Nghiên cứu quy trình thu nhận màng chân bì từ da người

Màng chân bì da người là phần chất nền chân bì từ da, đã được loại bỏ hoàn toàn thành phần tế bào, có cấu tạo từ các thành phần sinh học rất lý tưởng để tái tạo và sửa chữa mô khi được sử dụng như một loại vật liệu phủ vết thương hoặc dùng để lấp đầy các khuyết hổng mô mềm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu quy trình để thu nhận màng chân bì từ da người theo các tiêu chí của một loại vật liệu ghép sinh học.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN MÀNG CHÂN BÌ TỪ DA NGƯỜI Hoàng KC Hương*, Huỳnh Duy Thảo*, Võ Quốc Vũ*, Nguyễn Khánh Hòa*, Trần Thị Thanh Thủy*, Trần Cơng Toại* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Màng chân bì da người phần chất chân bì từ da, loại bỏ hồn tồn thành phần tế bào, có cấu tạo từ thành phần sinh học lý tưởng để tái tạo sửa chữa mô sử dụng loại vật liệu phủ vết thương dùng để lấp đầy khuyết hỗng mô mềm Trong nghiên cứu này, chúng tơi nghiên cứu quy trình để thu nhận màng chân bì từ da người theo tiêu chí loại vật liệu ghép sinh học Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thiết kế nghiên cứu thực nghiệm Mẫu da thu nhận từ người hiến tình nguyện, sau xử lý học để loại bỏ phần mơ thừa, sau xử lý hóa chất học để loại bỏ yếu tố tế bào Màng chân bì sau đánh giá phương pháp nhuộm mô học, đánh giá bề mặt, hóa sinh học độ an tồn mặt vi sinh Kết quả: Chúng tơi thiết lập quy trình thu nhận, xử lý tạo màng chân bì từ da người với phương pháp đánh giá hiệu để triển khai ứng dụng sản phẩm y học sau Kết luận: Đã thành công thu nhận, xử lý đánh giá số tiêu màng chân bì từ da người loại vật liệu ghép sinh học Từ khóa: Màng chân bì, da người, quy trình ABSTRACT RESEARCH PROCESS TO PRODUCE THE ACELLULAR DERMAL MATRIX OF HUMAN SKIN Hoang KC Huong, Huynh Duy Thao, Vo Quoc Vu, Nguyen Khanh Hoa, Tran Thi Thanh Thuy, Tran Cong Toai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 14 - 20 Background: Acellular dermal matrix of human skin is the dermis layer of the skin, has been completely removed cellular components Its biological components are ideal to regenerate and repair tissue when used as covering external wounds and filled the gap for damages We studied a process to obtain dermal matrix of the skin under the criteria of a biological graft material Material and Method: The study was designed as experimental studies Skin samples were collected from donors Samples will be handled mechanically to remove the excessive tissues The next will be chemical and mechanical treatment to discard cells Dermal matrix will then be assessed by histological staining, scanning surface, biochemistry as well as the microbiological safety Results: We have established procedures to process and generate dermal matrix from human skin With effective evaluation method, this product can be applied in further research and transplantation in future Conclusions: We succeeded in constructing, performing and evaluating of several criteria from acelllular dermal matrix of the skin membrane as a biological graft material Keywords: dermal matrix, human skin, protocol * Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS Hoàng KC Hương ĐT: 097735884 14 Email: hoangkchuong@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Để đáp ứng nhu cầu cho loại phẫu thuật, vật liệu sinh học nghiên cứu ứng dụng nhiều Trong số loại vật liệu ghép có nguồn gốc từ sinh học nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực ghép tạo hình, màng chân bì (Acellular Dermal Matrix) thu nhận từ da người đánh giá cao với khả hỗ trợ giúp tái tạo mô diễn nhanh giảm thiểu biến chứng sau phẫu thuật(5,9) Hiện giới, màng chân bì ứng dụng nhiều lĩnh vực phẫu thuật tái tạo thành bụng, tạo hình mơ vú sau phẫu thuật cắt bỏ khối u, lấp đầy khuyết hỗng mô mềm, phẫu thuật tạo hình: mũi, mặt, tiền đình - ốc tai, tuyến mang tai, khoang miệng Trước khả ứng dụng màng chân bì, cho thấy việc triển khai ứng dụng cần thiết nghiệp khoa học chăm sóc sức khoẻ người Việt Nam Mà trước hết cần phải thiết kế quy trình thu nhận, xử lý tạo màng chân bì khoa học với phương pháp đánh giá hiệu quả, phù hợp nhu cầu cần thiết để ứng dụng tiềm màng chân bì mang lại ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng tượng nghiên cứu Da người hiến tặng thu nhận Ngân hàng mô, thuộc Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tiêu chuẩn chọn mẫu Mẫu da thu nhận với đồng ý người hiến, ngun vẹn, khơng bị dập nát … Mẫu da phải xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV, VDRL Tiêu chuẩn loại trừ Mẫu da không cho phép người hiến, mẫu da thu nhận để tiếng nhiệt độ phòng khơng xử lý có xét nghiệm dương tính với loại xét nghiệm Nghiên cứu Y học Thu nhận mô da Mô da bảo quản lọ chứa dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (Pen/Strep, 1X) chuyển phòng thí nghiệm Mẫu bảo quản nhiệt độ -800C Thu nhận màng chân bì Mơ da cắt thành mảnh có kích thước 3x3 cm, loại bỏ mơ thừa mô mỡ, mạch máu, giữ lại phần chân bì biểu bì Quy trình cải tiến từ (7) xử lý sau: mẫu chân bì ủ NaCl (1M) trong18 giờ, rửa lại với dung dịch PBS + EDTA (0,1%), ủ dung dịch KCl (0,075M) + EDTA (0,1%), 22 giờ, rửa lại dung dịch PBS Sau mẫu tiếp tục ủ dung dịch EDTA (0,1%) + SDS (0,07%) 24 giờ, rửa lại dung dịch PBS Tách bỏ lớp biểu bì khỏi phần chân bì Sau bước xử lý với dung dịch trên, mẫu mô quay ly tâm tốc độ 2000 vòng/phút phút, lặp lại lần, để loại bỏ hóa chất xử lý làm mẫu mô Bảo quản mẫu Mẫu mô sau xử lý bảo quản theo quy trình đơng lạnh, đơng khơ Ngân hàng mô Bảo quản mẫu mô tủ lạnh 40C vòng 30 phút, sau bảo quản -200C vòng giờ, sau bảo quản nhiệt độ 800C vòng 24 Mẫu mơ đóng gói đem khử trùng tia gamma với liều chiếu 25kGy (1,2) Định liều xạ khử trùng thực theo chuẩn ISO 11137-03 Sau đó, mẫu bảo quản nhiệt độ phòng Đánh giá màng chân bì Nhuộm mơ học Màng chân bì nhuộm H&E H-SG để đánh giá cấu trúc màng theo giai đoạn: mẫu da chưa xử lý; sau xử lý thành màng chân bì sau khử trùng tia gamma Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 15 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Đánh giá bề mặt Quan sát màng chân bì kính hiển vi điện tử quét (SEM) để đánh giá bề mặt cấu trúc lỗ hổng màng chân bì Đánh giá hóa sinh học Đánh giá biến tính collagen trước sau tạo thành màng chân bì theo phương pháp GPC (Gel Permeation Chromatography) Định lượng hydroxyproline trước sau xử lý màng chân bì theo phương pháp RPC (Reversed- phase chromatography) Đánh giá độ an tồn vi sinh Đánh giá độ vơ khuẩn màng theo Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: phát có mặt vi khuẩn, nấm sản phẩm cần phải vô khuẩn A Theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 (2009), đánh giá tác động gây độc cho tế bào thơng qua q trình ni cấy ngun bào sợi người màng chân bì khoảng thời gian 24 Màng chân bì tạo thành mảnh có đường kính 1x1 cm, cho vào chai ni 25cm2 có chứa nguyên bào sợi người môi trường DMEM/F12, 10% FBS Chai nuôi giữ tủ ấm 370C, 5% CO2 Độc tính vật liệu đánh giá thơng qua việc quan sát thay đổi hình dạng tế bào KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đánh giá cấu trúc màng chân bì Mẫu đánh giá mơ học theo giai đoạn: B Hình 1: Mẫu da người trước xử lý (A) nhuộm H&E (10X) (B) Nhuộm H-SG (10X).Mẫu da phần biểu bì cấu trúc mạch máu thành phần tế bào tồn vẹn mơ da Sau xử lý hồn tất để tào thành màng chân bì (Hình 2A, 2C): lớp biểu bì hồn tồn bị loại bỏ, phần tế bào thuộc mơ liên kết chân bì rải rác Cấu trúc collagen bên phần chân bì giữ hình dạng giống mơ da ban đầu Như vậy, q trình xử lý khơng làm thay đổi cấu trúc mô da, cấu trúc tương đối ổn định Sau khử trùng tia gamma (Hình 2B, 2C) hồn tồn khơng diện lớp tế bào phần biểu bì Phần chất chân bì có nhiều khoảng trống, tạo thành cấu trúc xốp, khơng thấy diện 16 tế bao thuộc mơ liên kết.Kết hình ảnh tương đồng với tác giả khác(7,8) Kết cho thấy, từ hai phía bề mặt màng khơng thấy có dấu vết tế bào diện, màng có cấu trúc dạng xốp, khoảng trống (lỗ) liên thông với nhau, tạo thành mảng Kích thước lỗ hổng khơng giống Trung bình lỗ hổng có kích thước từ 50-270 um Chính điều điều kiện để tế bào có khả bám dính di chuyển Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học A B C D Hình 2: Mẫu sau xử lý hoàn tất khử trùng tia gamma (A) & (B) mẫu nhuộm H&E sau hoàn tất khử trùng tia gamma (10X) (C) & (D) mẫu nhuộm H-SG sau hoàn tất khử trùng tia gamma (10X) A B Hình 3: Màng chân bì đánh gia bề mặt kỹ thuật chụp SEM (A) Mặt tiếp xúc với lớp hạ bì (B) Mặt tiếp xúc với lớp biểu bì Đánh giá hố sinh học Theo phương pháp GPC, màng chân bì da xử lý thành dạng lỏng chạy qua máy lọc theo chế phân tử có trọng lượng phân tử thấp lọc trước sau hiển thị kết sơ đồ Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 17 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Sơ đồ 1: Hàm lượng collagen Trọng lượng phân tử chân bình protein mẫu chân bì da là: 1,4 x 104 g/mol, phân tử có trọng lượng từ 1,8 x 104 g/mol đến 3,8 x 104 g/mol chiếm 70% tổng số phân tử, nằm giới hạn chân bình trọng lượng phân tử collagen kết hợp fibronectin mơ da bình thường Sự xuất đỉnh acid amin khoảng phút thứ 5, từ phút khoảng 20-25 phút thứ 30, 32, 35 giai đoạn gần có tương đồng Từ sơ đồ cho thấy thành phần cấu trúc acid amin hydroxyproline không thay đổi trước sau hồn thất quy trình chế tạo màng chân bì Điều chứng tỏ quy trình chế tạo đảm bảo mặt cấu trúc collagen Đó 18 acid amin quan trọng có mặt thành phần collagen Đánh giá tiêu an tồn vi sinh màng chân bì da Mẫu sản phẩm cuối đánh giá độ vô khuẩn Viện Kiểm Nghiệm Thuốc theo Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: không phát diện vi sinh vật sản phẩm Khơng có vùng chai ni có phát triển bất thường nguyên bào sợi quan sát kính hiển vi đảo ngược Theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 , màng chân bì có số 1, độ phản ứng nhẹ, chứng tỏ không gây độc Kết tương đồng với tác giả(7) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Định lượng hydroxylproline A B C D Sơ đồ 2: Định lượng hydroxyproline trình xử lý màng chân bì (A) mẫu da tươi chưa xử lý (B) mẫu da sau xử lý học hóa học (C) mẫu da sau hồn tất thành màng chân bì (D) Sản phẩm màng chân bì sau khử trùng Hình 4: Màng chân bì bên chai ni có ngun bào sợi y tế Chúng tơi hy vọng có thêm sử ủng hộ KẾT LUẬN khuyến khích để hồn thiện nghiên cứu, Có thể nói chúng tơi thành công bước đầu việc thử nghiệm lâm sàng màng nghiên cứu chế tạo màng chân bì người chân bì da Trong tương lai chúng tơi hy vọng có Chúng tơi nhận thấy việc tạo mà màng chân bì thể ni cấy tế bào màng chân bì, da người cần thiết, tiết kiệm sử dụng triệt đánh giá phát triển hình ảnh tế để nguồn da mà trước xử lý rác thải bào giá thể Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 19 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 Bioprocess I, May 2008,chapter 2: Guide to Irradiation and Sterilisation validation of single-use bioprocess systems, page 22 Gamma radiation,chapter 9: Sterilidation by gamma,Kátia Aparecida da Silva Aquino, In tech, 3/2012, page: 171-207 Gyeol Y, Lim JS, 2009, “ Tissue Engineering of injectable soft tissue filler: Using adipose stem cells and micronized acellular dermal matrix”, DOI: 10.3346/jkms.2009.24.1.104 Hisako M, 1999,”Creation of an Acellular Dermal Matrix from Frozen Skin”, Aesthetic Plastic Surgery, 23:316-322 Jeremy DV, Latev MD, Labadie RF, Cohen SM, Werkhaven JA, and Haynes DS, 2005, “Use of Alloderm in Type I Tympanoplasty: A comparision with Native Tissue Grafts”, Laryngoscope, 115(9):1599 O’Brien JF, 2011, Biomaterials and scaffolds for tissue engineering, Materialtoday, volumn 14, number Penny H, Paul R, Eileen I, Jouhn N Kearney, 2012, “Development of a decellularised dermis”, Cell Tissue Bank, DOI 10.1007/s10561-012-9333-1 Rossner E, M.D.Smith, Petschke B, K.Schmidt, Vitacolonna M, Syring C, Versen RV, Hohenberger P, 2010, “Epiflex A New Decellularised Human Skin Tissue Transplant: Manufacrute And Properties”, Cell Tissue Bank, 12: 209-217 Stephen F B, Donald O F, Thomas W G, 2009, “Extracellular matrix as a biological scafford material: Structure and function”, ScienceDirect, 1-13 Ngày nhận báo: 03/08/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 10/08/2016 Ngày báo đăng: 05/10/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 ... nghiệm lâm sàng màng nghiên cứu chế tạo màng chân bì người chân bì da Trong tương lai chúng tơi hy vọng có Chúng tơi nhận thấy việc tạo mà màng chân bì thể ni cấy tế bào màng chân bì, da người cần... ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng tượng nghiên cứu Da người hiến tặng thu nhận Ngân hàng mô, thu c Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tiêu chuẩn chọn mẫu Mẫu da thu nhận với đồng ý người. .. giá màng chân bì Nhuộm mơ học Màng chân bì nhuộm H&E H-SG để đánh giá cấu trúc màng theo giai đoạn: mẫu da chưa xử lý; sau xử lý thành màng chân bì sau khử trùng tia gamma Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thu t