2 M3 (theo DĐVN V) Chất chiết ethanol 96% 4,5 ± 0,2 5,1 ± 0,3 4,7 ± 0,2 Đạt (≥ 3,0 %) 4.8 Kim loại nặng 04 kim loại nặng gồm As, Pb, Cd Hg kim loại độc hại, thường yêu cầu giới hạn thấp, đặc biệt với Kết luận Tên mẫu M1 M2 M3 (theo DĐ Hong Kong) Tro không tan acid không 0,5 % Kết luận Tên mẫu dược liệu trồng theo GAP Định lượng kim loại nặng tiến hành phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, thử theo DĐVN V, phụ lục 9.4.11 theo TCVN Đạt (≤ 0,5 %) Bảng 4.5 Kết phân tích kim loại nặng mẫu dược liệu Bạch truật Kim loại nặng Nhận xét: Nhận thấy mẫu dược liệu Bạch truật nghiên cứu có tro khơng tan acid 0,5 % đạt theo yêu cầu DĐ Hong Kong, chuyên luận Bạch truật Tiêu chuẩn đề xuất: Tro không Hàm lượng (mg/kg) tan acid không 0,5 % (theo yêu cầu DĐ Hong Kong) As Cd 0,01 0,046 Hg Pb ˂ 0,042 0,006 Nhận xét: Nhận thấy mẫu dược liệu Bạch truật nghiên cứu có dư lượng kim loại nặng thấp, DĐVN V chuyên luận Bạch truật chưa có yêu cầu dư lượng kim loại nặng DĐVN V 4.7 Chất chiết dược liệu Kết chất chiết ethanol 96% mẫu Bạch truật trình bày Bảng 4.4 khơng có u cầu chung cho giới hạn nhiễm 04 kim loại này, ngoại trừ số chuyên luận DĐVN qui định chuyên luận sen yêu cầu (không 10 phần triệu Pb; phần triệu Cd; 0,4 phần triệu Hg, phần triệu As) Ngồi DĐ số nước có u cầu chung dư lượng kim loại nặng DĐ Hong Kong, chuyên luận dược liệu qui định chung (không phần triệu Pb; phần triệu Cd; 0,2 phần triệu Hg, phần Hình 4.4 Hình ảnh SKĐ sắc ký lớp mỏng định tính Bạch truật triệu As) Như có dư lượng kim loại nặng thấp (A)-SKĐ quan sát 254 nm; (B)-SKĐ quan sát 366 nm; (C)-SKĐ màu H2SO4 Tiêu chuẩn đề xuất: Kim loại nặng Kim loại nặng As Cd Hg Pb Hàm lượng (mg/kg) ≤2 ≤1 ≤ 0,2 ≤5 Ghi chú: C Mẫu Bạch truật đối chiếu; T Mẫu Bạch truật thí nghiệm, Dung mơi khai triển: ether dầu hỏa ethylacetat (50 4.9 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật : 1) Nhận xét: Kết kiểm tra dư lượng thuốc bảo vệ thực vật mẫu Bạch truật, không phát tồn dư thuốc bảo vệ thực vật DĐVN V khơng có u cầu chung cho dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, nhiên có số chuyên luận có yêu cầu tiêu này, chuyên luận tía tơ có u cầu dư lượng thuốc bảo vệ thực vật “Benzen hexaclorid (BHC): Không 0,2 phần triệu” Nhận xét: SKĐ TLC cho vết tách rõ, SKĐ dung dịch thử có vết màu, giá trị Rf với SKĐ dung dịch đối chiếu Bạch truật Tiêu chuẩn đề xuất - Định tính: Thử theo DĐVN V, Phụ lục 5.4, Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60F254 - Dung môi khai triển: ether dầu hỏa - ethylacetat (50 : 1) Tiêu chuẩn đề xuất: dư lượng thuốc bảo vệ thực vật dược liệu Bạch truật qui định Benzen hexaclorid (BHC): Không 0,2 phần triệu - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm ml n-hexan (TT), cho vào bình kín, lắc khoảng 30 phút Lọc, lấy dịch lọc dung dịch thử 4.10 Định tính - Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Bạch truật (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử, dung dịch đối chiếu Thử theo phương pháp sắc ký lớp mỏng, DĐVN V, phụ lục 5.4 Kết trình bày (Hình 4.4) - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 10 l dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng để khô không khí Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm, phun dung dịch vanilin % dung dịch acid sulfuric % Sấy mỏng 60oC 15 phút đến vết rõ Tiến hành khai triển mẫu dung dịch chuẩn dung dịch thử theo điều kiện phân tích trình bày Kết thu sau: Bảng 4.7 Giá trị RRT pic đặc trưng SKĐ mẫu dược liệu Bạch truật Pic (marker, atractylenolide III) - Kết quả: Trên SKĐ đung dịch thử phải có vết phát huỳnh quang màu giá trị Rf với vết SKĐ cùa dung dịch đối chiếu 4.11 Dấu vân tay Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Tiến hành tiêm lặp lại lần mẫu dung dịch chuẩn có nồng độ 100 µg/ml, ghi lại thời gian lưu diện tích pic Kết trình bày Bảng 4.6 Diện tích pic (mAU.s) 18,298 18,305 18,342 18,287 18,299 1,06 1,10 1,57 2,04 Trên SKĐ dung dịch thử có pic với giá trị RRT thuộc khoảng chấp nhận pic tương ứng SKĐ dấu vân tay chuẩn Bảng 4.6 Kết kiểm tra tính thích hợp hệ thống STT RRT Tiêu chuẩn đề xuất: Thời gian lưu (phút) 2461416 2489823 2490506 2501107 2478905 - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 1,0 mg, hòa tan 10 mL ethanol., thu dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 100 µg/ml Trung 18,306 2484351 bình RSD 0,11 0,61 (%) Đô ̣ lê ̣ch chuẩ n tương đố i của diê ̣n - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml ethanol Siêu âm (90 W) 30 phút Lọc qua màng lọc 0,45 µm dung dịch thử - Điều kiện sắc ký: tích pic và thời gian lưu nhỏ 2% Số đĩa lý thuyết pic atractylenolide III 269253 (> 80000) Như vậy, các điề u kiê ̣n sắ c ký đã lựa cho ̣n và ̣ thố ng Cột: C18 (250 x 4,6 mm; µm) Detector: DAD, bước sóng phát hiện: 220 nm Tốc độ dòng: ml/phút HPLC sử du ̣ng là phù hơp̣ và đảm bảo đô ̣ ổ n đinh ̣ của phép phân tích Kết đánh giá dấu vân tay mẫu dược liệu Bạch truật thí nghiệm Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acetonitril: H2O, gradient: Thời gian (phút) Acetonitril Nước Phương pháp khai triển 0–5 20 80 Đẳng dòng – 10 20 → 60 80 → 40 Gradient 10 – 25 60 → 100 40 → Gradient 25 - 40 100 Đẳng dịng Kiểm tra tính thích hợp hệ thống: Tiển hành tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn, ghi lại thời gian lưu diện tích pic Giá trị RSD % diện tích pic thời gian khơng q 5,0 % Số đĩa lý thuyết pic atractylenolide III khơng 80000 Hệ số phân giải Rs pic số pic liền kề khơng 1,5 Tiến hành: Khai triển dung dịch chuẩn dung dịch thử, ghi lại SKĐ Đánh giá thời gian lưu pic atractylenolide III năm pic đặc trưng SKĐ dung dịch thử Xác định pic atractylenolide III SKĐ dung dịch thử cách so sánh với thời gian lưu pic atractylenolide III SKĐ dung dịch chuẩn Sự sai khác thời gian lưu không 2,0 % Xác định RRTs pic đặc trưng SKĐ dung dịch thử RRTs ± SD pic đặc trưng dịch chiết Bạch truật trình bày Bảng 4.8 Bảng 4.8 Giá trị RRT pic đặc trưng dấu vân tay chuẩn Bạch truật Pic (marker, atractylenolide III) RRT 1,08 1,11 1,56 2,06 Hình 4.5 Dấu vân tay chuẩn dịch chiết Bạch truật 10 SD ± 0,03 ± 0,03 ± 0,03 ± 0,03 (1) (2) (3) (4) (5) Hình 4.6 Phổ hấp thụ UV – Vis 05 pic đánh dấu dấu vân tay dược liệu Bạch truật Kết quả: Trên SKĐ dung dịch thử phải có pic với giá trị RRT thuộc khoảng chấp nhận pic tương ứng SKĐ dấu vân tay chuẩn 4.12 Định lượng 1) Xây dựng phương pháp định lượng Thử theo DĐVN V, phụ lục 5.3, Phương pháp sắc ký lỏng Đánh giá lại điều kiện phân tích HPLC quy trình xử lý mẫu nêu mục 2.2 (12) hệ thống máy móc phịng thí nghiệm Khoa Bào chế - Chế biến, Viện Dược liệu, nhóm nghiên cứu nhận thấy điều kiện phân tích phù hợp Kết thu hình 4.7 bảng 4.9 11 A-SKĐ HPLC atractylenolide III B-SKĐ HPLC phân tích Atractylenolide Bạch truật Hình 4.7 SKĐ HPLC mẫu phân tích (1-Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thử thêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn) Bảng 4.9 Các thông số đánh giá atractylenolide III phân tích atractylenolide III dược liệu Bạch truật STT Thông số đánh giá 2) Thẩ m đinh ̣ phương pháp phân tích Giá trị Thời gian lưu, tR 23,356 Độ phân giải, R 1,892 Hệ số kéo đuôi peak 1,144 Số đĩa lý thuyết 19215 Các thông số độ phân giải (RS), hệ số kéo đuôi của peak, số đĩa lý thuyết N đạt yêu cầu, chứng tỏ điều kiện phân tích HPLC phù hợp cho - Tính cho ̣n lo ̣c của phương pháp: Tiế n hành phân tích mẫu: dung dich ̣ atractylenolide III chuẩ n, dung dich ̣ mẫu thử, dung dich ̣ mẫu thử thêm chuẩ n atractylenolide III với điều kiện phân tích HPLC trình bày trên, thu kết đánh giá SKĐ tương ứng hình sau: Hình 4.8 SKĐ đánh giá tính cho ̣n lo ̣c phương pháp 1-Mẫu trắng; 2-Mẫu thử dược liệu Bạch truật; 3-Mẫu thử dược liệu Bạch truật thêm chuẩn atractylenolide III; 4-Mẫu chuẩn atractylenolide III 12 Trên SKĐ thu cho thấy, thời gian lưu của atractylenolide III ở mẫu là tương đương nhau, pic atractylenolide III không bị trùng với pic khác khác, diê ̣n tích pic atractylenolide III mẫu thử thêm chuẩ n tăng lên tương ứng với lươṇ g chuẩ n thêm vào so với diê ̣n tích pic atractylenolide III mẫu thử, chứng tỏ phương pháp hệ thống sắc ký có tính đặc hiệu cao - Giới ̣n phát hiêṇ (LOD) và giới ̣n đinh ̣ lươṇ g (LOQ) Phân tích mẫu thử xác định nồng độ atractylenolide III, sau pha lỗng dần đến sắ c kí đồ của dung dịch thử, ta ̣i thời gian lưu của acid ganoderic A, xác đinh ̣ đươc̣ tỷ lê ̣ S/N=23 và S/N= 9-11 Từ tìm LOD LOQ Mỡi mẫu làm lă ̣p la ̣i lầ n và lấ y kế t quả trung bình Kết thu là: Atractylenolide III: Ta ̣i nồ ng đô ̣ 0,215 (µg/ml) và 0,065 (µg/ml) tỷ lê ̣ S/N tương ứng là 10 và Với kế t quả này chúng xác đinh: ̣ + Giới ̣n phát hiê ̣n (LOD): 0,065 (µg/ml) + Giới ̣n đinh ̣ lươṇ g (LOQ): 0,215 (µg/ml) - Xác đinh ̣ khoảng tuyế n tính và xây dưṇ g đường chuẩ n Chuẩ n bi mô ̣ ̣t day ̣ ̃ gồ m dung dich atractylenolide III chuẩ n có nồ ng ̣ tăng dầ n từ 1,625 µg/ml đế n 104 µg/ml rờ i tiế n hành phân tích HPLC với các điề u kiê ̣n trình bày Kết khảo sát trình bày Bảng 4.10 Bảng 4.10 Quan ̣tuyế n tính giữa nồ ng đô ̣ và diêṇ tích của pic atractylenolide III Nồ ng đô ̣ (mg/ml) Diêṇ tích pic (mAU.s) Nồ ng đô ̣ tính la ̣i từ đường chuẩ n (mg/ml) Đô ̣ chêch ̣ (%) 1,625 120783 1,987 18,2 3,250 243363 3,824 15,0 6,500 587771 7,580 14,2 13,000 1111158 13,287 2,2 19,500 1643712 19,095 2,1 26,000 2188350 25,034 3,9 32,500 2797135 31,673 2,6 52,000 4468481 49,899 4,2 104,000 9566241 105,490 1,4 Phương trin ̀ h đường chuẩ n Y= 91701x – 107362 Hê ̣ số tương quan R2 = 0,9987 13 12000000 10000000 y = 91701x - 107362 R² = 0.9987 8000000 6000000 4000000 2000000 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 Hình 4.9 Đường chuẩn biể u diễn mố i quan ̣ giữa nồ ng đô ̣ atractylenolide và diêṇ tích pic Đường chuẩ n đươc̣ đánh giá thông qua ̣ số tương quan R và đô ̣ Bảng 4.11 Kế t quả đánh giá tính thích hơp̣ ̣ thố ng chê ̣ch của nồ ng đô ̣ tìm la ̣i đươc̣ từ đường chuẩ n so với nồ ng đô ̣ thực Kế t quả đánh giá đường chuẩ n đươc̣ trình bày Thời gian lưu (phút) 23,169 Diêṇ tích pic (mAU.s) 2611305 Bảng 3.10 cho thấ y đô ̣ chệch (∆) ta ̣i các nồ ng đô ̣ đề u nằ m giới ̣n cho phép (