K thut PCR VA RT PCR 1 1 e d b 1 e c 7

Kỹ thuật PCR VÀ RT-PCR Giới thiệu chung 1.1 Bản chất PCR RT-PCR Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Kary Mullis tìm năm 1983 trao giải Nobel Hóa học 10 năm sau ứng dụng to lớn Nhờ có PCR mà □ lượng ADN khơng đủ nhiều □ khơng cịn trở ngại chẩn đoán nghiên cứu sinh học phân tử dựa sở ADN PCR phương pháp in vitro để tổng hợp trình tự xác định ADN nhờ enzyme Phản ứng sử dụng đoạn mồi oligonucleotide gắn đặc hiệu với chuỗi bổ trợ kéo dài chuỗi theo trình tự ADN đích cần khuếch đại nhờ enzyme Taq ADN polymerase PCR trình nhắc lại phản ứng liên tục: biến tính ADN sợi kép thành ADN sợi đơn; gắn mồi đặc hiệu vào chuỗi ADN sợi đơn đầu 5’- 3’; kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính enzyme từ đầu 3’ theo hướng 3’ – 5’ để tổng hợp chuỗi ADN bổ trợ Ba bước hợp thành chu kỳ sản phẩm vừa tổng hợp lại trở thành khn mẫu nên số lượng ADN đích gần tăng gấp đôi sau chu kỳ, chu kỳ nhắc lại làm tăng theo cấp số mũ số ADN đặc hiệu, nhiên, hiệu khuếch đại phản ứng đạt 100% lý thuyết Chiều dài sản phẩm tổng chiều dài đoạn mồi chiều dài khoảng cách đoạn mồi khn mẫu Hình Ngun lý PCR RT-PCR Vì acid ribonucleic (ARN) khơng thể đóng vai trị làm khn mẫu trực tiếp cho PCR nên cần kết hợp bước phiên mã ngược (reverse transcription – RT) với PCR để ARN chuyển thành ADN bổ trợ (cADN) trở thành khn mẫu thích hợp cho PCR Khi hai kỹ thuật kết hợp với nhau, ngôn ngữ chuyên ngành giao tiếp hàng ngày gọi phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) Trước đây, giai đoạn RTPCR thực riêng biệt bước thưòng kết hợp lần làm thử nghiệm gọi RT-PCR bước (one-step RT-PCR) Áp dụng RT-PCR để phát ARN nghiên cứu chẩn đoán cho ta phương pháp nhanh, hiệu quả, nhạy đặc hiệu 1.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến PCR RT-PCR: Có thể điều chỉnh thành phần lý học hay hóa học PCR để tăng hiệu khuếch đại, độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng Các yếu tố không độc lập với 1.2.1 Máy chu kỳ nhiệt tự động (máy PCR) Vì phản ứng khuếch đại gồm nhiều chu kỳ chu kỳ lại gồm nhiều bước ủ nhiệt nên cần có máy chu kỳ nhiệt tự động (máy PCR) Một máy PCR tốt tối thiểu phải có khả trì xác ổn định giai đoạn ủ nhiệt, thay đổi khung nhiệt độ khoảng thời gian xác định (ramp), đạt xác, không cao không thấp nhiệt độ đích 1.2.1 Loại tube phản ứng Tube tác động đến tỷ lệ truyền nhiệt từ máy sang hỗn dịch phản ứng nên cần sử dụng tube chuyên dụng cho PCR vừa với khung giá đỡ tube 1.2.3 Chu kỳ nhiệt số chu kỳ nhiệt  Bước biến tính chu kỳ đầu tiên: Biến tính hồn tồn khn mẫu ADN bước vô quan trọng để mồi gắn phức hợp phản ứng làm nguội Nếu khn mẫu ADN khơng biến tính hồn tồn chuỗi bổ trợ có xu hướng bắt cặp trở lại nhanh, làm giảm hiệu gắn mồi kéo dài chuỗi, dẫn đến tượng tự mồi (selfpriming) gây dương tính giả Bước tăng nhiệt độ cho phản ứng lên 94 – 95°c vài phút đủ để làm biến tính hồn tồn ADN  Gắn mồi: Nhìn chung, nhiệt độ gắn xác định theo kinh nghiệm, lựa chọn nhiệt độ gắn yếu tố quan trọng thiết kế chu trình nhiệt cho PCR đạt độ đặc hiệu cao Nếu nhiệt độ q cao mồi khơng thể gắn, ngược lại, nhiệt độ thấp gây tượng gắn không đặc hiệu, gắn phần Hiện tượng tự mồi xảy đoạn mồi có một vài cặp base bổ trợ làm tượng bắt cặp xảy hai đầu 3’  Kéo dài chuỗi sau gắn mồi (tổng hợp chuỗi): Thông thường tượng kéo dài chuỗi xảy 72°c – nhiệt độ hoạt động tối ưu Taq ADN polymerase Với đa số sản phẩm 500 bp, khoảng thời gian kéo dài 20 giây đủ, cần 40 giây cho sản phẩm dài khoảng 1200bp (Taq ADN polymerase tổng hợp 60 base/giây nhiệt độ 72°C), nhiên, khoảng thời gian thực tế khác  Bước biến tính chu kỳ tiếp theo: Nhiệt độ thời gian biến tính chu kỳ thường 94 – 95°c 20 – 30 giây, nhiên, cần điều chỉnh thông số phù hợp với loại tube phản ứng máy PCR  Số chu kỳ khuếch đại: Vói lượng khn mẫu 10 sao, điều kiện tối ưu, sau chưa đến 40 chu kỳ khuếch đại cho lượng sản phẩm nhiều đến mức nhìn mắt thường điện di thạch agarose nhuộm muối ethidium bromide, số chu kỳ PCR thường từ 25 – 35, lên đến 40, cần thận trọng số chu kỳ q nhiều sản phẩm khơng đặc hiệu tích tụ lại  Bước kéo dài cuối (hoàn thiện): Phản ứng thường giữ 72°c khoảng 5-15 phút sau chu kỳ cuối để hồn thiện tồn q trình kéo dài chuỗi cho sản phẩm tổng hợp dở dang giúp chuỗi đơn bắt cặp vói Sau phản ứng hoàn thành, sản phẩm thường giữ – 10°c 1.2.4 Loại enzyme nồng độ enzyme Nồng độ tối ưu enzyme thường dao động từ 0,5 đến 2,5 đơn vị, cao độ đặc hiệu phản ứng giảm Sau số loại enzyme thường dùng PCR: 1.2.4.1 Taq ADN polymerase:  Đặc điểm chung: Taq ADN polymerase có nguồn gốc từ lồi vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus BM, có hoạt tính tổng hợp ADN chiều 5’ – 3’ khơng có hoạt tính exonudease (phá hủy acid nucleic loại bỏ nucleotide) chiều 3’ – 5’ Enzyme đạt hoạt độ tối đa nhiệt độ khoảng 75°c pH ® (20°C) Taq ADN polymerase nhận dUTP chất, sử dụng UNG để tránh nhiễm  Đặc điểm bật: Taq ADN polymerase nhận nucleotide biến đổi chất nên sử dụng enzyme trưòng hợp muốn đánh dấu đoạn ADN nucleotide gắn phóng xạ hay digoxigenin (dig), biotin, chất huỳnh quang Đây enzyme phù hợp cho kỹ thuật giải trình tự ADN  Tth ADN polymerase:  Đặc điểm chung: Tth ADN polymerase có nguồn gốc từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus HB8, có hoạt tính tổng hợp chiều 5’ – 3’ cao, khơng có hoạt tính exonuclease chiều ’ – ’ Enzyme đạt hoạt độ tối đa nhiệt độ khoảng 75°c pH ~ (20°C)  Đặc điểm bật: Tth ADN polymerase nhận nucleotide biến đổi chất, có hoạt tính phiên mã ngược hiệu quả, cao so với ADN polymerase I Taq polymerase, không liên quan tới hoạt tính RNase H, sau phiên mã cDNA tiếp tục khuếch đại enzyme nên dùng RT-PCR  Pwo ADN polymerase:  Đặc điểm chung: Pwo ADN polymerase có nguồn gốc từ lồi vi khuẩn siêu chịu nhiệt Pyrococcus woesei, có hoạt tính tổng hợp ADN chiều 5’ – 3’ hoạt tính exonuclease chiều 3’ – 5’ khơng có hoạt tính exonuclease chiều 5’ – 3’; enzyme không nhận dUTP chất không khuyến cáo sử dụng với UNG để tránh nhiễm  Đặc điểm bật: Do Pwo ADN polymerase có khả tổng hợp ADN xác Taq polymerase tới 10 lần Sản phẩm PCR tổng hợp Pwo ADN polymerase sử dụng trực tiếp cho phản ứng nối ghép Hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ Pwo ADN polymerase có tác dụng ADN chuỗi đơn (ví dụ mồi), khơng ảnh hưởng đến trình thực PCR, để tránh trình phân hủy mồi từ từ enzyme đoạn mồi cần tổng hợp dNTP trơ với nucleaseế Pwo ADN polymerase nhận dƯTP gắn dig, biotin, hay chất huỳnh quang chất, sở để xây dựng hệ thống phát sản phẩm PCR kỹ thuật ELISA  Nồng độ MgCL2 Nồng độ MgCL2 dao động từ 0,5 mM đến mM, ion ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Nồng độ Mg 2+ tự phụ thuộc vào nồng độ hợp chất gắn với ion nồng độ dNTP, pyrophosphate tự (PPi) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Một số trường hợp cá biệt, MgCL2 thay MnCL2 2.6 Nồng độ dNTP Nồng độ dNTP (4 loại nucleotide A, T, G, C) khơng cân làm giảm tính xác hoạt động Taq 1.2.7 Trình tự mồi Trong hầu hết trường hợp, trình tự nồng độ mồi hai yếu tố định đến thành cơng phản ứng Nhìn chung, trình tự mồi cần đảm bảo không chứa cấu trúc bậc hai, khu vực giàu G/C A/T phân bố đồng đều, khơng có trình tự bổ trợ hai đầu 3’ để tránh tượng tự mồi Khi thiết kế, thêm vào đầu 5’ mồi số base không gắn với khuôn mẫu, kỹ thuật tiện ích nghiên cứu muốn đưa vào sản phẩm khuếch đại khu vực giói hạn đặc hiệu cài vào sản phẩm khuếch đại trình tự kích thích hoạt hóa phiên mã kỹ thuật phiên mã in vitro trực tiếp từ sản phẩm PCR Nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng dao động khoảng 0,1 – 0,5 uM Nồng độ mồi cao gây tượng gắn mồi không đặc hiệu, nồng độ thấp làm giảm hiệu giá phản ứng thiếu mồi cho chu kỳ cuối 1.2.8 Chất phủ phản ứng Có thể phủ lớp dầu khoáng lên hỗn hợp PCR trước chạy máy để chống tượng bay Nếu dùng sáp paraffin thay dầu khống ngồi tác dụng chống bay hơi, chất tách rời thành phần PCR phức hợp phản ứng đạt nhiệt độ cao paraffin tồn dạng thể rắn nhiệt độ 55°c (còn gọi PCR hot start) nên hạn chế tượng gắn mồi khơng đặc hiệu giai đoạn biến tính chu kỳ khuếch đại Hiện nay, nhiều tác giả không dùng chất phủ giữ phức hợp phản ứng điều kiện lạnh 1.2.9 Khuôn mẫu Tỷ lệ (mồi): (khuôn mẫu) ảnh hưởng lớn đến độ đặc hiệu phản ứng xây dựng chủ yếu theo kinh nghiệm Nếu q khn mẫu mồi khơng tìm trình tự gắn đặc hiệu, q nhiều xảy tượng bắt cặp nhầm Độ tinh khuôn mẫu ảnh hưởng đến kết phản ứng  Các chiến lược phịng nhiễm PCR có khả khuếch đại từ phân tử thành lượng sản phẩm khổng lồ sau số chu kỳ định, nên nhiễm lượng vết ADN với khả khuếch đại tuyệt vời này, ADN nhiễm trở thành khuôn mẫu cho PCR kết sản phẩm đích khơng mong muốn khuếch đại (dương tính giả) Các nguồn gây nhiễm ADN khu vực bàn làm việc, trang thiết bị máy móc, loại pipette nhiễm ADN từ lần làm thử nghiệm trước, nhiễm sản phẩm lần khuếch đại trước hay nhiễm chéo ADN mẫu Để tránh nhiễm làm giảm tỷ lệ dương tính giả, cần tn thủ ngun tắc phịng thí nghiệm sau:  Trang thiết bị phịng thí nghiệm  phải tách biệt khu vực làm việc trước PCR, PCR, sau PCR, khu vực bố trí theo luồng chiều;  Nếu có thể, nên làm PCR hốt sinh học phân tử có trang bị đèn tím, máy ly tâm nhẹ (máy spin down) găng tay dùng lần đặc chủng cho sinh học phân tử Không nên sử dụng pipette cho sinh học phân tử chung với loại thử nghiệm khác, pipette cho chứng dương phải riêng biệt, dùng loại đầu côn lọc vô trùng  Xử lý mẫu kỹ thuật thao tác  Luôn tuân thủ kỹ thuật vô trùng, găng tay làm việc khu vực PCR tuyệt đối tránh tạo bọt khí;  Khi chuẩn bị sinh phẩm, hóa chất, ln sử dụng dụng cụ thủy tinh hay nhựa và/hoặc vô trùng, trước chưa sử dụng để tách chiết AND Sấy ướt sinh phẩm dung dịch không ảnh hưởng đến phản ứng, trừ mồi, dNTP, Taq Sinh phẩm dung dịch dùng cho PCR cần xẻ thành lượng nhỏ bảo quản riêng biệt, không dùng chung với loại kỹ thuật khác;  Mỗi phản ứng ln kèm chứng gồm chứng âm (có đầy đủ thành phần phản ứng mặt khn mẫu), chứng dương (lý tưởng nên có chứng dương tính vừa dương tính yếu để kiểm soát hiệu khuếch đại phản ứng) Khi cần xác định có mặt chất ức chế mẫu bệnh phẩm cho vào chứng dương tính yếu lượng dư mẫu bệnh phẩm dùng kỹ thuật đồng khuếch đại chứng dương cách thay khu vực sản phẩm PCR gốc trình tự biết thêm sản phẩm biến đổi vào tube bệnh phẩm cần xét nghiệm, sau dùng đầu dị đặc hiệu với trình tự biết để phát sản phẩm biến đổi mẫu bệnh phẩm khơng có mặt chất ức chế phản ứng có kết dương tính  Loại nhiễm UNG: Một số nguồn dễ gây nhiễm cho PCR sản phẩm PCR lần khuếch đại trước nên sử dụng enzyme Uracil ADN Glycosylase (UNG) để phá hủy sản phẩm chế enzyme hóa học khơng phá hủy ADN tự nhiên (khn mẫu hay đoạn mồi) UNG xúc tác q trình loại bỏ uracil khỏi ADN sợi đơn kép tổng hợp từ dUTP – loại nucleotide PCR Dưới tác dụng UNG, vị trí kiềm hình thành điều kiện nhiệt độ cao, pH kiềm, vị trí kiềm bị phân cắt 1.4 Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR cần ý thêm  Loại enzyme phiên mã ngược Enzyme phiên mã ngược ADN polymerase phụ thuộc ARN, xúc tác trình tổng họp từ ARN thành sợi đơn ADN bổ trợ sau tổng hợp chuỗi ADN Trên thị trường thường lưu hành loại enzyme có hoạt tính phiên mã ngược AMV, MMuLV, Tth Các loại enzyme có hoạt tính tối ưu độ pH, nồng độ muối, nhiệt độ ủ khác nên cần tối ưu hóa điều kiện phản ứng cho loại AMV M-MuLV có khả tổng hợp ADN bổ trợ dài tới lOkb, khả tổng hợp Tth – kb l.4.2 Một sô đặc điểm loại enzyme phiên mã ngược  Hoạt tính RNase H: Hoạt tính RNase H cho phép phá hủy đặc hiệu ARN phức hợp (ARN) – (ADN bổ trợ), tượng khơng có lợi cho PCR q trình phá hủy khn mẫu ARN cạnh tranh với trình tổng hợp ADN tạo sợi ADN bổ trợ Không giống với Tth, AMV M-MuLV có hoạt tính RNase H hoạt tính M-MuLV thấp AMV Hiện có số enzyme gây đột biến để giảm hoạt tính  Nhiệt độ hoạt động tối ưu: Nhiệt độ hoạt động tối ưu M-MuLV 37°c, AMV 42°c, Tth 60 – 70°c, ARN khn mẫu có chứa nhiều cấu trúc bậc khơng nên dùng M-MuLV  Nhu cầu ion hóa trị 2: Một số nhược điểm Tth enzyme cần ion kim loại hóa trị hai Mn2+ khơng phải Mg2+ mà Mn2+ có ảnh hưởng đến độ xác phản ứng  Khả khuếch đại: Ưu điểm Tth vừa có vai trị enzyme phiên mã ngược, vừa enzyme PCR nên sử dụng enzyme RT-PCR bước vừa làm giảm nguy nhiễm, vừa đơn giản bưóc thực Các loại PCR Khơng có thường quy chung để khuếch đại ADN hay ARN sinh phẩm thương mại hóa thường thuận tiện áp dụng với nhiều đoạn mồi nhiều phương pháp tách chiết acid nucleic, vậy, cần hiểu rõ tác nhân gien đích khuếch đạt điều kiện phản ứng tối ưu 2.1 PCR chỗ (In situ PCR) PCR chỗ kết hợp ưu điểm độ nhạy khả lai chỗ để định vị trình tự đích acid nucleic khuếch đại tế bào nên ứng dụng nghiên cứu bệnh học, nhiễm thể ẩn, tế bào học, huyết học, chẩn đoán nguyên gây biến đổi hình thái bên tổ chức tế bào v.v Phương pháp có hạn chê độ nhạy khơng cao kỹ thuật PCR khác nên khó phát bệnh phẩm có lượng khn mẫu trừ trường hợp cá biệt phát human papillomavi rỳt (HPV) độ nhạy phương pháp đạt  PCR in situ gián tiếp Nhỏ phức hợp PCR (đệm, mồi, dNTP, enzyme khuếch đại) lên tiêu tế bào lát cắt tổ chức mô cố định lam kính, phủ dầu khống chạy máy Sản phẩm PCR tế bào phát phương pháp lai chỗ cổ điển sử dụng đầu dị khơng đánh dấu phóng xạ Cũng lấy cẩn thận sản phẩm phản ứng chạy điện di thạch agarose làm kỹ thuật southern blot để xác định kích thước sản phẩm Q trình khuếch đại xảy bên ngồi tế bào có tượng dị gỉ  PCR in situ trực tiếp Trong phức hợp PCR, nồng độ loại dNTP bị giảm xuống thay loại dNTP khác gắn biotin hay dig, sau nhỏ phức họp lên tiêu tế bào lát cắt tổ chức mô cố định lam kính chạy PCR mơ tả Sản phẩm PCR tế bào phát đầu dò đánh dấu Một số nhược điểm kỹ thuật trực tiếp độ đặc hiệu thấp kể áp dụng PCR hot start 2.2 Các loại PCR khác 2.2.1 PCR làm tổ (PCR vòng/nested PCR) Đặc điểm phương pháp khoảng 15-30 chu kỳ khuếch đại vòng hai thực sở sản phẩm vòng cặp mồi có trình tự nằm phía sản phẩm vòng Lần khuếch đại thứ hai cho sản phẩm ADN ngắn vòng hiệu giá khuếch đại cao Phương pháp làm tăng độ nhạy phản ứng nhiều lần, mẫu bệnh phẩm có nhiều chất ức chế, ngồi cịn có tác dụng giúp khẳng định sản phẩm vịng Mồi có mặt phản ứng vịng gây nhiễm, làm giảm hiệu khuếch đại phản ứng vòng hai tạo nhiều dải ADN nên cần pha loãng 10 – 100 lần làm tinh sản phẩm vòng ly tâm qua lọc phân tử Centricon 30 trước khuếch đại vòng hai Cần cân nhắc định sử dụng kỹ thuật để chẩn đốn thường xun nguy nhiễm ADN gây dương tính giả kỹ thuật cao 2.2.2 PCR khơng đối xứng Có thể sử dụng kỹ thuật PCR không đối xứng để tạo sản phẩm ADN cho mục đích khác giải trình tự gien sản xuất đầu dò ADN Đây kỹ thuật PCR chuẩn thức nồng độ mồi không (không đối xứng) nên hiệu phản ứng thấp Trong chu kỳ đầu tiên, hầu hết sản phẩm tạo ADN chuỗi kép, mồi cạn kiệt mà chu kỳ khuếch đại thực phản ứng tổng hợp loạt chuỗi bổ trợ  PCR đa mồi (multiplex PCR) PCR đa mồi phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại lúc nhiều khu vực ADN đích, sử dụng kỹ thuật để định nhóm phân loại vi rỳt trình tự acid nucleic Nhiệt độ gắn mồi phải tương đồng (khác biệt 10°C) để đảm bảo tính cân đối q trình khuếch đại sản phẩm khác tránh tượng phát sản phẩm khuếch đại Tương tự vậy, kích thước sản phẩm đích phải tương sản phẩm ngắn khuếch đại tốt Hiện RT-PCR đa mồi áp dụng phổ biến nhiều phòng thí nghiệm, phục vụ cơng tác chẩn đốn nghiên cứu sàng lọc 2.2.4 Thối hóa mồi cho PCR Khi khơng biết khơng thể xác định xác trình tự đoạn ADN từ trình tự acid amin thực kỹ thuật thối hóa mồi để khả kết hợp mã di truyền ba xảy với trình tự acid amin biết cần tránh thối hóa từ đầu 3’ Có thể tạo thối hóa cách khuếch đại có mặt phức hợp mồi có mã ba sử dụng mồi có chứa deoxyinosine, chất tạo linh hoạt trình bắt cặp base  Đánh dấu mồi cho PCR Có thể gắn số trình tự chức chất đánh dấu vào đầu 5’ hai mồi để chèn vào sản phẩm PCR trình khuếch đại biotin hay dig, chất huỳnh quang, enzyme, vị trí enzyme giới hạn, trình tự hoạt hóa ARN polymerase v.v….để phục vụ cho bước tóm bắt, phát sản phẩm PCR, mục đích khác Hình 2: Sơ đồ chung cho PCR RT-PCR 2.3 Real-time PCR Trong sinh học phân tử, real-time PCR, hay gọi PCR định lượng trực tiếp, hay gọi PCR động học, dạng biến đổi PCR chuẩn thức để khuếch đại kèm gam chuẩn đồng thời định lượng trình tự đích đặc hiệu chúng tích tụ lại thời điểm định sau chu kỳ phản ứng Hệ thống “real-time” tuân thủ thường quy chung PCR cho đường cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm giai đoạn: kéo dài đến dấu hiệu sản phẩm PCR lớn dấu hiệu hệ thống; tăng gia tốc kéo dài tạo hình phẳng Do vậy, tranh hồn thiện q trình PCR thể rõ sản phẩm cuối phản ứng sau số chu kỳ định Với real-time PCR, kết phân tích lúc phản ứng chạy nên khơng bị nhiễm sản phẩm từ vào, kết thu nhanh lại kiểm soát tốt hơn, tự động hồn tồn Thơng thường, real-time PCR kết hợp với RT-PCR để định lượng lượng nhỏ ARN thông tin Ký hiệu real-time PCR rt PCR Định lượng trực tiếp khơng có vai trị chẩn đốn mà cịn có vai trị tiên lượng bệnh, định điều trị, tái điều trị, trì điều trị thuốc kháng vi rút đặc hiệu  RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang Phương pháp phổ biến sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường SYBR Green, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất chuỗi ADN kép phát huỳnh quang, sau chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng Nhược điểm chất huỳnh quang gắn vào sản phẩm tự mồi gây nên tượng nhiễu, làm giảm độ xác phân tích định lượng kết trình tự đích cần khuếch đại Phản ứng thực máy chu kỳ nhiệt bình thường, trừ việc thêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm phát quang gắn với chuỗi ADN kép, đầu dò đo mức huỳnh quang sau chu kỳ Nếu kèm gam chuẩn ngồi phản ứng định lượng  RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang phương pháp xác đáng tin cậy nhất, đắt Nguyên lý phương pháp đầu dò chuyển lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát (hiện tượng FRET) Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực hai đoạn mồi để định lượng ADN chứa trình tự đầu dị, làm tăng đáng kể độ đặc hiệu, chí cho phép định lượng có mặt số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Khả cho phép làm thử nghiệm đa mồi sử dụng đầu dò đặc hiệu đánh dấu mầu khác Hình 3: Sơ đồ real-time PCR TaqMan Thơng thường, đầu dị mang huỳnh quang đầu (Reporter – 5’) chất chặn đầu (Quencher – 3’), vị trí gần chất mang chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền lượng tới chất chặn gần không phát quang Khi taq polymerase hoạt động, enzyme có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease nên đầu dị bị đánh bật khỏi khn mẫu, lúc này, trạng thái gần chất mang chất chặn bị phá vỡ nên tượng FRET không xảy nữa, chất huỳnh quang khơng cịn bị chặn, trạng thái tự nên phát quang tín hiệu phát quang máy đo lạiỀ Sản phẩm đích tăng lên sau chu kỳ phản ứng lượng chất huỳnh quang tự giải phóng tích tụ lại ngày nhiều PCR tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dị có đánh dấu huỳnh quang; Khi phản ứng bắt đầu, giai đoạn gắn mồi PCR, mồi đầu dò gắn đặc hiệu vào ADN đích; Q trình tổng hợp chuỗi thực từ vị trí mồi, taq polymerase chạm vào đầu dị hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease enzyme phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn làm tăng lượng chất huỳnh quang dạng tự Chất huỳnh quang đo máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ sản phẩm sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) phản ứng 2.3.3 Đầu dò phân tử Beacon Phương pháp có ngun lý đầu dị lai chuyển lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát Các phân tử beacon chứa chất mang huỳnh quang chất chặn, thiết kế cấu trúc hình kẹp tóc phân tử dạng tự dung dịch, nên chất mang huỳnh quang chất chặn trạng thái gần Khi phân tử beacon lai với trình tự đích, thuốc nhuộm huỳnh quang chất chặn bị tách rời nhau, tượng FRET không xảy thuốc nhuộn huỳnh quang phát quang tác dụng ánh sáng Khơng giống phương pháp đầu dị đánh dấu hai đầu, phương pháp thiết kế để trì tình trạng nguyên vẹn trình khuếch đại 2.3.4 Sản phẩm khuếch đại tự phát quang Hiện nay, có nhiều phương pháp sử dụng chất huỳnh quang gắn vào mồi chất huỳnh quang phát quang chúng gắn vào sản phẩm đích Một số loại mồi scorpion, mồi sunrise mồi lux Các hệ thống cho có hiệu giống hệ thống real-time sử dụng đầu dò rẻ ứng dụng PCR RT-PCR Sinh phẩm phục vụ PCR đắt, nước phát triển, số sinh phẩm, hóa chất khơng ổn định cho dù sản phẩm thương mại hóa Các thử nghiệm sinh học phân tử khó thực hiện, đơi cồng kềnh, tạo áp lực cơng việc, khó áp dụng kỹ thuật chẩn đốn thơng thường cho tuyến y tế Ngoài ra, nhân viên phải có kỹ tốt hóa học sinh học phân tử thực thử nghiệm Tuy nhiên, PCR sử dụng rộng rãi nhờ tính đơn giản linh động, áp dụng trực tiếp để chẩn đốn genome tác nhân gây bệnh có trình tự thơng tin trình tự ln sẵn có ngân hàng gien Với đời sinh phẩm, thường quy tự động hóa nhiều khơng cịn sử dụng chất đánh dấu phóng xạ nên PCR RT-PCR ứng dụng chẩn đoán ngày nhiều phù hợp với xu phát triển chung Cụ thể, PCR/RT-PCR có khả khuếch đại in vitro nhạy nhiều so với nuôi cấy tế bào lựa chọn tối ưu cho vi rút nhân lên hệ thống nuôi cấy tế bào chậm, cho dạng nhiễm chậm; Các nucleotide bắt cặp đặc hiệu nên phát khác biệt trình tự di truyền nhờ cung cấp thơng tin tính đặc hiệu chủng, vừa có tác dụng chẩn đốn sớm, vừa có tác dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử; RT-PCR ứng dụng để chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm trùng bệnh di truyền có vật liệu di truyền ARN hay có bước phiên mã ngược chu kỳ nhân lên từ ADN thành ARN, chí phát ARN thông tin tác nhân ADN, phát biểu gien, khuếch đại ARN trước tiến hành tạo dòng (cloning) v.v… Như vậy, khái niệm khuếch đại acid deoxyribonucleic (ADN) PCR đơn giản ứng dụng thật to lớn chưa khai thác hết Chúng ta khó hình dung sống mà khơng có PCR./ TÀI LIỆU THAM KHẢO Centres for Disease Control and Prevention (1995) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections American Public Health Association 7th Edn 97-120 Chomczynski p., Sacchi N (2006) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on Nature Prot (1) 581—585 Higuchi R., Dollinger G., Walsh, P.S., Griffith R (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences Biotechnology (10) 413— 417 Higuchi R., Fockler c., Dollinger G., Watson R (1993) Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions Biotechnology (11) 1026—1030 Innis M.A., Gelfand D.H (1990) PCR protocols: A guide to methods and applications Academic Press, San Diego Kwok S., Higuchi R (1989) Avoiding false positives with PCR Nature (339) 237238 Mackay I.M (2007) Real-Time PCR in Microbiology Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-18-9 8′ẵ McOrist A.L., Jackson M., Bird A.R (2002) A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples J Microbiol Methods (50) 131139 (2007) MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I — Large Volume, www.roche-apylied-science.com 1-24 10 Smith K., Diggle M.A., Clarke s.c (2003) Comparison of commercial DNA extraction kits for extraction of bacterial genomic DNA from whole-blood samples J Clin Microbiol (41) 2440-2443ễ 11 Tang Y.W., Sefers S.E., Li HỂ et al (2005)ệ Comparative evaluation of three commercial systems for nucleic acid extraction from urine specimens J Clin Microbiol (43) 4830-4833 Trochimchuk T., Fotheringham J., Topp E et al (2003) A comparison of DNA extraction and purification methods to detect Escherichia coli 0157:H7 in cattle manure J Microbiol Methods (54) Nguồn: Xét nghiệm chẩn đoán Vi rút – Bộ Y Tế – Nhà xuất y học trang 47-61 ... THAM KHẢO Centres for Disease Control and Prevention (19 95) Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections American Public Health Association 7th Edn 97 -12 0 Chomczynski... www.roche-apylied-science.com 1- 24 10 Smith K. , Diggle M.A., Clarke s .c (2003) Comparison of commercial DNA extraction kits for extraction of bacterial genomic DNA from whole-blood samples J Clin... Griffith R (19 92) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences Biotechnology (10 ) 413 — 4 17 Higuchi R., Fockler c. , Dollinger G., Watson R (19 93) Kinetic PCR: Real time monitoring