BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN ENZYME Nghiên cứu quy trình thu nhận, định lượng và xác định hoạt tính enzyme ARTOCAPINE từ mủ mít Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (CO~NH) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa,..) và động vật (gan, dạ dày bê,..).
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN – ENZYME NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME ARTOCAPINE TỪ MỦ MÍT [Document subtitle] MỞ ĐẦU Ngày với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme đượac sản xuất nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Hằng năm luợng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với 500 triệu USD, phân phối lĩnh vực khác Phần lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: chế biến thưc phẩm (đông tụ sữa làm cho phomát, làm mềm thịt, bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…) Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease cịn cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất, nên hướng nghiên cứu thu nhận enzyme từ nguồn gốc thực vật hứa hẹn mở phương pháp tận dụng nguồn enzyme tự nhiên Các chế phẩm thu sau q trình ni cấy sản xuất enzyme chưa phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 20-30% Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách tinh chế enzyme nhằm thu chế phẩm có độ tinh khiết cao cần thiết I TỔNG QUAN Enzyme protease - Protease (còn gọi proteinase hay peptidase) nhóm enzym thủy phân có khả cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) phân tử polypeptide, protein số chất khác tương tự thành amino acid tự - peptide phân tử thấp Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa, ) động vật (gan, dày bê, ) 1.1 Phân loại enzym protease: 1.1.1 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme: - Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin… - Protease thực vật: papain, bromelin, ficin… - Protease vi sinh vật: subtilisin,… 1.1.2 Dựa vào phân bố enzyme - Protease nội bào (endoprotease): enzyme hoạt động chủ yếu bên tế bào - như: catepsin,… Protease ngoại bào (exoprotease): enzyme hoạt động mô,các quan đặc hiệu tế bào pepsin, chymotrypsin,… 1.1.3 Dựa vào vị trí tác dụng protease lên liên kết peptide phân tử protein: - Endopeptidase (proteinase): phân giải liên kết peptide nằm phân tử protein tạo thành đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide - mạch ngắn, pepton…) Exopeptidase (polypeptidase): phân cắt liên kết peptide hai đầu mạch 1.1.4 Dựa vào nhóm chức trung tâm hoạt động: - Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH) như: tripsin, subtilopeptidase Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-SH) papain, bromelin,… Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-COOH) pepsin, renin,… Protease kim loại:trung tâm hoạt động có nguyên tố kim loại: cacboxypeptidase A,… 1.1.5 Dựa vào thành phần amino acid vùng pH tối ưu protease: I.2 Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động vùng acid Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động vùng pH kiềm Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động vùng pH trung tính Ứng dụng protease Protease có nhiều ứng dụng phục vụ đời sống người: - Chất tẩy rửa: Protease thành phần thiếu tất loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng gia đình đến chất làm kính giả kem đánh Việc ứng dụng enzyme vào chất tẩy rửa nhiều bột giặt Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu chất rộng để dễ dàng loại bỏ vết bẩn thức ăn, - máu chất thể người tiết Công nghiệp thuộc da: Quá trình chế biến da bao gồm số công đoạn ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da thuộc da Thông thường phương pháp thuộc da thường dùng hóa chất độc hại natri sunfit, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường nước thải nhà máy thải sơng Việc sử dụng enzyme để thay hóa chất thành công việc nâng cao chất lượng da làm giảm ô nhiễm môi trường Protein thành phần da lông nên protease sử dụng để thủy phân số thành phần phi collagen da loại bỏ protein phi fibrin albumin, globulin trình thuộc da có hiệu Ngồi ra, protease cịn ứng dụng ngành công nghiệp khác như: - Trong nghệ thực phẩm: • Chế biến thịt: làm mềm tăng hương vị thịt • Cơng nghiệp sữa: làm đơng tụ sữa để sản xuất phomat • Sản xuất bánh mì: giảm thời gian đảo trộn, làm nhuyễn bột, tăng độ dẻo, tạo độ xốp • Sản xuất bia: tăng độ bền bia giảm thời gian lọc • Sản xuất nước mắm: tăng hiệu suất thu hồi đạm - Trong y học: men tiêu hoá, điều chế môi trường sản xuất vaccine… - Trong sản xuất keo động vật, thức ăn gia súc, dệt may, mỹ phẩm, điều chế dịch đạm thuỷ phân làm chất dinh dưỡng, chất tăng hương vị, thực phẩm cho người ăn kiêng… 1.3 Nguồn thu nhận protease Hiện nay, protease thu nhận từ nguồn: Động vật: niêm mạc dày bê, ruột non, tuyến tuỵ cá basa,… Vi sinh vật: nấm men Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus oryzae, xạ khuẩn,… Thực vật: dứa, mủ đu đủ, mủ sung, mủ mít… Cây mít 2.1 Giới thiệu mít Cây mít có tên khoa học Artocarpus heterphyllus, thuộc họ Dâu tằm - Moraceae, cho có nguồn gốc từ dãy núi Ghats phía nam Ấn Độ từ lan khắp Ấn Độ, Philippine Đây loại trồng phổ biến nước Đông Nam Á (Việt Nam, Thái Lan, Indonesia…), Bangladesh, Sri Lanka, Brazil… Mít thuộc loại gỗ, thường xanh quanh năm, cao từ đến 15m, đường kính gốc đạt đến 1.5m sống đến 100 năm Lá mít mọc cách, hình trứng, đầu phình to nhọn, cạnh đáy thon, cịn non có thùy, dày, cứng, mặt màu xanh thẫm, nhẵn, khơng có lơng, mặt thô, màu xanh nhạt Mặt rộng từ 1-12cm, dài 8-15cm Rễ cọc mít phát triển từ nhỏ, đánh trồng dễ làm chết non Ở già rễ phát triển mạnh có lên mặt dất bám chống gió bão tốt Mít xem loại ăn trái có chín lớn số lồi thảo mộc Quả sinh thân chân cành lớn, già có khuynh hướng mọc thấp chí mọc rễ ăn mặt đất Quả mít hình bầu dục hay hình trịn, to kích thước khoảng (30-60) cm x (20-30) cm, trọng lượng 4.5-27.3kg; số giống nhỏ nặng từ 1.4-4.5kg ; vỏ dày ghồ ghề có nhiều gai nhọn Khi chưa chín vỏ có màu xanh, bắt đầu chín vỏ chuyển từ màu lục sang màu nâu Bên có nhiều múi ăn được, ngọt, thơm, giịn Qủa mít có thảnh phần cấu tạo gồm: vỏ, xơ, múi, hạt, cùi (lõi) Mít trồng nước ta bao gồm nhiều loại với chất lượng khác nhau, có đặc điểm sinh thái chung gần giống như: • Thích nghi dễ dàng vùng khí hậu ấm áp, khơng sống nơi có nhiệt độ thấp Có khả chịu khơ hạn trường hợp sinh trưởng kém, hoa kết trái • Có thể sống nhiều vùng đất đai khác • Ở nơi đất tốt mít sinh trưởng phát triển nhanh, bảo tồn đặc tính tốt mẹ • Mít phát triển nhanh năm đầu (từ 1-3 tuổi), năm sau chậm lớn chiều cao, to nhanh đường kính, mít có khả tái sinh chồi mạnh cịn 5-6 tuổi • Mít hoa kết từ 3-5 tuổi, chậm tuổi Mít hoa từ tháng 1-2, chín từ tháng 6-8 2.2 Nguyên nhân chọn đối tượng mủ mít để thu nhận enzyme protease Cây mít loại nhiệt đới trồng nhiều Việt Nam để lấy đặc tính sinh trưởng nhanh, dễ thích nghi, tiến hành thu hoạch quả, mủ mít xem nguồn phế phẩm, khơng khơng có cơng dụng, gây nhiễm mơi trường mà cịn gây khó chịu cho người bị dính phải khó rửa nước xà phịng thơng thường mà phải dùng dung môi hữu xăng, dầu hoả Protease có mủ mít thay renin – loại enzyme sử dụng ngành công nghiệp chế biến sữa Lượng renin sản xuất chưa đáp ứng nhu cầu thực tế, xu hướng sử dụng protease thực vât (mủ mít, hạt mít…) ngày phát triển Công nghệ chế biến sản phẩm từ sữa không sử dụng chế phẩm enzym Có thể nói, chế phẩm enzym đóng vai trị định để tạo sản phẩm sữa Thông thường để chế biến sản phẩm từ sữa người ta sử dụng enzym renin thu nhận từ dày bê Trong 10 năm trở lại xu hướng sử dụng enzym protease thực vật ngày phát triển papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ trái dứa ficin từ sung nghiên cứu nhiều giới Nhưng enzym protease từ mủ mít có cơng trình nghiên cứu Ai Cập Nơi mà có thử nghiệm tìm thấy vài ứng dụng enzym protease lĩnh vực sản xuất bơ, phô-mai… Protease từ mủ mít - Protease thu nhận từ mủ mít thường gọi Artocarpin hay AMP48 Artocarpin có kích thước 48 kDa, hoạt động tốt dung dịch thiol reducing regents, pH 8, pI 6.3, bị ức chế phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF) - Bảo quản tối ưu đệm Tris – STT – EDTA [2] II HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ - THIẾT BỊ Hoá chất NaH2PO4, NaH2PO4.12H2O, Ethanol 900, CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6.4H2O, NaOH, Albumin 1%, Tyrosine, Folin, Casein 1%, TCA 5%, Nước cất, Na2CO3 Dụng cụ Ống nghiệm, becher, giấy lọc, phễu lọc, pipet, bóp cao su, giá ống nghiệm, bình định mức, ống đong, đũa khuấy Thiết bị Máy ly tâm, máy đo pH, máy quang phổ III QUY TRÌNH THU NHẬN Sơ đồ quy trình E1 E2 E3 E5 Hình III.1: Sơ đồ quy trình tinh protease Ghi chú: E1 Enzyme thơ sau hồ tan với đệm E2 Dịch enzyme sau lọc E3 Dịch lỏng sau ly tâm E4 Dịch enzmye sau hoà tan tủa cồn với đệm E5 Enzyme qua tinh Thuyết minh quy trình 2.1 Thu nhận mủ mít Tiến hành lấy mủ: lau cuống trái, dao becher đựng mủ tẩm cồn Becher để thùng đá, dùng dao inox cắt đứt phần cuống trái, dùng becher hứng phần mủ chảy xuống, hết mủ tiếp tục cắt cách vết cắt trước khoảng 1-2cm, làm vết cắt tiếp xúc với ruột trái mít Mủ thu nhận bảo quản lạnh để dùng liền giữ lạnh tủ đông không sử dụng 2.2 Hòa tan Đối với mủ tươi: cân khối lượng mủ hoà tan đệm phosphat 0.05M pH 7.5 làm lạnh theo tỉ lệ: 1g mủ: 10ml đệm Khuấy đũa khuấy 15 phút thực đá lạnh (2oC) 2.3 Lọc Dùng giấy lọc thô để tách riêng phần không tan, thu dịch giấy lọc Thực trình lọc tủ lạnh (2oC) 2.4 Tủa cồn Enzyme dễ biến tính với dung môi hữu nên trước tủa cần làm lạnh dung dịch enzyme, cồn nhiệt độ 40C Rót cồn chảy theo thành cốc để tránh biến tính enzyme theo tỷ lệ dịch lọc : cồn tuyệt đối = 1: Để lạnh xuất tủa 2.5 Ly tâm Khi tủa hình thành tiến hành ly tâm tủa với tốc độ 4000 vòng/phút 10 phút, thu tủa, để bay tự nhiên tủ lạnh Trong trình ly tâm nhiệt độ tăng theo thời gian nên cần làm lạnh dịch kỹ trước ly tâm 10 E1 E2 E3 E4 E5 Bước 1: Tiến hành thu 5g mủ mít tươi Bước 2: Hịa tan đệm với mủ mít theo tỉ lệ 5:1 ttạo thành dịch có màu trắng Bước 3: Lọc qua vải lọc loại bỏ cặn không tan Bước 4: Tủa cồn ethanol 75% tỉ lệ 1:1 Bước 5: Ly tâm 4000 vịng/phút loại bỏ dịch lỏng, thu lấy phần khơng tan 17 Bước 6: Dùng đệm hịa tan phần khơng tan sau ly tâm theo tỉ lệ 1:1 Bước 7: Điện di kiểm tra hàm lượng enzyme sau tủa cồn Bước 8: Sau thu enzyme thô, tiến hành lọc gel để tinh thu enzyme tinh khiết Bước 9: Thu emzyme tinh sau lọc gel Ghi chú: 4.1 E1 Enzyme thơ sau hồ tan với đệm E2 Dịch enzyme sau lọc E3 Dịch lỏng sau ly tâm E4 Dịch enzmye sau hoà tan tủa cồn với đệm E5 Enzyme qua tinh Kết lọc gel: Khảo sát hàm lượng hoạt tính protease E5 Hình IV.3: Số đo OD280 peak lọc gel Do trình lọc xuất lớp màu trắng đục phía bề mặt gel nên nhóm thu ống peak chứa mẫu phân đoạn lọc gel Ngun nhân đệm khơng hồ tan hồn tồn mủ mít nên cịn cặn lơ lửng bám bề mặt gel làm cản trở trình lọc nên lượng dịch lọc thu được mẫu (9ml), khảo sát theo lý thuyết (5 mẫu) 18 Từ hình ảnh peak thu [2], ta nhận thấy OD phân đoạn sau lọc gel - ban đầu tăng mạnh sau có xu hướng giảm dần với hoạt tính enzyme phù hợp với kết tiến hành thí nghiệm nhóm số lượng peak đo thấp nhiều so với đối chứng Hình IV.4: Kết đo OD280 sau lọc gel tài liệu đối chứng 4.2 Kết hàm lượng hoạt tính enzyme giai đoạn Mẫu HÀM LƯỢNG HOẠT TÍNH OD550 mg/ml OD660 UI/g E2 0.753 15.5 0.096 0.020 E3 0.065 1.37 0.023 0.005 E4 0.502 10.34 0.088 0.019 E5 0.028 0.61 0.006 0.001 Bảng IV.2: Kết khảo sát hàm lượng hoạt tính protease với tỉ lệ cồn tối ưu Hình IV.5: Biểu đồ thể thay đổi hàm lượng protease trình tinh Hình IV.6: Biểu đồ thể thay đổi hoạt tính protease q trình tinh Hàm lượng hoạt tính có thay đổi đáng kể theo xu hướng giảm dần Các số liệu thu từ hàm lượng hoạt tính protease có xu hướng giảm dần q trình tinh Ngun nhân do: • Q trình lọc, enzmye bám lại giấy lọc 19 • • Tủa khơng hồn tồn dẫn đến hao hụt Giai đoạn lọc gel, lượng enzyme bám lại gel Kết cho thấy hàm lượng hoạt tính enzyme thu nhận thấp, do: o Dung dịch đệm chưa phù hợp, khơng hồ tan hết lượng mủ mít ban đầu dẫn đến hàm lượng enzyme bị hao hụt o Dung môi sử dụng chưa tủa hoàn toàn protein o Trong thời gian bảo quản mẫu, ánh sáng làm phân huỷ protein Bên cạnh đó, hàm lượng hoạt tính giảm dần qua giai đoạn Đối chiếu [1], suất protein thu sau công đoạn chiết khoảng 1,446 %, hàm lượng hoạt tính enzyme giảm dần qua công đoạn thu nhận tinh Cụ thể: mẫu ban đầu chứa 429.114 mg sau cơng đoạn hồ tan với đệm natri acetate, hàm lượng 157.5 mg; cịn lại 66.7mg sau chạy sắc kí lần 6.204mg sau hồn tất quy trình Hàm lượng enzyme thu sau tủa cồn thấp so với phương pháp tủa sunfat amon (NH4)2SO4 50% [4] nên chọn muối để tiến hành thí nghiệm lại có điều kiện để tối ưu hố quy trình thu nhận 4.3 Kết điện di 20 Hình IV.5: Kết điện di nhóm (trái) tài liệu tham khảo (phải) Kết điện di thấy thang chuẩn với vạch mờ Không quan sát thấy vạch mẫu enzyme cần điện di Nguyên nhân lượng mẫu dùng làm thí nghiệm q (5g) nên hàm lượng protease khơng đủ để vạch gel quy trình thu nhận chưa tối ưu, dẫn đến hàm lượng enzyme bị thất dần q trình thí nghiệm Vì protese cần thu nhận có kích thước 48 kDa nằm thang sử dụng (4.1 - 66kDa) nên loại khả không lên vạch sử dụng sai thang chuẩn, enzyme chạy phía ngồi thang chuẩn So sánh với quy trình [1] tiến hành thu mủ tươi ly tâm loại bỏ nhựa trắng nhiệt độ phòng thẩm tích dịch qua đêm với đệm natri acetate pH 4.5 ly tâm loại bỏ protein tổng hợp lọc dịch sắc kí cột tinh lại sắc kí cột thu phân đoạn protein OD 280nm Quy trình thu kết điện di theo lý thuyết Artocarpin với kích thước 48 kDa V PHỤ LỤC Cách pha dung dịch sử dụng thí nghiệm Cách pha dung dịch TCA 5% - Lấy becher rửa sạch, lau khô - Cân 5g TCA - Hòa tan từ từ với 50ml nước cất (cho TCA vào khuấy, tan từ từ) - Định mức lên 100ml Cách pha dung dịch Albumin 1% - Lấy becher rửa sạch, lau khơ - Cân 1g albumin - Hịa tan từ từ với 50ml nước cất (cho albumin vào khuấy, tan từ từ) - Định mức đến 100ml 21 Cách pha dung dịch đệm Sorensen pH=7.6 - Cân 11,938g Na2HPO4, định mức đến 500ml - Cân 0,907g KH2PO4, định mức đến 100ml - Cho 500ml dung dịch Na2HPO4 vào becher, mang đo pH - Đổ từ từ dung dịch KH2PO4 vào đến đạt pH=7.6 Cách pha dung dịch Casein 1% - Lấy becher rửa sạch, lau khô - Cân 1g casein - Đun dung dịch đệm Sorensen đến khoảng 50OC - Hòa tan từ từ với 50ml đệm (cho casein vào, khuấy tan từ từ) - Định mức đến 100ml Cách pha dung dịch NaOH 0.5N - Lấy becher rửa sạch, lau khô - Cân 50g NaOH - Hòa tan từ từ với 800ml nước cất (cho NaOH vào, khuấy tan từ từ) - Định mức đến 1000ml Cách pha dung dịch đệm Phosphate pH=7.5 22 - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g NaH 2PO4 hòa tan định - mức đến 1000 ml (dung dịch a) Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M: 53,05 g Na 2HPO4.7H2O 71,7g - Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức đến 1000 ml (dung dịch b) Dung dịch đệm phosphate có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) - Trong thí nghiệm cần dung dịch đệm với pH 7.5 nên cần pha theo tỷ lệ a:b = 16 ml : 84 ml định mức lên 200 ml Cách pha dung dịch Biuret - Dung dịch A: 3g CuSO4 + 12g Kali Natri Tartrate, cho từ từ vào 500ml nước - cất, định mức đến 1000ml Dung dịch B (NaOH 2.5N): Cân 60g NaOH, cho từ từ vào 600ml nước cất Hòa tan dung dịch B vào dung dịch A, khuấy Chứa dung dịch chai tối màu Các phương pháp sử dụng thí nghiệm 2.1 Sắc kí lọc gel Nguyên tắc phương pháp sắc kí lọc gel Phương pháp sắc ký lọc gel dựa vào kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose hay polyacrylamide Những phân tử có kích thước nhỏ lọt vào bên lỗ gel bị trì hỗn, di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên di chuyển nhanh tách khỏi cột sớm phân tử nhỏ 23 Hình V.1: Thao tác thực lọc gel Gel Bio-Gel Medium P-100 Particle Size Typical Hydrate Range, Bed Volume, Hydrated ml/g of Dry Gel Beads (µM) Gel, Bio-Gel P-100 Gel, Fine 90-180 45-90 12 Typical Flow Rates (cm/hr)* Typical Fractionation Range/Normal Exclusion Limit (Daltons)** 4,0-6 5,000-100,000 3,0-5 5,000-100,000 Bảng V.1: Đặc tính gel P-100 sử dụng điện di Hình V.2: Sơ đồ quy trình lọc gel 2.2 Điện di Nguyên tắc: 24 Dựa vào di chuyển phân tử có mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngồi, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do hỗn hợp loại protein tách thành số vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt 2.3 Định lượng protein theo phương pháp Biuret 2.3.1 Mục đích Phương pháp Biuret dùng để xác định hàm lượng enzyme (bản chất protein) có dịch enyme thu nhận từ mủ mít 2.3.2 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng màu đặc trưng liên kết peptide phân tử protein với thuốc thử Biuret: màu đậm hàm lượng protein mẫu nhiều, mật độ quang OD cao Từ phương trình đường chuẩn dung dịch protein chuẩn suy hàm lượng enzyme có mẫu Phương pháp tiến hành Dựng đường chuẩn với protein tinh khiết - Albumin 2.3.3 - Ống nghiệm Albumin 1% (ml) 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 Nước cất (ml) 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 Biuret (ml) ml lắc đều, để yên 20 phút Đo mật độ quang OD bước sóng 550 nm - Bảng V.2: Phương pháp dựng đường chuẩn Albumin Từ giá trị OD đo được, dựng đường chuẩn dung dịch Albumin Đo giá trị OD mẫu enzyme protease, nằm đường chuẩn dựa vào phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng protein có mẫu Nếu giá trị OD mẫu đo nằm ngồi đường chuẩn phải pha lỗng mẫu 25 (nếu OD nằm phía đường chuẩn) dựng lại đường chuẩn với nồng độ thấp (nếu OD nằm đường chuẩn) 2.4 Xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 2.4.1 Mục đích Phương pháp Anson cải tiến nhằm xác định hoạt tính enzyme protease (thuỷ phân chất protein) thu từ mủ mít 2.4.2 Nguyên tắc Phương pháp dựa thuỷ phân chất protein (casein) enzyme protease Sau vơ hoạt enzyme kết tủa protein chưa bị thuỷ phân dung dịch acid tricloacetic (TCA) Định lượng sản phẩm tạo thành (amino acid) phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị đường chuẩn Tyrosine để tính lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên Phương pháp tiến hành o Lập phương trình đường chuẩn Tyrosine 2.4.3 Ống nghiệm Tyrosine (ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Na2CO3 0.5M 5 5 5 Folin 1:3 (ml) 1 1 1 Nước cất (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Do mật độ quang OD bước sóng 660nm Bảng V.3: Phương pháp dựng đường chuẩn Tyrosine • Từ giá trị quang OD đo tiến hành dựng đường chuẩn Tyrosine o Xác định hoạt tính enzyme protease Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật Thử không Casein 1% 5 TCA 5% (ml) 10 26 Enzyme (ml) 1 Lắc giữ nhiệt độ phòng 20 phút TCA 5% (ml) 10 Để lắng sau 20 phút lọc lấy dịch Dịch lọc (ml) 5 NaOH 0.5M (ml) 10 10 Folin (ml) 3 Chờ 10 phút, sau đo OD bước sóng 660nm • Bảng V.4: Phương pháp xác định hoạt tính protease Từ giá trị ΔOD mẫu enzyme thay vào phương trình đường chuẩn suy số mol enzyme từ tính hoạt độ enzyme theo cơng thức: • Trong đó: o H: hoạt độ enzyme protease (UI/g) o V: tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật (ml) o v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) o t: thời gian thuỷ phân (phút) o m: lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g ml) o L: độ pha lỗng mẫu enzyme o mol Tyrosine: mol Tyrosine suy từ đường chuẩn Phụ lục hình ảnh 1:1 1:2 1:3 Hình V.2: Dịch lọc sau ly tâm tủa cồn với tỉ lệ khác 27 a b Hình V.3: Dịch lọc sau ly tâm: a) tủa cồn tỉ lệ 1:1 pha đệm phosphate theo tỉ lệ 1:1 b) Phần dịch sau ly tâm Hình V.4: Hiện tượng tủa khơng tan hịa tan mủ mít với đệm KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT - Qua q trình thí nghiệm, nhóm thu kết sau o Thấy hàm lượng hoạt tính thu từ nhựa mít có khả ứng dụng VI thực tiễn o Biết cách pha hóa chất, sử dụng trang thiết bị phịng thí nghiệm o Hiểu cách thức lọc gel điện di protease o Đánh giá quy trình tối ưu cho việc thu nhận protease từ mủ mít 28 - Tuy nhiên q trình thực hiện, nhóm nhận thấy hệ đệm phosphate pH 7.5 tủa cồn chưa thực tối ưu cho việc hịa tan mủ mít tủa protein dẫn đến hao hụt lớn trình thu nhận enzyme Đồng thời, mủ mít cần phải có phương pháp tối ưu để bảo quản lúc thu hoạch sau thu hoạch (xảy tượng oxy hóa làm mủ thành màu nâu khó tan) Có thể tham khảo với hệ đệm Tris - STT- EDTA pH tủa protein muối sunfat amon - Trong trình giải thích biện luận kết thu được, nhóm tìm số quy trình tiến hành thực nghiệm thu enzyme mong muốn với kích thước 48kDa [1]: thu mủ tươi sau ly tâm loại bỏ nhựa trắng nhiệt độ phịng thẩm tích dịch qua đêm với đệm natri acetate pH 4.5 ly tâm loại bỏ protein tổng hợp lọc dịch sắc kí cột tinh lại sắc kí cột tốc độ nhanh thu phân đoạn protein OD 280nm - Nhóm thấy hạn chế q trình tiến hành thí nghiệm chưa tìm hiểu thêm nhiều báo, tài liệu tương tự để tiến hành khảo sát nhiều quy trình khác để lựa chọn quy trình tối ưu thu nhận Artocarpin với hàm lượng hoạt tính cao TÀI LIỆU THAM KHẢO J Siritapetawee, S Thammasirirak, W Samosornsuk, Antimicrobial activity of a 48-kDa protease (AMP48) from Artocarpus heterophyllus latex, 2012; 16: 132-137 K.M Renuka Prasad and Tumkur K Virupaksha, Purification and characterization of protease from jackfruit latex, Phytochemistry, Vol29, No 6, pp 1763-1766, 1990 Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc Nguyễn Văn Mười, Ảnh hưởng dung môi thời gian kết tủa đến hiệu tinh sơ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tơm, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (Tập 1): 9-17 29 https://text.123doc.org/document/1395701-tim-hieu-va-thu-nhan-enzyme-protease- tu-mu-mit.htm http://luanvan.co/luan-van/de-tai-nguon-thu-nhan-enzyme-protease-ung-dung2940/ http://luanvan.co/luan-van/tong-quan-ve-enzyme-protease-17229/ 30 ... chuẩn) 2.4 Xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 2.4.1 Mục đích Phương pháp Anson cải tiến nhằm xác định hoạt tính enzyme protease (thu? ?? phân chất protein) thu từ mủ mít 2.4.2... Phương pháp xác định hoạt tính protease Từ giá trị ΔOD mẫu enzyme thay vào phương trình đường chuẩn suy số mol enzyme từ tính hoạt độ enzyme theo cơng thức: • Trong đó: o H: hoạt độ enzyme protease... hàm lượng protease trình tinh Hình IV.6: Biểu đồ thể thay đổi hoạt tính protease trình tinh Hàm lượng hoạt tính có thay đổi đáng kể theo xu hướng giảm dần Các số liệu thu từ hàm lượng hoạt tính