PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) và một số ỨNG DỤNG TRONG VI SINH vật

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG VI SINH VẬT Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR nhà vi sinh Kary Mullis nghiên cứu phát minh vào năm 1980 Những ứng dụng phương pháp có ý nghĩa lớn chẩn đoán vi sinh, nghiên cứu có độ nhạy độ đặc hiệu cao Với thành tựu ông nhận giải thưởng Nobel năm 1993 1.1 Nguyên lý Phản ứng PCR dùng đoạn mồi (primer) đặc hiệu để khuyếch đại đoạn ADN nhỏ đặc hiệu phân tử ADN Đoạn ADN gen một phần gen trình tự không mã hóa Hầu hết kỹ thuật PCR khuyếch đại đoạn ADN có kích thước 10kp, cho dù có số kỹ thuật cho phép khuyếch đại đoạn ADN có kích thước tới 40 kb Phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo trình chép ADN tế bào Trong ADN nhân lên theo chế bán bảo tồn Từ phân tử ADN chuỗi kép ban đầu tách làm chuỗi đơn, chuỗi đơn làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp ADN mới, chu kỳ nhân lên ADN tế bào chia làm giai đoạn: tách chuỗi kép thành hai chuỗi đơn dùng làm khuôn mẫu tổng hợp ADN mới, nơi chuỗi tách rời nhau, mồi đặc hiệu đến lai ghép theo nguyên tắc bổ sung kéo dài đoạn mồi lai ghép nhờ ADN polymerase để tạo nên ADN Từ phân tử ADN ban đầu sau chu kỳ chép tạo thành phân tử ADN chuỗi kép Do vậy, ADN sau n chu kỳ nhân đôi thu [sup]n-1[/sup] ADN [52] 1.2 Các điều kiện để tiến hành kỹ thuật PCR 1.2.1 Thành phần tham gia phản ứng - Một cặp mồi (5' - 3'): đoạn ADN có trình tự bổ sung với đoạn ADN nhỏ vùng ADN khuyếch đại theo chiều từ 5’ – 3’ Ví dụ mồi cho vi khuẩn Haemophilus influenzae (gen bexA): Hib : GCG AAA GTG ACC TCT TAT CTC TC Hib : GCT TAC GCT TCT ATC TCG GTG AA - Enzyme Taq ADN polymerase ADN polymerase với nhiệt độ hoạt động tối ưu xung quanh 70[sup]o[/sup]C - Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) gồm : ATP (Adenin), TTP (Thymin), GTP (Guanin), CTP (Cytosin) - Thang ADN mẫu dùng diện di gen - Đệm, nước khử ion, MgCl[sub]2[/sub] 25mM, KCl 50mM 1.2.2 Dàn máy PCR Máy điều nhiệt (Thermal cycler): - Bộ điện di: - Máy chụp gen: 1.3 Các bước tiến hành phản ứng PCR 1.3.1 Tách chiết ADN Đây giai đoạn tách chiết AND khỏi tế bào Có nhiều phương pháp tách chiết nhiệt độ KIT thương mại Ví dụ: tách chiết AND Haemophilus influenzae - Cho vi khuẩn vào 500ml PBS để có độ đục Mac farland (10[sup]9[/sup]– 5.10[sup]9[/sup] vi khuẩn) Sau tiến hành khuấy máy Vortex - Đun cách thuỷ 20 phút để giải phóng ADN - Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/10 phút - Chuyển phần nước (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf - ADN khuôn mẫu bảo quản tủ -70[sup]0[/sup]C không tiến hành phản ứng 1.3.2 Quá trình khuyếch đại gen: Phản ứng PCR thực sau cho tất thành phần phản ứng vào, bao gồm: mẫu tách chiết ADN, Taq ADN polymerase, dNTP thành phần khác (Ví dụ: Phản ứng PCR mẫu chẩn đoán Haemophilus influenzae thực với thể tích cuối 50 ml, bao gồm: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), mM MgCl[sub]2[/sub], 200 mM loại dNTP, 2.5U Taq ADN polymerase 40 pmol mồi) Quá trình khuyếch đại gen trải qua giai đoạn [41]: - Giai đoạn 1: Biến tính ADN khuôn mẫu khoảng 95[sup]0[/sup]C (thời gian tuỳ loại vi khuẩn) sợi ADN tách rời nhau, bộc lộ trình tự chuỗi đích (là đoạn ADN đặc hiệu cần khuyếch đại) - Giai đoạn 2: Gắn mồi khoảng 55[sup]0[/sup]C (thời gian tuỳ loại vi khuẩn) nucleotide đoạn mồi xuôi mồi ngược gắn bổ sung với nucleotide đầu (trên sợi) đoạn gen cần tổng hợp - Giai đoạn 3: Kéo dài mồi khoảng 72[sup]0[/sup]C (thời gian tùy loại vi khuẩn) nhờ hoạt động Taq ADN Polymerase mà dNTPs gắn vào đầu 3’của đoạn mồi theo trình tự bổ sung với nucleotide ADN khuôn mẫu Khi trình tổng hợp hoàn thành, đoạn mồi phần sợi ADN tổng hợp Cứ vậy, giai đoạn lặp lặp lại khoảng 30 chu kỳ Đoạn ADN tổng hợp lại tham gia làm khuôn mẫu cho phản ứng Kỹ thuật PCR cho phép nhân lên đoạn vật liệu di truyền với tốc độ nhanh nhiều lần so với nhân lên chúng tế bào Chỉ khoảng thời từ 2-4 giờ, số lượng tăng lên tới hàng triệu lần so với ban đầu 1.3.3 Điện di: Sản phẩm đoạn ADN khuyếch đại điện di thạch agarose Tùy theo kích thước ADN mà sử dụng điện trường khác 1.3.4 Đọc kết quả: Dựa vào ADN mẫu đèn cực tím, xác định sản phẩm khuyếch đại tương ứng với kích thước ADN 6, 7, 8, (Haemophilus influenzae typ b) Một số ứng dụng phản ứng PCR vi sinh vật Dựa nguyên tắc khuyếch đại đoạn gen đặc hiệu, tất vi sinh vật gây bệnh tìm nhờ PCR Sau số ứng dụng điển hình: 2.1 Dùng PCR để chẩn đoán vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo nuôi cấy khó khǎn: - Các xoắn khuẩn: tất xoắn khuẩn khó nuôi cấy Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), chưa nuôi cấy nhân tạo Người ta dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1) Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh chẩn đoán sớm - Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy Neisseria gonorrhoeae (4) tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum Mycoplasma genitalium) đồng thời tìm ống PCR với bệnh phẩm nước tiểu (5) Điều mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh cách sát thực hơn, trước điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh - Vi khuẩn lao: Mycobacterium tuberculosis khó nuôi cấy; vậy, chúng mọc chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E coli, khoảng 20 phút) Khoảng tháng sau nuôi cấy nhìn thấy khuẩn lạc lao Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng phương pháp nuôi cấy bị hạn chế nhiều Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm có độ nhạy (phải có 10[sup]5[/sup] vi khuẩn/ml đờm cho kết dương tính) PCR góp phần đắc lực giải việc Nó cho kết vòng ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với phương pháp cổ điển Vì vậy, chứng minh có mặt vi khuẩn lao dịch não tuỷ, nước tiểu loại bệnh phẩm chứa vi khuẩn mà trước chẩn đoán khó khǎn Ngày nay, người ta dùng PCR để xác định đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu có giá trị để coi M tuberculosis đa đề kháng) gen rpoB Nhờ vậy, biện pháp điều trị phù hợp áp dụng cách kịp thời; điều mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân cộng đồng, chủng vi khuẩn lao đa đề kháng hạn chế tung môi trường bên - Helicobacter pylori (HP): HP vấn đề thời Y học giới vai trò quan trọng bệnh lý viêm, loét ung thư dày Tuy vậy, nuôi cấy HP khó PCR dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dày, tìm gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính Nhờ PCR, người ta biết phân bố chủng HP khác vùng địa lý khác chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến tình trạng bệnh lý định - Các vi khuẩn khác Coxiella burnetti với mảnh 438-bp gen mã hoá cho protein 27kDa màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp 16S ARNr khuyếch đại thành công PCR - Amib: Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính Entamoeba histolytica, người ta phân biệt amíp gây bệnh amíp không gây bệnh (6) - Virus: Virus viêm gan B (7,8), HIV, virus thuỷ đậu, virus Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus Enterovirus chẩn đoán thành công PCR Đối với HIV, tài liệu dẫn cho thấy PCR cho kết dương tính sớm dấu hiệu biến đổi miễn dịch từ - tháng Đặc biệt kỹ thuật cho phép chẩn đoán HIV trẻ sơ sinh, mà kháng thể kháng HIV trẻ lúc này, có thể, đơn từ mẹ truyền sang 2.2 Xác định độc tố vi sinh vật: Tiểu đơn vị A độc tố ruột không chịu nhiệt Escherichia coli, gần đây, gen elta elfB E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia coli, ETEC); vt1 vt2 E coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA bfpA E coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) Shigella khuyếch đại PCR nhằm chẩn đoán phân biệt loại Escherichia coli gây tiêu chảy PCR khuyếch đại gen nói thay bổ sung cho thử nghiệm kinh điển có độ nhậy độ đặc hiệu thay cho kỹ thuật phức tạp Độc tố ruột vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo chế gây bệnh chúng PCR dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, phân biệt cách chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực với Vibrio cholerae khác, thuộc nhóm huyết không gây bệnh tả (trước gọi Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG) Clostridium difficile định loại thông qua xác định loại độc tố riêng biệt chúng PCR 2.3 Xác định vi khuẩn môi trường: Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt môi trường tìm trực tiếp PCR, ví dụ Legionella, Salmonella, Shigella Vibrio cholerae Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh áp dụng rộng rãi PCR có lợi lớn nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính "giờ" so với kỹ thuật kinh điển phải tính "ngày"), nhạy (độ nhạy cao, cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, đủ) độ đặc hiệu cao Nhờ vậy, bệnh chẩn đoán nhanh xác Giá trị chẩn đoán bệnh PCR đặc biệt trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy nuôi cấy khó khǎn, tốn kém; kết nuôi cấy chậm, bệnh nhân dùng kháng sinh trước vào viện, PCR không thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống Tuy vậy,cho đến nay, điểm hạn chế (như đòi hỏi phải có trang thiết bị nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán kỹ thuật phải có trình độ định; kỹ thuật thực phức tạp), PCR bổ sung không thay hẳn phương pháp chẩn đoán kinh điển khác 2.4 Định loại (identification) vi khuẩn Sau phân lập vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng định loại chúng Đối với vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm vi khuẩn Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn cho PCR đơn giản: cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn 10 phút thu lấy dịch sau ly tâm loại bỏ tế bào đủ 2.5 Phân loại (classification) vi khuẩn Nhờ khuyếch đại đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết xác  ... ứng dụng phản ứng PCR vi sinh vật Dựa nguyên tắc khuyếch đại đoạn gen đặc hiệu, tất vi sinh vật gây bệnh tìm nhờ PCR Sau số ứng dụng điển hình: 2.1 Dùng PCR để chẩn đoán vi sinh vật chưa nuôi cấy... bệnh PCR đặc biệt trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy nuôi cấy khó khǎn, tốn kém; kết nuôi cấy chậm, bệnh nhân dùng kháng sinh trước vào vi n, PCR không thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống... dụng điện trường khác 1.3.4 Đọc kết quả: Dựa vào ADN mẫu đèn cực tím, xác định sản phẩm khuyếch đại tương ứng với kích thước ADN 6, 7, 8, (Haemophilus influenzae typ b) Một số ứng dụng phản ứng