PCR (1)

PCR (Polymerase Chain Reaction) PGS TS Cao Minh Nga BM Vi sinh - Khoa Y ÑH Y Dược TP HCM NỘI DUNG I Giới thiệu PCR II Nguyên lý phản ứng PCR III Tiến hành phản ứng PCR IV Ứng dụng chẩn đoán bệnh nhiễm VSV V Kết luận I Giới thiệu PCR PCR gì? - Là pp khuếch đại in vitro để tạo nhiều (copies) đoạn DNA, - Mô maùy sinh TH DNA TB sống  công cụ mạnh để , nghiên cứu Y- Sinh học, đặc biệt  tác nhân VSV gây bệnh Từ DNA mẫu  PCR  hàng tỉ copies Quá trình phát triển   1985, California, USA Từ ý tưởng tình cờ chạy xe, Kary Mullis phát minh pp tách đôi sợi DNA Nhờ tiến kỹ thuật: - máy luân nhiệt - men chịu nhiệt - chống ngoại nhiễm Quá trình phát triển (2)  1989: bắt đầu phát triển PCR để chẩn đoán ()  1990: kít PCR chấp nhận cho HLA  1991: kỹ thuật RT-PCR (Reverse-Transcription PCR)  1992: kít DNA PCR chuẩn cho  lâm sàng (AMPLICORChlamydia trachomatis) Quá trình phát triển (3)   1993: - kít RNA PCR chuẩn (AMPLICOR HCV) - Kary Mullis nhận giải thưởng Nobel Hóa học - Hội Vi sinh HK: “Diagnostic Molecular Microbiology – Principle & Application” 1995: - heä thống tự động cho  lâm sàng - AMPLICOR HIV-1 MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR  1996: - AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis - AMPLICOR Enterovirus Kary Mullis trao giải Nobel Hóa học 1993 II Nguyên lý phản ứng PCR PCR khuếch đại trình tự đích Trình tự đích Chuỗi DNA Chuỗi DNA siêu Nhiễm sắc thể Chuỗi DNA xoắn đôi Khu vực PTN PCR đơn giản Trang thiết bị cần thiết cho phòng xét nghiệm PCR Chuẩn bị phản ứng PCR (Pre-PCR) Buồng vô trùng (Dead-air Box) Tủ lạnh chứa thuốc thử Chuẩn bị thuốc thử Buồng cấy an toàn sinh học Máy ly tâm và/hoặc siêu ly tâm chuẩn cho chẩn đoán Bồn ủ nhiệt khô Tủ lạnh chứa bệnh phẩm Chuẩn bị bệnh phẩm Thực PCR Máy luân nhiệt PCR (PCR machine) Khuếch đại Đọc kết (Post- PCR) Thiết bị điện di Phát ĐIỆN DI SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI ĐIỆN DI SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI - Thạch Agarose - Ethidium Bromide - DNA ladder - PCR (+) control - PCR (-) control - Mẫu (samples) Đọc kết (Post- PCR) Thiết bị xem ảnh Phát Hóa chất, thuốc thử PCR 3.1 Hóa chất tách chiết DNA / RNA  Phương phaùp Boom: guanidine thiocyanate (GuSCN) ly giải protein TB, kể nuclease => DNA / mẫu bám vào hạt silica => ly trích tinh khiết DNA từ mẫu  Phương pháp tủa: Dung dịch Phenol / Chloroform /Isoamyl Alcohol (P/C/I) biến tính tủa protein => DNA / pha lỏng kết tủa ethanol / nồng độ muối cao 3.2 Thành phần phản ứng PCR (PCR mix)  DNA mẫu (template) cần phaùt  Enzym khuếch đại: Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus), rTth DNA polymerase (Thermus thermophilus)  Mồi (primer)  dNTPs (A, T, C, G)  Mg2+  Đệm (buffer)  Nước (H2O) Các bước tiến hành PCR 4.1 Lấy mẫu 4.2 Xử lý mẫu 4.3 Tách chiết DNA / RNA 4.4 Chạy phản ứng PCR 4.5 Phát sản phẩm PCR III Ứng dụng chẩn đoán nghiên cứu bệnh nhiễm VSV Phát & định lượng VSV gây bệnh    Tác nhân khó ni cấy hay khơng nuôi cấy (VK lậu, HBV, HCV, …) Tác nhân có thời gian ni cấy q dài (VK M tuberculosis) Tác nhân vi sinh vật nguy hiểm (virus H5N1,…) III Ứng dụng chẩn đoán nghiên cứu bệnh nhiễm VSV (2) Phát độc tố VSV (VK E coli, S aureus, …) Xác định tính kháng thuốc VSV gây bệnh (HBV, VK lao, …) Xác định kiểu gen VSV gây bệnh (HCV, VK Helicobacter pylori, …) V Kết luận   Các pp SHPT ngày phát triển & phổ biến qui mô rộng Cần đánh giá, chọn lựa & triển khai xét nghiệm SHPT phù hợp với bệnh nhiễm VSV, tình hình sở địa phương ... 1.073.741.824 * Các pp SHPT dựa treân PCR  PCR (Polymerase Chain Reaction) * RT -PCR (Reverse Transcription -PCR) * Real-time PCR * Multiplex -PCR * Nested PCR    Lai phân tử (Dot-Blot) Giải... cần thiết cho phòng xét nghiệm PCR Hóa chất, thuốc thử PCR 3.1 Hóa chất tách chiết DNA / RNA 3.2 Thành phần phản ứng PCR (PCR mix) Các bước tiến hành PCR Khu vực PTN PCR đơn giản Trang thiết bị...NỘI DUNG I Giới thiệu PCR II Nguyên lý phản ứng PCR III Tiến hành phản ứng PCR IV Ứng dụng chẩn đoán bệnh nhiễm VSV V Kết luận I Giới thiệu PCR PCR gì? - Là pp khuếch đại in vitro