Nghiên cứu quy trình thu nhận xenlulo vi khuẩn từ nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu quy trình thu nhận xenlulo vi khuẩn từ nước dừa già MÃ THỊ BÍCH THẢO bichthaocnsh@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Hồng Sơn TS Nguyễn Phương Viện: Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 04/2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu quy trình thu nhận xenlulo vi khuẩn từ nước dừa già MÃ THỊ BÍCH THẢO bichthaocnsh@gmail.com Ngành Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Hồng Sơn Chữ ký GVHD TS Nguyễn Phương Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 04/2021 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Mã Thị Bích Thảo Đề tài luận văn: Nghiên cứu quy trình thu nhận xenlulo vi khuẩn từ nước dừa già Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190015 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 20/5/2021 với nội dung sau: STT Nội dung Hội đồng yêu cầu chỉnh sửa Phản hồi học viên Đã lược bớt phần tổng quan mục 1.1.1 Rút gọn, cô đọng bổ trang 5, 1.1.2 trang 7, 1.3.4 trang 15 sung thêm tài liệu phần Đã bổ sung thêm mục 1.2.1 trang 7-9, mục tổng quan 1.4.2.5 trang 16 Chỉnh sửa phần Đã lược bỏ phương pháp nghiên cứu phương pháp nghiên đơn giản, tập trung phương pháp cứu nghiên cứu Chỉnh sửa lỗi tả, Đã chỉnh sửa lỗi tả, đơn vị đo,… đơn vị đo,… Cập nhật lại tài liệu Đã cập nhật lại tài liệu tham khảo tham khảo Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm 2021 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng em với giúp đỡ tập thể nhà khoa học, luận văn có sử dụng phần kết em đồng tác giả thực Đề tài cấp nhà nước “Hoàn thiện cơng nghệ chế biến đóng gói Tetra-Pak cho sản phẩm nước dừa vùng đồng sông Cửu Long” Mã số: NATIF.TT.09.DAPT.2017 Các số liệu kết luận văn trung thực, khách quan, phần luận văn cơng bố tạp chí khoa học em đồng tác giả, thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn TS Vũ Hồng Sơn Mã Thị Bích Thảo LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực cơng trình nghiên cứu, em nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo tận tình Thầy Cơ, bạn bè đồng nghiệp quan Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục Đạo tạo, Viện Đào tạo Sau đại học -Trường Đại học Bách khoa Hà Nội quan hữu quan tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS Vũ Hồng Sơn – Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, TS Nguyễn Phương – Trung tâm Ươm tạo Công nghệ Doanh nghiệp KHCN – Viện Ứng Dụng Cơng Nghệ tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt trình thực hồn thành luận văn Em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy Cơ Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạy bảo, giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn đến Lãnh đạo Trung tâm Ươm tạo Công nghệ Doanh nghiệp KHCN –Viện Ứng Dụng Công Nghệ Công ty TNHH chế biến dừa Lương Qưới tạo điều kiện cho em thực thí nghiệm giúp đỡ em thời gian thực luận văn Cuối cùng, em xin tỏ lịng biết ơn gia đình nội ngoại, chồng, em bạn bè động viện, cổ vũ, khích lệ suốt q trình thực luận văn Tác giả luận văn MÃ THỊ BÍCH THẢO MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 11 1.1 Tổng quan nước dừa 11 1.1.1 Thành phần hóa học nước dừa 11 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng nước dừa 14 1.2 Tổng quan vi khuẩn acetic vi khuẩn A.xylinum trình lên men tạo BC 15 1.2.1 Tổng quan vi khuẩn acetic 15 1.2.2 Phân loại đặc điểm hình thái vi khuẩn A.xylinum 17 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá A.xylinum 18 1.3 Màng BC vi khuẩn A.xylinum 19 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc màng BC 19 1.3.2 Cơ chế hình thành màng BC nhờ vi khuẩn A.xylinum 20 1.3.3 Ứng dụng màng BC 21 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo màng xenlulo vi khuẩn A.xylinum 21 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum 22 1.4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum 23 1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum màng BC Việt Nam giới 24 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum màng BC giới… 24 1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum màng BC Việt Nam… 26 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu, hố chất mơi trường sử dụng 28 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.2 Hoá chất thiết bị 28 2.1.3 Môi trường 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 29 2.2.2 Phương pháp vật lý, hoá lý 30 2.2.3 Phương pháp hoá học 31 2.2.4 Phương pháp sinh học 31 2.2.5 Phương pháp xác định thơng số kỹ thuật quy trình cơng nghệ 34 2.2.6 Phương pháp toán học 35 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 Khảo sát đặc tính sinh học chủng A.xylinum phân lập, lựa chọn từ chủng giống gốc 38 3.1.1 Đánh giá đặc tính sinh học chủng A.xylinum 38 3.1.2 Xác định tỷ lệ chủng Ax3 lên men tạo màng BC 44 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp xenlulo vi khuẩn A.xylinum Tối ưu hố q trình sinh tổng hợp xenlulo vi khuẩn môi trường nước dừa già……………… 45 3.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nước dừa già làm nguyên liệu cho sản xuất xenlulo vi khuẩn 45 3.2.2 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp xenlulo chủng A.xylinum 60 3.2.3 Tối ưu hóa trình sinh tổng hợp xenlulo chủng A.xylinum 67 3.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô từ nước dừa già…… 74 3.3.1 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô 74 3.3.2 Xác định tiêu chuẩn đánh giá xenlulo vi khuẩn khô 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 Kết luận 80 Kiến nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 85 PHỤ LỤC 86 PHỤ LỤC 87 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.xylinum: Acetobacter xylinum BC: Bacterial Cellulose BNC: Bacterial nanocellulose Cs: Cộng DAP: Diamoni phosphat FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations Nata de Cocco: Thạch dừa KPH: Không phát SA: Amoni sulfat DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Thành phần hóa học trung bình nước dừa [31] 11 Bảng Độ pH, hàm lượng chất khơ hồ tan nước dừa theo tuổi thu hoạch [5] 13 Bảng Những khác biệt loài Acetobacter [15] 16 Bảng Mơ tả hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc chủng Ax1, Ax2, Ax3 đĩa petri 39 Bảng Kết nhuộm Gram chủng Ax1, Ax2, Ax3 40 Bảng 3 Đánh giá hoạt tính catalase chủng Ax1, Ax2, Ax3 41 Bảng Đánh giá khả chuyển hoá glucose thành acid gluconic 41 Bảng Đánh giá khả tổng hợp xenlulo chủng Ax1, Ax2, Ax3 43 Bảng 6: Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả tạo màng BC 44 Bảng 7: Thành phần hóa học nước dừa 45 Bảng 8: Thành phần hàm lượng acid amin có nước dừa 47 Bảng Các vitamin có nước dừa già 48 Bảng 10 Các tiêu nước dừa già sau khoảng thời gian khỏi gáo dừa 49 Bảng 11 Hàm lượng chất béo, protein, tạp chất không tan axit béo tự nước dừa già 51 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ ly tâm tới tỷ lệ thu hồi pha dầu, tỷ lệ thu hồi pha nước hàm lượng dầu pha nước 52 Bảng 13 Ảnh hưởng tốc độ ly tâm tới hiệu tách dầu 53 Bảng 14 Hiệu tách dầu thiết bị ly tâm pha dạng đĩa quy mô công nghiệp 54 Bảng 15 Hàm lượng chất béo, protein, tạp chất không tan axit béo tự nước dừa già trước sau ly tâm 55 Bảng 16 Chỉ tiêu hoá lý, vi sinh vật nước dừa già cho sản xuất xenlulo vi khuẩn 59 tổng hợp xenlulo hoàn toàn phù hợp với giá trị chạy mơ hình tối ưu hóa Bảng 25 Kết sinh tổng hợp xenlulo điều kiện tối ưu Số Thời Nhiệt độ TN gian (oC) (ngày) Hàm lượng Lượng màng Độ dai pH glucose BC màng BC (g/l) (g) (MPa) 30,5 4,5 22,1 3,89 46,69 30,5 4,5 22,1 3,92 46,71 30,5 4,5 22,1 3,94 46,75 3,92±0,025 46,72±0,031 3,93 46,73 0,69 0,56 Giá trị trung bình Giá trị dự báo t Giá trị tới hạn tb,α=5%, f=2 = 4,303 3.3 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô từ nước dừa già 3.3.1 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô 3.3.1.1 Xác định chế độ sấy màng BC a) Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ sấy đến độ ẩm màng BC Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ sấy đến độ ẩm màng BC biểu diễn đường cong sấy biểu đồ hình 3.22; Độ trắng màng BC sấy nhiệt độ khác thể biểu đồ hình 3.23: 74 Hình 21 Đường cong sấy màng BC - Từ hình 3.21 cho thấy sấy mức nhiệt độ sấy khác độ ẩm giảm nhanh đầu , sau giảm chậm dần đến độ ẩm yêu cầu ( < 5%) b) Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến độ trắng màng BC Hình 22 Độ trắng màng BC sấy nhiệt độ khác 75 - Hình 3.22 cho thấy màng BC nhiệt độ sấy 65oC cần thời gian sấy 16h, màng BC có độ trắng thấp (56%) - Màng BC sấy nhiệt độ 60oC cần thời gian sấy 21h, màng BC có độ trắng đạt (61%) - Màng BC sấy nhiệt độ 55oC thời gian 24h màng BC có độ trắng cao nhất, đạt (62%) - Màng BC nhiệt độ sấy 65oC cho độ trắng thấp (56%) so với hai mẫu màng BC lại chênh độ trắng 5% màng BC sấy nhiệt độ 60oC 6% màng BC sấy nhiệt độ 55oC , độ trắng màng tiêu đánh giá chất lượng cho vật liệu từ màng BC khô - Màng BC sấy nhiệt độ 60oC có độ trắng (61%) trênh lệch độ trắng so với màng BC sấy nhiệt độ 55oC( 62%) không đáng kể ( 1%) Tuy nhiên thời gian sấy chênh 3h ( 21h chế độ sấy 60oC 24 h chế độ sấy 55oC), em chọn chế độ sấy màng BC: nhiệt độ 60o, thời gian sấy 21h 3.3.1.2 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô Trên sở nghiên cứu xác định thông sơ kỹ thuật em tập hợp xây dựng quy trình công nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô từ nước dừa già 76 Hình 23 Quy trình cơng nghệ sản xuất xenlulo vi khuẩn khô từ nước dừa già Thuyết minh quy trình: 1/Nước dừa già: Nguyên liệu nước dừa già lấy từ tank bảo quản (theo sơ đồ hình 3.6 theo tiêu chuẩn nước dừa già ( bảng 3.16) 2/Môi trường lên men: 77 Môi trường nước dừa già điều chỉnh pH= 4,5; bổ sung đường glucose: 22,1g/l; (NH4)2SO4 với hàm lượng g/l KH2PO4 với hàm lượng g/l 3/Tiệt trùng: Tiệt trùng môi trường nhiệt độ 121oC thời gian 15 phút nhằm tiêu diệt hệ vi sinh vật vơ hoạt enzym có dung dịch tránh bị nhiễm cho trình lên men 4/Làm nguội: Đưa dung dịch mơi trường nhiệt độ thích hợp cho A.xylinum phát triển (30 ± 0,5oC) phịng vơ trùng giảm thiểu nhiễm trùng trình cấy giống lên men 5/Giống A.xylinum: Giống A.xylinum hoạt hoá nhân giống cấp 1, cấp 2… cho đủ số lượng phục vụ cho cấy giống với tỷ lệ giống cấy 10% 6/Hộp nhựa vô trùng: Hộp nhựa tráng nước nóng lau cồn phịng vơ trùng trước rót mơi trường cấy giống 7/Lên men: Lên men nhiệt độ 30±0,5oC ngày 8/Thu màng BC thô, xử lý: Màng BC tươi thu nhận sau ngày lên men, thu nhận xử lý theo bước sau: Bước 1: Vớt màng BC rửa nước Bước 2: Ép loại bỏ bớt nước Bước 3: Tẩy Trắng màng BC dung dịch sút nồng độ 2% thời gian 4h Bước 4: Trung hòa màng BC dung dịch HCl nồng độ 2% thời gian 2h Bước 5: Ép bớt nước 9/Sấy: Màng BC sấy với thông số kỹ thuật sau: Tốc độ gió 2m/s; Nhiệt độ sấy: 60oC 21h 3.3.2 Xác định tiêu chuẩn đánh giá xenlulo vi khuẩn khô Các tiêu đánh giá thể bảng 3.26: 78 Bảng 26 Chỉ tiêu đánh giá xenlulo vi khuẩn khô Tên tiêu Cảm quan Đơn vị Kết Màu sắc - Màu vàng ngà Trạng thái - Tấm mỏng, dai,mềm, có khả giữ nước tốt không tan nước Vật lý Độ ẩm %