ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN ENZYME BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN ENZYME ĐỀ TÀI THU NHẬN ENZYME INVERTASE TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Invertase là một loại enzyme thủy phân saccharose được sử dụng khá phổ biến trong công nghiệp nước giải khát và bánh ngọt. Chúng có trong động thực vật, vi sinh vật và đặc biệt là nấm men có khả năng tổng hợp invertase cao. Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất trong lĩnh vực lên men tạo invertase. Trong bài thí nghiệm này, chúng em sẽ tiến hành thu nhận enzyme invertase từ chủng nấm men Saccharomyces ceravisae. Qua các quá trình nuôi cấy, nhân giống thu sinh khối vi sinh vật, sau đó sẽ ly tâm thu nhận, tách chiết và tinh sạch enzyme để đạt được nồng độ tối đa.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN- ENZYME ĐỀ TÀI THU NHẬN ENZYME INVERTASE TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE GVHD: Cô Trần Trúc Thanh Lớp : HC17SH Nhóm : – sáng thứ Thành phố Hồ Chí Minh, 04/2020 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHĨM LỜI MỞ ĐẦU Invertase loại enzyme thủy phân saccharose sử dụng phổ biến công nghiệp nước giải khát bánh Chúng có động thực vật, vi sinh vật đặc biệt nấm men có khả tổng hợp invertase cao Saccharomyces vi sinh vật quan tâm nhiều lĩnh vực lên men tạo invertase Trong thí nghiệm này, chúng em tiến hành thu nhận enzyme invertase từ chủng nấm men Saccharomyces ceravisae Qua trình nuôi cấy, nhân giống thu sinh khối vi sinh vật, sau ly tâm thu nhận, tách chiết tinh enzyme để đạt nồng độ tối đa MỤC LỤC I- TỔNG QUAN Enzyme invertase Invertase enzyme xúc tác thủy phân (phân hủy) sucrose thành fructose glucose Tên thay invertase bao gồm EC 3.2.1.26, saccharase, glucosucrase, invertin, sucrose , maxinvert L 1000, frutosylinvertase, invertase kiềm, invertase acid, β – h – fructosidase, β – fructosidase tên hệ thống β – fructofuranosidase Invertase gồm hai loại invertase nội bào có lượng phân tử vào khoảng 135000 Da invertase ngoại bào có lượng phân tử vào khoảng 270000 Da Hình 1: Enzyme invertase thủy phân saccharose thành glucose fructose 1.1 Phân loại Invertase thuộc nhóm enzyme xúc tác Hydrolase phản ứng thủy phân có tham gia H2O, phân loại sau: • EC 3: Hydrolase • EC 3.2: Glycosylase • EC 3.2.1: Glycosidase • EC 3.2.1.26: β – D – fructofuranoside fructohydrolase (cịn gọi invertase) Động học invertase • Có vùng pH rộng, từ 3.5 – 5.5, pH tối ưu 4.5 • Nhiệt độ tối ưu 55℃; nhiệt độ lớn 80℃ bị bất hoạt hồn tồn • Bị ức chế kim loại nặng Cu, Pb,… dễ phá vỡ liên kết disulfide làm enzyme hoạt tính Cấu trúc invertase Tồn nhiều dạng khác tế bào • Dạng hịa tan (dịch tế bào) • Dạng liên kết với màng • Dạng độc lập (hạt) 1.2 Ứng dụng enzyme invertase Invertase enzyme xúc tác phản ứng thủy phân saccharose thành glucose fructose (tỉ lệ mol 1:1), gọi đường nghịch đảo Đường nghịch đảo ứng dụng nhiều công nghiệp thực phẩm, đặc biệt công nghệ sản xuất bánh kẹo, nước giải khát nhiều lĩnh vực khác - Sản xuất bánh kẹo, nước Saccharose 60% • • • • - Invertase Hỗn hợp đường khử Glucose Fructose (1:1) Invertase α – D – Glucose Ngọt không bị kết tinh Hiệu suất cao (~100%) Không tạo sản phẩm phụ Chất lượng cảm quan tốt Thực phẩm chức Saccharose β – D – Fructose • • • • • • Cơ thể dễ sử dụng Cung cấp nguồn lượng thay Y học dược phẩm Hỗ trợ điều trị tiểu đường, béo phì Chữa trị bệnh tiêu hóa Có thể làm chậm tiến trình lão hóa Tăng cường hệ thống miễn dịch 1.3 Nguồn thu nhận enzyme invertase Invertase enzyme phổ biến nhiều động vật, thực vật vi sinh vật Nấm men nấm mốc có khả tạo invertase hoạt động So với nấm mốc nấm men chứa lượng invertase nhiều Vì người ta thường dùng nấm men làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm enzyme Invertase nấm mốc nấm men thủy phân sucrose, có chế chúng hồn tồn khác Vì sản xuất tùy theo yêu cầu mà ngưởi sản xuất lựa chọn enzyme invertase sinh từ nấm men hay nấm mốc Nếu cho invertase nấm men vào dịch đường rafinose, trisaccharide, tetrasaccharide chúng thủy phân dùng invertase nấm mốc khơng có tượng xảy Trong sản xuất invertase từ nấm men, tách nấm men từ bã thải bia nhà máy kinh tế cả, tận dụng bã thải sản xuất bia lượng invertase lớn nhiều loại nấm men khác Ngồi khai thác số nguồn sinh enzyme invertase khác thực vật có gạo, khoai lang, củ cải đường, nho, rau diếp, dưa chuột, mía, khoai tây Nấm men có enzyme invertase gồm chủng Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis Ở nấm mốc có chủng Thermomyces lanuginosus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulan Ở vi khuẩn có chủng Lactobacillus amylovorus, Bifidobacterium Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 2.1 Giới thiệu Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisae tế bào sống ứng dụng : sản xuất đồ uống lên men, sản xuất bánh mì, sữa chua… y học sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa biolactovin… Ngồi S cerevisiae quan tâm nhiều lĩnh vực thu nhận enzyme invertase để thủy phân đường saccharose thành đường nghịch đảo Saccharomyces cerevisae eukaryote đơn bào có kích thước – 10 µm nên tiến hành thí nghiệm vi khuẩn, ni mơi trường lỏng đặc tạo khuẩn lạc môi trường thạch Chúng thích nghi với mơi trường chứa đường cao tính acid cao Có thể ni tế bào nấm men quy mô lớn nồi lên men dễ dàng thu nhận sinh khối tế bào 2.2 Điều kiện thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisae Trong tế bào nấm men có chứa số enzyme quan trọng có tác dụng xúc tác chuyển hóa glucid đơn giản khác Do đó, tùy theo loại nấm men thuộc chi Saccharomyces dùng để nghiên cứu nuôi cấy sinh tổng hợp loại enzyme nào, nên sử dụng chất chuyển hóa tương ứng làm chất cảm ứng Bài thí nghiệm sử dụng tế bào nấm men chủng Saccharomyces cerevisae để tiến hành nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme invertase có hoạt tính cao Trong trường hợp ta lợi dụng tính chất quan trọng enzyme invertase hệ enzyme tế bào nấm men có khả thủy phân sucrose Do chọn sucrose làm chất cảm ứng môi trường nuôi sinh tổng hợp enzyme cảm ứng invertase Nấm men thuộc loài Saccharomyces cerevisae có hoạt tính enzyme invertase tương đối cao Enzyme thường tập trung chủ yếu lớp không gian chu chất tế bào nấm men Invertase enzyme nội bào, enzyme mơi trường màng tế bào bị phá vỡ tính thấm màng tế bào bị thay đổi Invertase sinh tổng hợp theo chế cảm ứng, loại đường đơn có tác dụng kìm hãm q trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Vì vậy, q trình ni nấm men để sản xuất invertase cần bổ sung lượng đường đơn vừa phải nấm men phát triển ban đầu Tóm lại, quy mơ phịng thí nghiệm, ngồi điều kiện nuôi cấy bản, để tăng khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt lực cao nấm men, áp dụng phương pháp thêm chất cảm ứng vào môi trường nuôi nấm men (như sucrose) để tăng hiệu suất thu nhận enzyme loại trừ nguồn carbon lấn át trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng (như mono oligosaccharide) HÓA CHẤT- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ II1 Hoá chất Dung dịch nước muối NaCl 0.5%, dung dịch đệm acetate pH = 4.5, dung dịch đường sucrose nồng độ 20g/l, Nước cất, DNS, albumin, dung dịch biuret STT Hóa chất Mơi trường Hansen + Glucose: 20g + Pepton: 4g + KH2PO4: 1.2g + MgSO4.7H2O: 0.8g + Nước định lượng: 400ml + Thạch: 0.75-1g Albumin 1% Biuret Cách pha - Cân xác cho thành phần môi trường vào cốc định lượng lên 400 mL nước - Khuấy đun lên cho tan hoàn toàn để nguội - Sau chiết 50 mL, thêm agar vào - Hấp tiệt trùng 1210C, 30 phút - Lấy becher rửa sạch, lau khô - Cân 1g albumin - Hòa tan từ từ với 50ml nước cất (cho albumin vào khuấy, tan từ từ) - Định mức đến 100ml - Dung dịch A: 3g CuSO4 + 12g Kali Natri Tartrate, cho từ từ - - vào 500ml nước cất, định mức đến 1000ml Dung dịch B (NaOH 2.5N): Cân 60g NaOH, cho từ từ vào 600ml nước cất Hòa tan dung dịch B vào dung dịch A, khuấy Chứa dung dịch chai tối màu Dung dịch đường sucrose Cân 20g đường sucrose sau thêm nước vào nồng độ 20g/l bình định mức đến lít DNS Hồ tan 1g DNS vào 40ml nước cất - Hoà tan 1.6g NaOH vào 15 ml nước cất - Thêm dung dịch NaOH vừa pha vào dung dịch DNS - Hoà tan khuấy t không 500C - Tiếp tục khuấy cho thêm 30g potassium sodium tartrate tan hoàn toàn, ý bao kín cốc pha hóa chất - Sau hịa tan hoàn toàn, định mức dung dịch đến 100ml, trữ chai tối Dung dịch nước muối Cân 5g NaCl tinh khiết thêm nước vào NaCl 0.5% sau định mức đến 1lít dung dịch đệm acetate Hịa tan 5,4g natri acetat (TT) 50 ml pH = 4.5 nước, thêm 2,4g acid acetic khô (TT) thêm nước vừa đủ 100 ml Điều chỉnh pH cần Dụng cụ Ống nghiệm, Becher, Erlen, Bình định mức 1L, Cuvet, Pipet 5ml, Micropipet 100-1000µL, Bình tia nhựa, Ống đong, Ống ly tâm Thiết bị Máy so màu quang phổ, Máy ly tâm, Cân III- QUY TRÌNH THU NHẬN Phương pháp nghiên cứu: Trong trình tự phân nấm men, hệ enzyme tự phân có sẵn tế bào nấm men hoạt hóa Chúng xúc tác phản ứng phân giải chất có thành tế bào nấm men giải phóng enzyme invertase ngồi tế bào Mục tiêu thí nghiệm thực trình tự phân nấm men để thu nhận invertase có hoạt tính cao Sơ đồ quy trình 10 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ống thạch nghiêng Cấy chuyền để giữ giống cho buổi TN sau Nhân giống cấp Nhân giống cấp 2, bổ sung Sucrose Ly tâm thu sinh khối nấm men Rửa với nước vô khuẩn nước muối Tách cặn Tự phân Ly tâm tách cặn không tan Chế phẩm invertase thơ Tủa enzyme Xác định hoạt tính enzyme Điện di Lọc gel enzyme invertase tinh khiết 11 Thuyết minh quy trình Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae cấp từ PTN, cấy chuyền để giữ giống cho buổi thí nghiệm sau (5 ống nghiệm), phần cịn lại tiến hành nhân giống cấp để tăng sinh khối sơ hoạt hóa chủng giống mơi trường Hansen lỏng Đưa tế bào nấm men vào 10 mL môi trường (3 ống nghiệm x 10mL = 30mL) Sau 24 ni lắc 150 vịng/phút nhiệt độ 30 oC, thời điểm gần cuối pha log, tiến hành nhân giống cấp để thu lượng sinh khối tối đa bổ sung chất cảm ứng sucrose vào mơi trường Hansen lỏng để kích thích tế bào nấm men sản sinh enzyme Nhân giống cấp erlen chứa 100mL môi trường lỏng bổ sung 5mL dịch từ ống nhân giống cấp (3 erlen) Sucrose bổ sung với nồng độ 28g/L Ni lắc 150 vịng/phút thu sinh khối nấm men môi trường Hansen lỏng nhiệt độ 30oC ngày Ly tâm thu sinh khối nấm men Trước thực trình tự phân, sinh khối nấm men đem phối trộn với nước vô khuẩn theo tỉ lệ nấm men/nước 1/3 (w/w), để lắng gạn bỏ phần nước bên Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch nước muối NaCl (0,5%) theo tỉ lệ 1/3 (w/w) Sau giờ, gạn nước tiến hành ly tâm (3000 vòng/phút 15 phút) để thu nhận sinh khối nấm men Tiếp theo, sinh khối nấm men phối trộn với dung dịch đệm acetate pH = 4.5 theo tỉ lệ 1/6 (w/w) để thực q trình tự phân Điều chỉnh pH mơi trường để bắt đầu trình tự phân 5,5 Quá trình tự phân diễn nhiệt độ 50 oC thực trình tự phân ngày Sau trình tự phân, mẫu ly tâm (4000 vịng/phút, 15 Xác định hoạt tính thơ enzyme phút) để tách bỏ phần không tan, phần dịch lỏng thu chế phẩm invertase thô Các số liệu tham khảo thí nghiệm thực để thu nhận enzyme với hoạt tính cao mà khơng phải thời gian làm thí nghiệm kiểm chứng thời gian ngắn học thí nghiệm Sau enzyme invertase thơ, đo hoạt tính enzyme thơ ghi lại kết Tiếp tục tinh chế sơ cách tủa cồn tỷ lệ dịch lọc : cồn 96% = 1: tiến hành giai đoạn tinh chế enzyme tinh khiết qua giai đoạn điện di lọc gel Cuối đánh giá hàm lượng protein theo phương pháp Biuret tính hoạt tính enzyme, hiệu suất 12 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN- ĐÁNH GIÁ Bước đầu tinh phương pháp tủa cồn 96% 1.1 Mục đích Loại bỏ tạp chất ban đầu, bước đầu tinh enzyme 1.2 Nguyên tắc IV- Độ hòa tan protein dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, số số điện mơi dung dịch Nhìn chung, phân tử dung mơi có số điện mơi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) ổn định tương tác chúng với phân tử protein tạo điều kiện thuận lợi cho hòa tan protein dung dịch Ngược lại, dung môi với số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản phân tán phân tử protein môi trường Do đó, độ hịa tan phân tử protein giảm xảy kết tủa làm giảm số điện môi hữu môi trường Điều có cách thêm dung mơi hịa tan nước aceton vào dung dịch chứa protein Sự tủa aceton ethanol có nhiều thuận lợi tương đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế enzym, nhiệt độ bay dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym phương pháp sấy nhẹ quạt gió 1.3 Phương pháp tiến hành Enzyme dễ biến tính với dung mơi hữu nên trước tủa cần làm lạnh dung dịch enzyme, cồn nhiệt độ 40C Rót cồn chảy theo thành cốc để tránh biến tính enzyme theo tỷ lệ dịch lọc : cồn 96% = 1: Để lạnh xuất tủa Định lượng protein theo phương pháp Biuret 2.1 Mục đích Phương pháp Biuret dùng để xác định hàm lượng enzyme invertase (bản chất protein) có dịch enyme thu nhận từ nấm men bia 2.2 Nguyên tắc Trong môi truờng kiềm, hợp chất chứa liên kết peptide phản ứng với thuốc thử chứa ion đồng (Cu) tạo thành phức màu xanh dương có độ hấp thụ quang cực đại bước sóng 550nm Độ hấp thụ quang tỉ lệ thuận với nồng độ liên kết peptide phản ứng dùng để định lượng protein 2.3 Phương pháp tiến hành Ống nghiệm Đối No chứng No.2 No.3 No.4 No.5 P1 P2 P3 13 Hoá chất Nồng độ albumin 10 10 0 10 (mg/ml) Nước cất (ml) Albumin chuẩn 10mg/ml (ml) Thực phản ứng Đường chuẩn Hút 1ml ống vào ống nghiệm glucose Mẫu nguyên Hút 1ml ống chất pha vào ống nghiệm loãng (n) Dung dịch Buiret ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ nhiệt độ phòng, 20 phút Ghi giá trị OD550nm - Từ giá trị OD đo được, dựng đường chuẩn dung dịch Albumin Đo giá trị OD mẫu enzyme invertase, nằm đường chuẩn dựa vào phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng protein có mẫu Nếu giá trị OD mẫu đo nằm ngồi đường chuẩn phải pha lỗng mẫu (nếu OD nằm phía đường chuẩn) dựng lại đường chuẩn với nồng độ thấp (nếu OD nằm đường chuẩn) 14 Xác định hoạt tính enzyme invertase 3.1 Mục đích Xác định khả phân hủy chất sucrose invertase 3.2 Nguyên tắc Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử acid dinitrosasylic tính đường khử mẫu nghiên cứu Từ đánh giá lượng đường khử cịn sót lại sau bị enzyme invertase phân hủy 3.3 Cách tiến hành Xây dựng đường chuẩn: Lập đường chuẩn với dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50ppm tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau: Chú ý: Sau cho thuốc thử DNS vào tiến hành chưng cách thủy cho sơi đến có màu nâu sau để nguội thêm nước cất cho đủ 10ml bảng Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 540nm Xác định hoạt tính enzyme: Phương pháp xác định hoạt tính invertase: cho vào erlen 4ml dung dịch đệm acetate pH 4,5; 4,6 ml nước cất 0,4ml dịch chứa enzyme Thêm vào 1ml dung dịch đường sucrose nồng độ 20g/l Cho phản ứng enzyme xảy xác 15 phút Sau xác định lượng lượng đường khử tạo thành phương pháp DNS, từ suy số mol sucrose bị thủy phân Hàm lượng đường khử xác định phương pháp so màu quang phổ, sử dụng thuốc thử 3, DiNitroSalycylic acid (DNS) 15 Một đơn vị hoạt tính invertase lượng enzyme cần thiết để thủy phân micromol đường sucrose phút điều kiện pH 4,5 nhiệt độ 30oC Cơng thức tính: Xác định hoạt độ invertase (HđI) hoạt độ riêng (HđR) theo phương pháp định lượng đường khử tạo thành với thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS) Xác định hoạt độ invertase theo cơng thức sau: Trong đó: • • • ĐK lượng đường khử tạo thành đo bước sóng 540 nm V thể tích enzym tham gia phản ứng xúc tác phản ứng t thời gian xúc tác phản ứng Sắc kí lọc gel 4.1 Mục đích Tách enzyme invertase dựa khác kích thước phân tử 4.2 Nguyên tắc Phương pháp sắc ký lọc gel dựa vào khác kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose hay polyacrylamide Những phân tử có kích thước nhỏ lọt vào bên lỗ gel bị trì hỗn, di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên di chuyển nhanh tách khỏi cột sớm phân tử nhỏ 16 Hình Nguyên tắc việc lọc gel 4.3 Cách tiến hành • • • • • - Hình Sơ đồ quy trình lọc gel Tính tốn lượng gel cần ngâm Cột có chiều cao 20cm, đường kính 0.7cm Nhồi gel vào cột 18cm, thể tích gel cần dùng là: Vgel = 0.352.π.18 = 6.19ml Biogel P-60 ngâm có hệ số nở 11ml/g Vậy lượng gel cần thiết là: MBiogel P-60 = Vgel/11 = 0.627g Ngâm gel 17 • Cân lượng tính tốn cho vào Becher Cho dung dịch đệm vào, thể tích dung dịch đệm phải gấp đơi thể tích gel sau trương nở Để yên 12h cho gel trương nở hồn tồn • Gạn bỏ hạt mịn bề mặt tránh làm cản trở trình lọc gel sau • cách thay dung dịch đệm phía 4-5 lần Trước nhồi vào cột, cho thêm đệm vào hỗn hợp để hỗn hợp khơng q đặt • Nhồi cột Khóa ống mao quản cột, cho gel vào dung dịch đệm cách từ từ tránh tạo bọt khí • Sau cho lớp gel vào cột gel lắng thành lớp cao khoảng 5cm, mở khóa ống mao quản để dung dịch đệm chảy từ từ Sau tiếp tục cho gel vào cột đến đạt độ cao cần thiết Trên mặt gel ln có lớp dung dịch đệm để tránh • gel bị khơ, khơng khí lọt vào Khóa mao quản lại, để gel ổn định khoảng 1-2h, sau cho chạy cột trước với dung dịch đệm, đến cột gel ổn định cho mẫu vào cột • Đưa mẫu vào cột: mở khóa mao quản đến lớp dung dịch đệm vừa cạn tới mặt gel cho mẫu vào cột Dùng pipetan hút 1ml mẫu cho vào xilanh Bơm mẫu vào cột gel sau với màng lọc 0.45µm nhẹ nhàng tránh xáo trộn gel tạo bọt khí - Thu mẫu • Lần lượt hứng mẫu ống nghiệm, ống nghiệm khoảng 3ml • Thu 20 ống, đo OD bước sóng 280nm • Sau lọc gel xong, tiến hành rửa gel nước cất, sau rửa tiếp cồn (tránh gel bị nhiễm mốc) bảo quản để sử dụng cho lần sau cột gel chưa bị tắt nghẽn Điện di 5.1 Mục đích Đối chiếu với thang chuẩn kích thước lý thuyết enzyme invertase để xem có phải enzyme thu nhận hay khơng 5.2 Ngun tắc Dựa vào di chuyển phân tử có mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngoài, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di 18 chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do hỗn hợp loại protein tách thành số vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt 5.3 Cách tiến hành Chuẩn bị gel điện di: • Gel polyacrylamide thường đặt đứng • Rửa thủy tinh nước, để khô lau lại ethanol Ráp thủy tinh theo hướng dẫn hãng sản xuất kẹp khuôn giá đỡ Pha gel điện di a/ Chuẩn bị dung dịch running gel (gel chạy) theo bảng Đổ gel chạy (running gel) trước, tới vạch khn kính Running Gel Thể tích Mono solution 2.5ml Running Gel pH 8.8 1.875ml H2O 3.125ml TEMED 5µl APS 10% 25µl Bảng Hoá chất pha Running Gel dùng để điện di Thêm uL SureCast TEMED cho mL dung dịch gel Trộn đổ gel vào giếng để dung dịch running gel (gel chạy) đông lại b/ Đổ stacking gel (gel gom) theo bảng Tổng thể tích bảng dùng cho gel 19 Stacking Gel Thể tích Mono solution 0.325ml Running Gel pH 8.8 0.625ml H2 O 1.525ml TEMED 2µl APS 10% 12.5µl Bảng Hố chất pha Stacking Gel điện di • Thêm uL SureCast TEMED cho mL dung dịch gel Trộn đổ gel vào giếng để dung dịch stacking gel (gel gom) đơng lại • Nghiêng cầm tay để dung dịch chạm đáy • Cho dung dịch stacking gel vào chạm vào cạnh miếng kiếng phía trước • Đặt cầm tay trở vị trí thẳng đứng • Đặt lược vào từ từ phía đầu trượt miếng kiếng đầu vào vị trí • Để stacking gel đơng lại (5-10phút) • Kiểm tra đơng gel cách xem lượng gel dư lại đơng chưa • Bỏ kẹp lược Gel sử dụng gói giấy thấm nước giữ độ cho lần sau Sau gel gom (stacking gel) đơng Tháo kính khỏi khn kính Lắp kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy khung điện cực Chuẩn bị mẫu: 20 Hút mẫu cần điện di 100μl vào tube 1,5ml có bổ sung 20μl Load buffer 6X Đun sôi cách thủy phút, để nguội Tiến hành điện di: Nhẹ nhàng lấy lược khỏi điện di Bơm mẫu vào giếng với lượng 20μl Thang chuẩn Protein Ladder với lượng 10-15μl Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, 100V- 200V, 30 - 90 phút Sau vạch màu thị xuống gần đến đáy gel, tắt điện lấy gel Nhuộm gel rửa nhuộm: Sau lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution) Lắc nhẹ 10-30 phút cho Staining solution thấm vào gel Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution) Thay dung dịch rửa vài lần với thời gian khoảng 15 phút/lần miếng gel có màu suốt xuất nhiều vạch xanh lơ gel Quan sát vạch xác định kích thước enzyme dựa vào thang chuẩn gel V- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 5.1 Đường chuẩn Albumin 5.2 Đường chuẩn đường khử 5.3 Kết đo, tính tốn hàm lượng hoạt tính enzyme Mẫu Tỷ lệ (mẫu/cồn) Hàm lượng OD E1 E2 Hoạt tính mG/mL OD UI/g 1:3 1:3 21 E3 1:3 Bảng Kết khảo sát hàm lượng hoạt tính tối ưu cho việc thu nhận invertase thơ Mẫu Tỷ lệ (mẫu/cồn) Hàm lượng OD Hoạt tính mG/mL OD UI/g E1 1:3 E2 1:3 E3 1:3 Bảng Kết khảo sát hàm lượng hoạt tính tối ưu cho việc thu nhận invertase tinh Nhận xét 5.4 Kết lọc gel Nhận xét 5.5 Kết hàm lượng hoạt tính enzyme giai đoạn với tỷ lệ cồn tối ưu Mẫu HÀM LƯỢNG OD550 HOẠT TÍNH mg/ml OD660 UI/g E2 E3 E4 E5 Bảng Kết khảo sát hàm lượng hoạt tính invertase với tỉ lệ cồn tối ưu Nhận xét 5.6 Kết điện di Nhận xét VI- KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 ... 1.3 Nguồn thu nhận enzyme invertase Invertase enzyme phổ biến nhiều động vật, thực vật vi sinh vật Nấm men nấm mốc có khả tạo invertase hoạt động So với nấm mốc nấm men chứa lượng invertase nhiều... nhiều lĩnh vực lên men tạo invertase Trong thí nghiệm này, chúng em tiến hành thu nhận enzyme invertase từ chủng nấm men Saccharomyces ceravisae Qua q trình ni cấy, nhân giống thu sinh khối vi... nấm men hay nấm mốc Nếu cho invertase nấm men vào dịch đường rafinose, trisaccharide, tetrasaccharide chúng thủy phân dùng invertase nấm mốc khơng có tượng xảy Trong sản xuất invertase từ nấm men,