PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

PCR giải trình tự Giải trình tự gì? DNA sở hóa học gen Phân tử DNA chuỗi xoắn kép hai mạch đơn cấu tạo từ loại nucleotide khác nhờ base chúng, là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) T (thymine) Các nucleotide nối kết liên tiếp với theo thứ tự xác định Giải trình tự gen tức phát thứ tự xếp loại nucleotide phân tử DNA Các phương pháp giải trình tự gene Phương pháp hóa học giải trình tự DNA Vào năm 1977, Maxam Gilbert phát minh phương pháp hóa học để giải trình tự đoạn DNA Ngun tắc phương pháp là: (1) Trước hết phải đánh dấu đầu đoạn DNA cần phải giải trình tự gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P); (2) Xử lý đoạn DNA đánh dấu với chất hóa học làm biến đổi đặc hiệu hai loại base nucleotide đoạn DNA Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine thêm gốc methyl vị trí nitrogen thứ (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine Cytosine, hydrazine NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine Cytosine với Adenine ưu tiên Cytosine Như giai đoạn này, phải dùng ống nghiệm ống nghiệm, DNA xử lý với lượng giới hạn chất hóa học nêu để ống nghiệm có chứa đoạn DNA mà đoạn DNA có vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học bị biến đổi; (3) Các nucleotide bị biến đổi bị lấy khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) đoạn DNA nhờ tách đoạn mạch đơn có đầu đánh dấu 32P đầu bị phân tử base phân tử bị lấy khỏi mạch khung (hình 37) (4) Thực điện di mẫu DNA xử lý ống nghiệm hàng gel polyacrylamide biến tính để mạch đơn mẫu di chuyển gel khơng bị biến đổi q trình điện di Nhờ đó, sau hồn tất điện di, mạch đơn bị dừng vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài gel Áp gel điện di phim nhạy tia X, vị trí dừng 81 lại mạch đơn gel điện di tạo thành vạch phim vị trí bị đánh dấu phóng xạ mạch đơn có đầu đánh dấu 32P Từ vạch phim xạ ký tự ghi (autoradiography), đọc trình tự nucleotide đoạn DNA (hình 38) Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA Maxam Gilbert thực tế khơng phải dễ thực cần phải xác định nhiều thơng số tối ưu cho thí nghiệm, khó phải xác định nồng độ giới hạn chất hóa học cho xử lý mẫu DNA đoạn DNA có base bị biến đổi để ứng với vị trí base bị biến đổi có mạch đơn có đầu đánh dấu 32P tách Chính phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert sử dụng, mà thay vào nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội Mạch đơn DNA 32 P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A 32 Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P P P 32 P 32 P 32 P 32 Hình 37: Các mạch đơn có đầu đánh dấu với 32P đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung bị biến đổi Các mạch đơn có chiều dài ngắn khác tùy thuộc vào vị trí Guanidine đoạn DNA 3’ 5’ GCCCACTTCAGAAGAAAAAGG C T+G G A>C Hình 38: Hình xạ ký tự ghi phim nhạy tia X gel polyacrylamide sau điện di Các vạch vị trí mạch đơn bị dừng lại sau điện di Các vị trí gần hay xa khởi điểm tuỳ kích thước mạch đơn dài hay ngắn khác Từ vạch này, đọc trình tự đoạn DNA mẫu 82 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA Phương pháp enzyme Sanger cộng phát minh vào năm 1977, ngày hơm phương pháp ngày hồn thiện thực dễ dàng phòng thí nghiệm Ngun tắc chung phương pháp tóm tắt sau: CATACGTGG CCTTACG mồi GGAATGC CATACGTGG thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CCTTACG GGAATGC thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT điện di gel CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC Hình 39: Chiều điện di Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA Đoạn DNA chèn vào vector vị trí biết rõ trình tự, nhờ tổng hợp mạch đơn có đầu mồi, đầu nucleotide 35 tận Trong hình nucleotide đánh dấu * nucleotide dánh dấu S, nhờ mạch đơn đánh dấu 83 Trước hết chèn đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào vector phage hay plasmid vị trí mà trình tự chuỗi vị trí xác định rõ Chuyển thể tức đưa vector mang đoạn chèn DNA vào tế bào vi khuẩn để nhân vector thành nhiều sao, sau tách chiết tinh khiết vector từ vi khuẩn để thành vector tự Dùng đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí chèn đoạn DNA Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase loại nucleotide tự (gọi dNTP: deoxynucleotide triphosphate) lượng giới hạn nucleotide tận (terminator, ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, dNTP, có loại ddNTP tương ứng với base A, T, C G) Phản ứng thực ống, ống cho loại ddNTP khác Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase kéo dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn vector, tổng hợp mạch đơn bị dừng lại vị trí mà ddNTP kéo vào thay dNTP Lý tổng hợp bị dừng lại ddNTP có cấu trúc hóa học bị gốc OH A C G T T C A vị trí carbon thứ đường deoxyribose, mà G gốc OH vị trí nơi để dNTP kế T C tiếp gắn vào Nhờ ống phản ứng 3’ C G C T A có mạch đơn DNA có chiều dài khác G C tương ứng với vị trí trình tự T T A nucleotide đoạn DNA gốc (hình 39) G C Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di gel polyacrylamide biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi hay dNTP G G 5’ Hình 40: Hình xạ ký tự ghi kết giải trình tự DNA gel polyacrylamide Từ kết này, đọc trình tự DNA đồng vị phóng xạ 32P hay 35S sau điện di, giống phương pháp Maxam Gilbert, người ta phát vạch điện di kỹ thuật xạ ký tự ghi, từ vạch giải trình tự đoạn DNA (hình 40) 84 Giải trình t b ng máy t ng (automated Các phòng thí nghiệm dùng phản ứng giải trình tự phương pháp enzyme, làm giải trình tự thường dùng máy tự động khơng dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi trước Để thực giải trình tự máy tự động mạch DNA đơn sản sinh ống phản ứng giải trình tự phải đánh dấu huỳnh quang để vạch điện di mạch đơn phát sáng qua chùm tia sáng laser Cấu tạo máy tự động giải trình tự gồm hai phần yếu, là: phần điện di với gel polyacrylamide phần phát vạch điện di Phần điện Mắt cảm quang Tia LASER A G C T T A C G G A C T A A TGC Màu Màu Máy tính Màu Màu Thpolyacrylamide i gian Hình 41: Sơ đồ khối máy tự động giải trình tư dùng gel Máy gồm hai phần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát vạch điện di Các vạch điện di mắt cảm quang phát qua chùm tia laser phát sáng lên Tín hiệu mắt cảm quang truyền máy tính để hiển thị thành đỉnh cường độ sáng 85 di polyacrylamide gel ống mao quản chứa gel Phần phát vạch điện di mắt cảm quang chùm tia laser qua trước Ngun tắc hoạt động máy suốt q trình điện di, có vạch điện di qua chùm tia laser vạch điện di phát sáng lên phát sáng mắt cảm quang CATACGTGG CCTTACG GGAATGC ghi nhận lưu lại thành đỉnh cường độ sáng thêm dNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP biểu đồ Từ biểu đồ đỉnh cường độ CGTAAGGCCdA CGTAAGGCdC CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT sáng này, máy so dòng đỉnh tương ứng với màu để cuối phân tích thành trình tự đoạn DNA (hình 41) Với máy hệ sau này, người ta dùng màu huỳnh quang khác để đánh dấu loại ddNTP, nhờ phản ứng giải trình tự thực *CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTAdT *CGTAAGGCCACGTdA *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACdG *CGTAAGGCCAdC *CGTAAGGCCdA *CGTAAGGCdC *CGTAAGGdC Chi✳u điện di Chiều Hình 42: Với ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, đọan trình tự tận đầu 5’ đánh dấu màu hùynh quang khác tương ứng với nuleotide tận A, hay T, hay C hay G Chính nhờ khơng cần phải thực phản ứng giải trình tự ống phản ứng ống nghiệm giải trình tự cần điện di hàng mà khơng cần phải hàng khác trước (hình 42) Nếu dùng diện di mao quản tùy thuộc vào số mao quản chạy lần mà người làm thí nghiệm có số mẫu cho lần chạy nhiều hay Hình 43 sơ đồ khối minh họa cho giải trình tự mao quản (CEQ8000, hay CEQ8800) Tùy thuộc vào qui mơ phòng thí nghiệm với số mẫu giải trình tự mà phòng thí nghiệm trang bị giải trình tự hay nhiều mao quản Ví dụ với ABI có nhiều loại: mao quản, mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, 96 mao quản Phòng thí nghiệm R&D cơng ty Nam Khoa trước nhu cầu giải trình tự khơng nhiều nên trang bị CEQ8000 có mao quản (hình 44) Nhưng 86 nhu cầu nghiên cứu dịch vụ ngày nhiều nên trang bị thêm ABI 3130XL có đến 16 mao quản (hình 44) Các hệ máy sau ngày có chương trình kèm để hiển thị tự động ký tự hố học trình tự DNA mà giúp nhà nghiên cứu có thể: (1) Phát chi tiết cần thiết trình tự mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme), dấu ấn di truyền mà chi tiết cần thiết để lập đồ gen (2) Phiên dịch trình tự vùng đọc mở (tức vùng trình tự có ý nghĩa) thành trình tự acid amin protein, nhờ xác định, đốn, hay làm sở ban đầu để hiểu chức gen (3) Tự động so sánh trình tự DNA thí nghiệm hay trình tự DNA nạp vào máy, hay trình tự acid C✶m quang amin protein, với C c [+] trình tự khác có ngân   hàng liệu để phát Mao quản tương đồng với trình C✴c [-] tự biết, nhờ làm sở Laser để xác định gen chức Điện cao gen Hình 43: Sơ đồ khối máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA Hình 44: Máy giải trình tự CEQ8000 có mao quản Beckman Coulter ABI 3130XL có 16 mao quản Applied Biosystem trang bị phòng thí nghiệm R✫D cơng ty Nam Khoa 87 PCR cơng cụ giúp hồn thiện mở rộng phổ áp dụng kỹ thu t giải trình tự PCR đóng góp nhiều vào cơng nghệ giải trình tự làm cho cơng nghệ giải trình tự ngày dễ dàng thuận tiện Khơng PCR làm cho giải trình tự có nhiều ứng dụng khơng nghiên cứu mà chẩn đốn Trước có PCR người ta giải trình tự đoạn gene lập chèn vào plasmid có nhân đoạn gene muốn giải trình tự thành nhiều với số lượng đủ để chạy phản ứng giải trình tự Ngồi ra, enzyme polymerase loại enzyme khơng chịu nhiệt nên phản ứng giải trình tự thực 37oC, mà vấn đề tối ưu thành phần phản ứng khó đồng thời hiệu phản ứng giải trình tự khơng cao Từ có đời kỹ thuật PCR kỹ thuật giải trình tự có tiến vượt bực Chỉ cần dùng PCR nhân đoạn gene muốn giải trình tự thành hàng tỷ hồn tồn giống hệt sản phẩm khuếch đại đưa vào giải trình tự trực tiếp mà khơng cần phải chèn vào plasmid giải trình tự Sự phát minh kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm PCR giúp cho việc cải tiến phản ứng giải trình tự hiệu trước trở nên hiệu nhờ áp dụng enzyme polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự thực qua chu kỳ nhiệt giống hệt PCR, mà ngày gọi phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự hiệu phản ứng tốt nhiều, đồng thời tối ưu hóa thành phần phản ứng dễ dàng nhiều Có thể nói đời hồn thiện kỹ thuật PCR giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự khơng vấn đề hồn thiện nó, mà vấn đề phạm vi áp dụng Giải trình tự gene ng i Làm giải trình tự gene người Giải trình tự gen người tức giải trình tự tồn thứ tự xếp nucleotide A, T, C, G DNA 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào người Dự án giải trình tự gen người Tiến Sĩ James Watson, cha đẻ phát cấu trúc DNA, đề từ thập niên 1980 Đến tháng 10 năm 1990, dự án đời với kinh phí tỷ Mỹ kim HGP (Human Genome Project) Viện Quốc Gia Y Tế Hoa Kỳ lãnh đạo với tham gia nhiều trung tâm nghiên cứu gen người nhiều quốc gia 88 giới Do tiên đốn giá trị kinh tế mang lại từ việc giải mã thành cơng gen người lớn, nên có số cơng ty sinh học chun gen người hình thành Sự nhập cơng ty tư nhân tạo nên bầu khơng khí thi đua cho việc khai phá bí mật gen lồi người chúng ta, gần đến ngày đến đích ngoạn mục Trong chạy đua này, nhờ áp dụng phương pháp độc đáo kết hợp cơng nghệ PCR, cơng nghệ giải trình tự DNA với cơng nghệ tin học, nên với kinh phí khoảng 200 triệu mỹ kim, Tiến Sĩ Crag Venter Celera Genomics trở thành người dẫn đầu thành cơng việc giải trình tự gần hồn tồn gen người Cái khó khăn việc giải trình tự gene người khơng thể tách đại phân tử DNA nhiễm sắc thể đem giải trình tự đại phân tử DNA ngun vẹn Các nhà khoa học HGP trung tâm khác giới nghiên cứu gen người thường cắt đại phân tử DNA nhiễm sắc thể cách định hướng theo đồ di truyền, đem giải trình tự đoạn cắt DNA này, cuối tìm cách ghép nối chúng lại với cho vị trí chúng đại phân tử DNA Phương pháp đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian cơng sức có nhiều đoạn cắt DNA q lớn, khó giải trình tự khó cho kết giải trình tự xác Do đó, với đoạn DNA nhà khoa học phải thực giải trình tự lần để đảm bảo độ lặp lại Chính vậy, với cách tiếp cận này, nhiều vị trí đại phân tử DNA khơng thể giải trình tự mà từ nhà khoa học HGP hồn tất việc xếp vị trí đoạn DNA giải trình tự đại phân tử DNA nhiễm sắc thể Tiến sĩ Crag Venter thực phương pháp giải trình tự gen người cách hồn tồn khác hẳn (hình 45) Trước hết ơng cho tách chiết tồn DNA nhiễm sắc thể tế bào người phá bung cách khơng định hướng đại phân tử DNA thành mảnh DNA nhỏ Đem giải trình tự tất mảnh DNA nhỏ Cuối dùng máy điện tốn cực mạnh mà ơng hợp tác với cơng ty ABI chế tạo ra, dò tìm đầu trùng lặp mảnh DNA nhỏ để lắp nối vào vị trí chúng đại phân tử DNA nhiễm sắc thể Chính nhờ áp dụng chiến lược giải trình tự mà Celera Genomics giải trình tự nhanh mảnh DNA, cần lặp lại cho mảnh DNA có lần, xếp gần hầu hết vị trí mảnh 89 DNA giải trình tự đại phân tử DNA nhiễm sắc thể Hơn nữa, TS Crag Venter tun bố cơng ty triển khai kỹ thuật làm cho phương pháp giải trình tự gen cơng ty, phương pháp nhanh rồi, trở thành nhanh Cuối năm 2000, Celera Genomics hồn thành việc giải trình tự gen chuột với 2.3 tỷ “ký tự hóa học” có nhiều tương đồng với gen người, nhờ giúp nhà khoa học dễ dàng việc truy tìm chức gen Kết giải trình tự gene người Sau gần 10 năm nghiên cứu thực với năm sau sơi động khơng khí thi DNA từ mhiễm sắc thể phá bung thành nhiều mãnh nhỏ đua nhập cơng ty tư nhân, ngày 26 tháng năm 2000, Tòa Bạch Ốc với Các mãnh DNA nhỏ giải trình tự diện Tổng Thống Hoa c ag g ca t t t cc Kỳ Bill Clinton, hai khoa học gia cca gc a diện cho Celera Genomic Tiến Institute of Health) cơng bố a gc ga g t g ag g a c ag c Các mãnh DNA nhỏ chương trình phân tích tự động tìm đầu trùng lặp, nhờ tái trình tự đại phân tử DNA Sĩ Francis Collins đại diện cho Project) NIH (NIH: National g ga g c a g c g a g c g g cg g Mỹ Tiến Sĩ Crag Venter đại HGP (HGP: Human Genome g g cg g c g a ga c a g c g g ag c c a gc a t g g a c g g a g g c gg c cc a g c c a g g ca t t t tgtac c g a g c g g cg g a g a c a gc g t g ag g cc a g c a t t a t g g c gg c g g a g c a c ga gc g g c ccgtcaaccggagtta cách long trọng chương trình giải trình tự gen người acgttct hồn tất Đây thời khắc lịch sử quan trọng đáng nhớ nhân loại, đánh dấu ngày nhân loại có tay đồ sinh học cần thiết để bước vào kỷ ngun với nhiều hứa hẹn thành tựu vĩ Hình 45: Phương pháp giải trình tự gen người cơng ty Celera Genomics: trước hết tách chiết tồn DNA nhiễm sắc thể tế bào người, sau phá tung DNA thành mảnh nhỏ, giải trình tự tất mảnh nhỏ này, cuối nhờ chương trình vi tính cực mạnh để nối kết đoạn DAN nhỏ lại với cách dò tìm đầu trùng lặp nhờ tái mạch DNA ngun thủy 90 Bảng 13 14 trình bày kết cho thấy khác biệt vi khuẩn thật có sản phẩm probiotic so với kết nhà sản xuất cơng bố nhãn B ng 13: Kết định danh kỹ thuật PCR giải trình tự 16s rDNA kết định lượng vi khuẩn thật có probiotic sử dụng người STT Tên s✁n phẩm Tên vi khuẩn nhãn sản phẩm Kết PCR giải trình tự 16sDNA Biosubtyl DL Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bidisubtilis (gói giấy) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Bidisubtilis (gói nhơm) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bio – Acimin Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus pumilus 10 /gr Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Medilac – Vita Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus 10 /gr Bio Baby Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr 10 Bio Vita Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr 7 6 B ng 14: Kết định danh kỹ thuật PCR giải trình tự 16s rDNA kết định lượng* vi khuẩn thật có probiotic sử dụng cho thủy sản STT Tên sản phẩm Tên lượng* vi khuẩn nhãn sản phẩm DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Bio-DW Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus Probiotex-one Bacillus subtilis Kết định danh định lượng* thực tế Bacillus pumilus Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr B megaterium 11 Bacillus subtilis 10 /gr 4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 10 /gr Biozyme for fish Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Novazyme F Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Subtyl-LA Bacillus subtilis NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr ProKura Bacillus subtilis 10 Men gấu vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 11 Biobac Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus subtilis Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis 10 /gr Bacillus cereus Khơng tìm thấyL acidophilus Bacillus pumilus 11 Bacillus subtilis Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr Bacillus subtilis Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr 12 Pond clear Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr 13 Bio Pond Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 10 /gr 14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 15 Microzyme Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus 16 Zymmix Lactobacillus acidophilus 17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Zeofarm Bacillus pumilus 18 Lactobacillus acidophilus 5 Bacillus cereus Khơng tìm thấyL acidophilus ? Bacillus subtilis Khơng tìm thấyL acidophilus 10 /gr Acidovorax sp Clostridium phylofermentant 10 /gr L acidophilus 10 /gr *Chỉ nêu lên lượng vi khuẩn mà định danh PCR giải trình tự cho thấy kết khơng sai lệch 100 Phân tích kiện trình bày hai bảng trên, thấy sản phẩm probiotic dùng cho người, sai biệt hàm lượng kết kiểm tra so với cơng bố nhãn khơng nhiều (khơng q 10 lần), có đến 50% tên vi khuẩn cơng bố khơng với kết định danh Thậm chí có đến sản phẩm lại sử dụng B cereus, vi khuẩn khơng phép có mặt thực phẩm có khả gây tiêu chảy ói mữa chứa toxin, làm vi khuẩn trợ sinh Đối với sản phẩm probiotic dùng cho thủy sản, kết kiểm tra cho thấy vi khuẩn B subtilis, có 6/15 mẫu khơng phải B subtilis mà B cereus hay B pumilus; có sản phẩm có chứa L acidophilus hầu hết khơng tìm thấy vi khuẩn cơng bố nhãn Hình 49 minh họa kết giải trình tự gene 16s rDNA xác định vi Hình 49: M✪t chủng vi khuẩn phân lập từ sản phẩm probiotic chi dựa vào tính chất khuẩn lạc nhuộm Gram khơng thể biết khơng phải B subtilis, giải trình tự 16s rDNA xác định B cereus khuẩn B cereus nhãn sản phẩm lại B subtilis Còn mặt hàm lượng thật thảm hại, các sản phẩm kiểm tra thật có vi khuẩn cơng bố đa số hàm lượng tụt giảm từ 104 đến 105 so với cơng bố Kết nghiên cứu tiếng chng báo động để nhà sản xuất quan kiểm tra chất 101 lượng nên quan tâm đến vấn đề chất lượng sản phẩm probiotic sử dụng cho người thủy sản lưu hành Việt Nam; để kiểm tra chất lượng sản phẩm probiotic phải sử dụng PCR giải trình tự gene 16s rDNA có giải pháp định danh xác vi khuẩn sử dụng làm probiotic, tránh nhầm lẫn với vi khuẩn khơng có tác dụng probiotic hay chí độc hại Hình 50: M✂t phiếu lý lịch 16s rDNA chủng vi khuẩn dùng kiểm chuẩn với thơng tin tính chất khuẩn lạc, hình ảnh Gram, tính chất sinh hóa bản, quan trọng trình tự gene 16s rDNA 102 c Xây dựng lý lịch 16s rDNA chủng vi khuẩn dùng kiểm chuẩn Trong nội kiểm hay ngoại kiểm vi sinh, cần thiết phải dùng chủng vi sinh có lý lịch định danh chủng xác Các phòng thí nghiệm vi sinh thường u cầu cung cấp chủng quốc tế với lý lịch xuất phát từ nhà cung cấp chủng Hiện khó để đạt mua chủng gốc quốc tế vấn đề nguy khủng bố sinh học Chính giải pháp hay sử dụng chủng gốc quốc tế lưu giữ phòng thí nghiệm, chí sử dụng chủng gốc phân lập phải có lý lịch dịnh danh xác đến lồi Đứng trước u cầu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D Nam Khoa xây dựng lý lịch 16s rDNA tất chủng quốc tế ATCC, số chủng phân lập tiêu biểu cho giống loại vi khuẩn cần cho kiểm chuẩn Hình 50 minh họa lý lịch 16s rDNA chủng vi khuẩn phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vi R&D Nam Khoa để cung cấp dùng kiểm chuẩn Hình 51: M✄t kết định danh PCR giải trình tự 16s rDNA chủng vi sinh cơng nghiệp cho thấy Acrobacterium tumefaciens, vi khuẩn khó định danh vi sinh kinh điển 103 d Làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn Cũng với cơng nghệ PCR giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D Nam Khoa thực dịch vụ định danh vi khuẩn dùng vi sinh cơng nghiệm vi sinh nơng nghiệm gửi đến từ cơng ty, nhà máy, hay từ u cầu đề tài nghiên cứu Mẫu gửi đến để định danh chủng vi khuẩn cấy mơi trường ni cấy, dịch tách chiết DNA, hay huyền dịch vi khuẩn Có thể nói với giải pháp kỹ thuật PCR giải trình tự gene 16s rDNA, vi khuẩn dù lạ đến đâu, dù khó định danh đến đâu định danh đến lồi Hình 51 kết chủng vi khuẩn dùng vi sinh cơng nghiệm u cầu định danh, kết định danh cho thấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự để định danh vi nấm Trong xét nghiệm vi sinh định danh vi nấm có lẽ trở ngại lớn sử dụng phương pháp kinh điển khơng phân tích hình thái đại thể vi thể, phức tạp cơng phu, mà phải làm cho khảo sát sinh vật hóa học khác đồng hóa đường, phân tích chất biến dưỡng Chính thơng thường có phòng thí nghiệm vi sinh làm xét nghiệm vi nấm Nhận diện trở ngại kỹ thuật yếu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D cơng ty Nam Khoa cố gắng tìm giải pháp vượt qua, sau thời gian nghiên cứu - thử nghiệm, xây dựng giải pháp kỹ thuật sử dụng PCR giải trình tự gene 28s rDNA Ngun tắc giải pháp sử dụng NK FUNGI-DNAPREP đơn vị R&D cơng ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết DNA tồn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử chứa vi nấm cần định danh, sau sử dụng PCR với cặp mồi đặt tên NK 28s-F NK 28s-R đặc hiệu đoạn DNA dài khoảng 260 bps có chứa trình tự đặc hiệu giống lồi vi nấm gene 26s rDNA, sau giải trình tự trực tiếp chiều sản phẩm PCR để định danh vi nấm qua blast search ngân hàng liệu gene NCBI Ứng dụng giải pháp kỹ thuật này, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D cơng ty Nam khoa thực thành cơng hai dịch vụ, là: 104 a Phát định danh vi nấm bi nấm lấy từ phẫu thuật bệnh nhân viêm xoang Trước đây, bệnh phẩm bi nấm (fungus ball) thường bác sĩ tai mũi họng gửi đến phòng thí nghiệm giải phẩu bệnh kết thường nhận sau tuần nhìn thấy vi thể sợi tơ nấm nghi Aspergillus Hiện với xét nghiệm PCR Penicit rium cit rinum (5%) M alassezia rest rict a (3%) Rhinocladiella at rovirens (5%) X ylaria curt a (2 %) Neosart orya f ischeri (3%) A spergillus niger (7%) Cand ida ort hopsilosis (2%) A spergillus f umigat us 23 (4 0%) hizophyllum cominune (2%) Pichia guilliermo ndii (2%) Pseudallescheria boydi (7%) A spergillus f lavus (3%) A spergillus oryzae 11 (19%) Bi★u ✬☎ 12: Tổng kết kết phát định danh nấm kỹ thuật PCR giải trình tự 28s rDNA mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang bệnh nhân giải trình tự thực phòng thí nghiệm NK-biotek nhà lâm sàng có kết sau ngày với định danh vi nấm đến lồi Biểu đồ 12 tổng kết kết phát định danh vi nấm bi nấm bệnh viện Tai Mũi Họng TP.Hồ Chí Minh gửi đến thời gian gần Có tổng cộng 58 mẫu gửi đến làm xét nghiệm, 58 phát định danh vi nấm tác nhân gây bệnh b Dịch vụ định danh vi nấm Trên sở kỹ thuật PCR giải trình tự gene 28s rDNA, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D cơng ty Nam Khoa triển khai xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm với nguồn mẫu từ cơng ty, nhà máy lĩnh vực cơng nơng nghiệp, từ phòng thí nghiệm trường đại học hay trung tâm nghiên cứu Có thể nói nay, khơng có mẫu vi nấm gửi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek khơng có kết định danh Hình 52 hình 53 minh họa hai kết định danh nấm xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm NKBiotek 105 Hình 52: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men góc trái cho kết PCR giải trình tự 28s rDNA bên dưới, từ trình tự kết blast search ngân hàng gene NCBI cho kết định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99% Hình 53: Vi nấm có hình dạng vi thể hình que dài góc trái cho kết PCR giải trình tự 28s rDNA bên dưới, từ trình tự kết blast search ngân hàng gene NCBI cho kết định danh Rhinocladiella atrovirens với độ tương đồng 99% Ứng dụng PCR giải trình tự để phát định lượng xác định genotype HCV Phát hiện, định lượng xác định genotype HCV thơng số mà bác sĩ cần phải biết trước cho định điều trị đặc hiệu interferon phối hợp với ribavirin phát đồ điều trị chuẩn cho bệnh nhân có antiHCV [+] Phát HCV-RNA để xác định bệnh nhân nhiễm HCV, định lượng HCV-RNA để xác định lượng virus trước bắt đầu điều trị làm sở để theo dõi hiệu điều trị, xác định genotype HCV để giúp bác sĩ điều trị định thời gian điều trị cho bệnh nhân Thơng thường phòng thí nghiệm lâm sàng phải thực u cầu riêng lẽ, nghĩa họ phải phát HCV-RNA trước, định lượng, cuối 106 định genotype HCV thường u cầu kỹ thuật nên xét u c✆u xác ✝✞nh genotype HCV nghiệm phải mẫu huyết bệnh nhân Cơng ty Nam Khoa lại sử dụng tiếp cận khác mẽ, tiện lợi, tốn ❋✞nh lượng HCV-RNA b❍ng xét nghiệm để phát triển giải pháp tồn RT-qPCR sử dụng kit NK RT-HCVqPCR diện thực u cầu bác sĩ lúc Đó giải pháp sử dụng RT real-time PCR để Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp vùng 5’NC) phát định lượng HCV-RNA mẫu huyết bệnh nhân sau giải trình tự trực tiếp sản phẩm real-time PCR để xác định genotype HCV cách so chuỗi trình tự giải CEQ8000 (8 capillaries) với ngân hàng liệu genotype HCV thư viện NCBI thư viện KẾT QUẢ 24 gi❅ sau nh❖n m€u Los Alamos Để xác định genotype HCV, ngồi ABI 3130XL (16 capillaries) ✟✠nh lượng 37.017 copies/ml Ki✾u gene 1c lý mắt xích giải pháp tồn diện nêu trên, cơng ty Nam Khoa chọn tiếp cận giải trình có nhiều lý do: (1) Nếu sử dụng kit InoLIPA Siemen (Bayer) kit nhà y học thừa nhận lựa chọn tốn giá thành kit cao, kết có đơi Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR giải trình tự vùng 5’NC để phát hiện, định lượng định genotype HCV khơng phân biệt subtype, với version cũ có nhầm lẫn 6a 1b; (2) Nếu sử dụng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC HCV hệ thống giải trình tự kín Trugene Siemen (Bayer) dù nhiều nhà y học thừa nhận, lựa chọn tốn giá 107 thành vật liệu tiêu hao kèm theo hệ thống cao; (3) Sử dụng phương pháp real-time PCR với probe đặc hiệu tiếp cận đơn giản rẻ tiền khơng đủ nhạy c✽m cho ch✡n đốn vùng khuếch đại khơng phải vùng 5’ NC (là vùng cơng nhận nhạy cảm cho chẩn đốn), khơng có kh✽ phân biệt cao subtype thường gặp khó thiết kế probe đặc hiệu đến subtype, nguy phát chéo khơng đặc hiệu mà l✱m t✭☛ng có kh✽ phát ☞✌ng nhi❄m Chính lý trên, Phòng thí Nghiệm Y Khoa NK-BIOTEK cơng ty Nam Khoa nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm xác định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC HCV thay sử dụng hệ thống giải trình tự kín Trugene, sử dụng hệ thống giải trình tự mở ABI (máy ABI ✸✍✸✎✏✑ có 16 mao qu✽n) hay Beckman Coulter (máy ❈✒✓✔✎✎✎ có mao quản) Tiếp cận mang đến cho bệnh nhân nhà lâm sàng nhiều lợi điểm: (1) Nhờ giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR từ real-time PCR sử dụng mồi taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC nên kết xét nghiệm xác định genotype ln kèm với kết định lượng ✕C❱✖✗✘✙ Do nhà lâm sàng trước định điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân cần cho định xét nghiệm xác định genotype HCV đủ mà khơng cần cho thêm xét nghiệm định lượng (2) Đạt độ nhạy cho chẩn đốn nhờ sản phẩm đích để giải trình tự xác định genotype HCV sản phẩm PCR dựa vùng đích 5’NC vùng genome HCV thừa nhận đủ nhạy cảm để làm chẩn đốn xác định định lượng HCV (3) Đạt độ xác xác định genotype HCV khơng khác biệt với hệ thống giải trình tự kín Trugene nhờ giải Bi u đ 13: Phân bố genotype HCV 2000 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HCV gửi đến xét nghiệm phòng thí nghiệm NK-Biotek năm 2008 trình tự đoạn đích mà hệ thống Trugene sử dụng vùng 5’-NC genome HCV (4) Nhà lâm sàng hay nghiên cứu cung cấp thơng tin trình 108 tự vùng 5’NC giải thơng tin q giá nghiên cứu phylogenetic để góp phần nghiên cứu nguồn gốc nhiễm trùng hay nghiên cứu đồng nhiễm HIV/HCV Hình 54 tóm tắt qui trình phát hiện, định lượng định genotype HCV kỹ thuật RT real-time PCR đích vùng 5’ NC gene HCV sau giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định genotype HCV Trong năm 2008, tổng kết 2000 mẫu xét nghiệm định genotype HCV thực phòng thí nghiệm NK-Biotek, chúng tơi nhận thấy đa số genotype HCV nhiễm bệnh nhân 1b (58%), kế 6a (17%) Biểu đồ 13 tổng kết phân bố genotype HCV 2000 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HCV gửi đến xét nghiệm phòng thí nghiệm NK-Biotek năm 2008 Áp dụng PCR giải trình tự để phát đột biến kháng thuốc HBV Hiện Việt Nam, nhờ tiến kỹ thuật sinh học phân tử định lượng HBV để làm sở đánh giá hiệu điều trị; phát đồ thuốc có khả điều trị bệnh viêm gan virus B mạn tính ln có sẵn thị trường để bác sĩ dễ dàng lựa chọn, nên việc điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính phổ biến Tuy nhiên, điều trị đặc hiệu bệnh lý viêm gan virus B mạn tính thuốc kháng virus điều trị lâu dài Chính nên HBV (virus viêm gan B, hepatitis B virus) có hội tiếp xúc lâu dài với thuốc kháng virus tạo đột biến kháng thuốc, từ nảy sinh u cầu phải có xét nghiệm phát đột biến kháng thuốc HBV, đặc biệt thuốc lamivudine, adefovir entecavir thuốc thường sử dụng Để phát đầy đủ đột biến kháng thuốc nêu trên, chọn tiếp cận realtime PCR hay PCR-RFLP phát đột biến kháng thuốc HBV có q nhiều biến thể HBV làm cho việc thiết kế probe phát đột biến hay thiết kế vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn nhiều Hơn nay, y văn báo cáo có real-time PCR PCRRFLP phát đột biến kháng lamivudine hai vị trí 180 204 nhiều đột biến khơng tạo cho virus kháng lamivudine, mà adefovir entecavir Chọn tiếp cận chắn khơng đáp ứng thực tế 109 Do phòng thí nghiệm NKu c✚u tìm ✛✜t bi❊n kháng thu◗c HBV BIOTEK cơng ty Nam Khoa chọn tiếp cận khác dựa phương tiện trang thiết bị PC❘ khuếch đại đọan đặc hiệu 550bps vùng gene pre❙ HBV đại có cơng ty, tiếp cận PCR giải trình tự đoạn DNA dài 550 bps vùng Tìm đột biến kháng thuốc: giải trình tự trực tiếp sản phẩm P✢❘ 550bps từ vùng gene pre❙ gene preS để làm xét nghiệm phát Lamivudine, đột biến Adefovir kháng Entecavir Xét nghiệm dựa tiếp ABI 3130XL (16 capillaries) cận nhiều KẾT QUẢ (24 sau nhận mẫu) nhà lâm sàng nghiên cứu y học tin cậy nhờ ưu điểm sau: (1) Phát hầu hết vị trí đột biến xảy để gây kháng loại thuốc trên; (2) Với độ nhạy cảm thiết bị giải trình tự TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATC AACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGG AAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA GTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAAC ATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT (sequencer ABI 3130XL, giải hai chiều), khơng tất điểm đột biến kể giải đến, mà tình trạng heterozygote đột biến/hoang dại phát hiện; (3) Với trình tự giải được, kết xét nghiệm cung cấp thơng tin cách xác genotype HBV mà khơng cần phải có định xét nghiệm Genotype Phát đột biến Kháng Lamivudine I169T V173L L180M A181T T184S M204I V207M/I Q215S KQ K K Có K K Có K K Genotype C Kháng Adefovir L80V/I S85A V84M A181V/T V214A Q215S N236T KQ K K K K K K K Kháng Entecavir T184G S202I M250V KQ K K K Hình 55: Qui trình xét nghi❂m phát hi❂n đột biến kháng thuốc xác định genotype HBV kỹ thuật PCR giải trình tự đọan DNA 550 bps gene PreS HBV từ lâm sàng Hình 55 mơ tả qui trình xét nghiệm PCR giải trình tự gene preS để phát đột biến kháng thuốc xác định genotype HBV, kết phát đột biến trình bày bảng liệt kê vị trí đột biến đột biến kháng 110 lamivudine, adefovir entecavir nhà nghiên cứu ghi nhận tất vị trí đột biến nằm trình tự giải 54.28 60 Trong năm 2008, phòng thí nghiệm 50 NK-Biotek cơng ty Nam Khoa thực 40 455 xét nghiệm PCR giải trình 30 tự vùng gene PreS HBV, kết cho 20 thấy có đến 69% trường hợp thuộc 10 genotype B 31% genotype C, khơng có genotype khác Có 46% phát có đột biến kháng lamivudine với 30% vị trí 29.89 8.79 6.59 0.45 204 204+207 204+180 204+180+207 KhôngĐB Bi u đ 14: S❀ phân bố tỷ lệ vị trí đột biến kháng lamivudine phát 204, 9% hai vị trí 204 207, 6.5% 204 180, 0.5% đột biến 204, 180 207 Kết trình bày biểu đồ 14 Áp dụng PCR giải trình tự phát đột biến promoter genotype HBV Trong q trình phản ứng với đáp ứng miễn dịch từ bệnh nhân, HBV bị đột biến precore đột biến core promoter Đột biến precore đột biến vị trí nucleotide 1896 từ G thành A (G1896A) làm cho codon TGG trở thành TAG stop codon Đột biến làm cho HBV khơng thể tổng hợp HBeAg Do vậy, thử máu bệnh nhân, khơng phát HBeAg mà HBV-DNA tồn lại với HBeAb [+] Đây đột biến quan trọng cần phải phát bệnh nhân có nguy cao vào xơ gan hay ung thư gan, đặc biệt phát thêm đột biến core promoter hai vị trí nucleotide 1762 1764 (A1762T, G1764A) Khi bệnh nhân bị phát mang HBV có đột biến phải điều trị thuốc kháng virus suốt đời Chính tầm quan trọng lâm sàng nên thời gian qua phòng thí nghiệm NK-BIOTEK & cơng ty Nam Khoa xây dựng kỹ thuật PCR giải trình tự vùng gene core để làm xét nghiệm phát đột biến precore đột biến core promoter khơng vậy, cho biết thêm genotype HBV Hình 56 minh họa qui trình Xét nghiệm nhiều nhà lâm sàng nghiên cứu y học quan tâm tin cậy Trong năm 2008, phòng thí nghiệm NK-Biotek cơng ty Nam Khoa 111 thực 134 mẫu xét nghiệm đột u c✣u tìm ✤✥ t biến precore/promoter HBV ✯ B nh nhân có HBeAg- HBeAb+, HBVDNA+, ALT ↑↓ bất thường biến precore core promoter HBV bệnh nhân bị bác sĩ điều trị nghi ngờ có đột biến precore/core PC✦ khuếch đại đọan đặc hiệu 250bps vùng gene core HBV promoter Kết cho thấy có đến 73% phát đột biến với nhiều kiểu đột Tìm đột biến precore/promoter: giải trình tự trực tiếp sản phẩm P✧✦ 250bps từ vùng gene core biến khác nhau, đột biến precore, đột biến core ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries) promoter, đột biến promoter ✩ KẾT QUẢ ✮ (24 gi sau nh n mẫu) core promoter Các thơng tin hữu dụng để nhà y học nghiên cứu sâu mối liên hệ với lâm sàng, bệnh học sinh bệnh học Biểu đồ 15 trình bày tỷ lệ phân bố kiểu đột biến phát PCR giải trình tự phát đột biến kháng rifampicine INH M tuberculosis Từ năm 1996, chúng tơi bắt đầu Hình 56: Qui trình PCR giải trình tự phát đột biến precore/promoter triển khai kỹ thuật PCR phát M tuberculosis xét A1762T nghiệm PCR phát M tuberculosis 1% G1896A 6% A1762T G1896A 36 26% chúng tơi phát triển Khơng đột biến 27 19% nhà y học nước chấp nhận nhờ độ nhạy cảm cao so với khảo sát trực tiếp ni cấy Với PCR, kết phát M tuberculosis đến tay nhà G1896A A1762T, G1764A lâm sàng 24 sau gửi mẫu 28 20% xét nghiệm Nhờ ưu điểm nhanh chóng 38 28% A1762T, G1764A nhạy cảm nên nói cơng cụ Bi u đ 15: Tỷ lệ phân bố kiểu đột biến precore/core promoter phát 134 mẫu xét nghiệm PCR mang đến lợi ích khơng 112 405 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG Pro CCG Leu CTA Val GTC / / Dele Leu TTG (3%) (3%) (9%) (1%) (1%) Tyr TAC Asp GAC Gln CAG Asn AAC Arg CGC Pro CCC Leu TTG Gln CAG Trp TGG Pro CCG (1%) (52%) (28%) Hình 57: Vùng nóng với đột biến rpoB gene tỷ lệ thường xãy chối cãi lĩnh vực chẩn đốn lao, vượt qua cơng cụ vi sinh kinh điển Một vấn đề nhà y học quan tâm làm có kết kháng sinh đồ vi khuẩn M tuberculosis với thời gian ngắn hơn, với phương pháp vi sinh kinh điển kết kháng ✉ c❃ u PCR phát MTB Tìm đột bi✰n kháng Rifampicine INH sinh đồ có sau tháng với tháng để có vi khuẩn mọc mơi trường ni cấy tháng để có kết kháng sinh đồ PCR khuếch đại trình tự đặc hiệu chứa đột biến rpoB, katG, inhA PCR phát MTB dựa khuếch đại trình tự 249bp IS6110 Thơng tin kháng sinh đồ mà bác sĩ cần biết liệu vi Giải trình tự phát đột bi✰n rpoB, katG inhA K✰t phát MTB vòng 24giờ khuẩn phân lập bệnh nhân ●✲t bi❉n rpoB có đề kháng với thuốc kháng L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V lao rifampicin, coi hiệu hay khơng để tiếp tục trì hay định cho bệnh nhân ●✲t bi❉n kat✵ cơng ●✲t bi❉n inhA S315T thức kháng lao có C-15T K✰t kháng sinh đồ MTB 72 sau lấy mẫu đàm rifampicine Trước thực tế đòi hỏi này, phòng thí nghiệm NK-Biotek đơn vị R&D cơng ty Nam Hình 58: Mơ tả qui trình PCR giải trình tự để phát đột biến kháng rifampicin INH vi khuẩn M tuberculosis trực tiếp từ mẫu đàm mà khơng phải qua ni cấy Kết đến tay nhà lâm sàng 72 sau lấy mẫu đàm 113 Khoa nghiên cứu thử nghiệm qui trình PCR giải trình tự để khuếch đại vùng nóng gene rpoB M tuberculosis để phát tất đột biến thường xảy tạo cho vi khuẩn kháng rifampicine (hình 57) Ngồi vùng nóng này, chúng tơi thành cơng xây dựng qui trình phát đề kháng INH kỹ thuật PCR giải trình tự gene katG để phát vị trí đột biến thường gặp S315T gene inhA để xác định vị trí đột biến C-15T Hiện qui trình chúng tơi áp dụng để phát trực tiếp đột biến kháng thuốc từ bệnh phẩm mà khơng cần thiết phải qua ni cấy Hình 58 minh họa tóm tắt qui trình phòng thí nghiệm NK-Biotek thực để phát MTB cho ln kết kháng sinh đồ 72 sau lấy mẫu đàm từ bệnh nhân Hiện chúng tơi tiếp tục nghiên cứu để có thêm kết kháng sinh đồ phát đột biến kháng thuốc kháng lao khác ethambutol, PAS, PZA, Ofloxacin để đáp ứng cách đầy đủ u cầu đến từ nhà lâm sàng chiến đấu chống lại tình hình lao đa kháng ngày trầm trọng 114 [...]... phát triển một giải pháp tồn RT-qPCR sử dụng kit NK RT-HCVqPCR diện thực hiện được các u cầu này của bác sĩ cùng một lúc Đó là giải pháp sử dụng RT real-time PCR để Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp trên vùng 5’NC) phát hiện và định lượng HCV-RNA trong mẫu huyết thanh bệnh nhân và sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm real-time PCR để xác định genotype HCV bằng... Lấy 5µl dịch nổi cho vào PCR mix 45µl chứa sẵn các thành phần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu lồi trên gene 16S của vi khuẩn Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase, rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’ Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của... thuốc nêu trên, nếu chọn tiếp cận realtime PCR hay PCR- RFLP thì chỉ có thể phát hiện được rất ít đột biến kháng thuốc của HBV vì có q nhiều các biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát hiện đột biến hay thiết kế các vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất nhiều Hơn nữa cho đến hiện nay, y văn chỉ mới báo cáo có real-time PCR và PCRRFLP phát hiện đột biến kháng lamivudine... 15 trình bày tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến phát hiện được 6 PCR và giải trình tự phát hiện đột biến kháng rifampicine và INH của M tuberculosis Từ năm 1996, chúng tơi đã bắt đầu Hình 56: Qui trình PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/promoter triển khai kỹ thuật PCR phát hiện M tuberculosis và cho đến hiện nay xét A1762T nghiệm PCR phát hiện M tuberculosis 2 1% 9 G1896A 6% A1762T G1896A... dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn Nhờ phát hiện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK 16s-F và NK 16s-R khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và lồi các vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của cơng ty Nam Khoa đã xây dựng thành cơng qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR này để... vì với phương pháp vi sinh kinh điển thì kết quả kháng ✉ c❃ u PCR phát hiện MTB Tìm đột bi✰n kháng Rifampicine và INH sinh đồ chỉ có thể có được sau hơn 2 tháng với 1 tháng để có được vi khuẩn mọc được trên mơi trường ni cấy và 1 tháng để có kết quả kháng sinh đồ PCR khuếch đại trình tự đặc hiệu chứa các đột biến trên rpoB, katG, và inhA PCR phát hiện MTB dựa trên khuếch đại trình tự 249bp trên IS6110... dịch vi khuẩn Có thể nói với giải pháp kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16s rDNA, các vi khuẩn dù lạ đến đâu, dù khó định danh đến đâu cũng đều được định danh đến lồi Hình 51 là kết quả một chủng vi khuẩn dùng trong vi sinh cơng nghiệm được u cầu định danh, và kết quả định danh cho thấy đây là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2 Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm Trong các... thời gian nghiên cứu - thử nghiệm, đã xây dựng được một giải pháp kỹ thuật đó là sử dụng PCR và giải trình tự gene 28s rDNA Ngun tắc của giải pháp này là sử dụng bộ NK FUNGI-DNAPREP do đơn vị R&D của cơng ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết DNA tồn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử chứa vi nấm cần định danh, sau đó sử dụng PCR với một cặp mồi được đặt tên là NK 28s-F và NK 28s-R đặc hiệu một đoạn DNA dài khoảng... Hình 52: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99% Hình 53: Vi nấm có hình dạng vi thể hình que dài như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast... người Chúng tơi xin trình bày ra đây ba trong số những chiến Dùng PCR để tổng hợp các gen Clone vào các vector lược đó (1) Nhờ kết quả giải trình tự bộ gen người, các nhà khoa học sẽ Đưa vào các hệ thống tế bào biểu hiện nhanh chóng xác định các trình tự mang gen Với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như kỹ thuật Lập thư viện protein PCR, các nhà khoa học sẽ dễ dàng nhân bản các gen này trong ống