Định lượng bằng HPLC docx Pha tĩnh trong HPLC 1 Yêu cầu của pha tĩnh Phải trơ và phải bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay chất p.Định lượng bằng HPLC docx Pha tĩnh trong HPLC 1 Yêu cầu của pha tĩnh Phải trơ và phải bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay chất p.
Pha tĩnh HPLC [1] Yêu cầu pha tĩnh: - Phải trơ phải bền vững với điều kiện mơi trường sắc ký, khơng có phản ứng hóa học phụ với dung mơi rửa giải hay chất phân tích, để đảm bảo chế tách theo chất pha tĩnh, hay khơng gây chất phân tích cần tách - Pha tĩnh phải có khả tách chọn lọc hỗn hợp chất tan định điều kiện sắc ký định hệ pha HPLC chọn - Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt độ xốp, không biến dạng q trình sắc ký, khơng bị phân rã áp suất cao hay dung môi trình chạy sắc ký - Cân động học tách sắc ký phải xảy nhanh, tuận nghịch lặp lại tốt Có thu kết phân tích tốt, pic sắc ký cân đối gọn - Cỡ hạt phải tương đối đồng 🡪 số đĩa lý thuyết cao Pha động HPLC [1]: Pha động: hệ dung môi dùng để rửa giải chất tan Xi (chất phân tích) khỏi cột tách để thực trình sắc ký Pha động dung mơi hỗn hợp nhiều dung mơi Ngồi chứa hệ đệm, chất tạo phức (phối tử), chất diện hoạt…Với loại sắc ký có hệ dung môi rửa giải riêng phù hợp với nó, để thu hiệu tách tốt Yêu cầu pha động: - Phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo tính chất q trình sắc ký Khơng có tương tác phụ với pha tĩnh để sinh sản phẩm khác làm phức tạp cho q trình tách chất - Pha động phải hịa tan chất phân tích Xi Có làm cho chất mẫu đưa vào pha động vận chuyển tốt tốt từ đầu cột tách 🡪 cuối cột tách tránh gây tắc cột - Pha động phải bền vững theo thời gian, khơng thay đổi, có thành phần không bị phân hủy hay thay đổi suốt trình sắc ký kiểm sốt xác (chạy chế độ gradient dung mơi) - Phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết phân tích - Nhanh đạt cân q trình sắc ký, cân hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, tùy chất loại sắc ký - Phải phù hợp với Detector Vd với detector UV/ UV-VIS pha động phải suốt vùng phổ dùng detector huỳnh quang pha động phải khơng có tính chất huỳnh quang - An toan, độc, rẻ tiền, dễ kiếm… Quá Trình Tách [1] Các tương tác trình tách sắc ký xảy chất phân tích Xi, pha tính SP, pha động MP Frủa giải = F1 + F2 + F3 F1 : lực lứu giữ pha tĩnh gây lên chất phân tích: F1 lớn 🡪 tzan lưu tăng ngược lại F1: phụ thuộc vào ⮚ chất pha tĩnh: loại pha tĩnh (quyết định tính phân cực/ khơng phân cực pha tĩnh 🡪 ảnh hưởng đến phân bố chất phân tích lực tương tác chất phân tích pha tĩnh), độ xốp (ảnh hưởng đến khả hấp phụ pha tĩnh), vị trí nhóm hoạt động sắc ký bề mặt pha tĩnh vd: OH, NH2 … (các nhóm chức ảnh hưởng đến lực tương tác chất phân tích pha tĩnh vd liên kết hydro, van der waals, lực hút tĩnh điện…), kích thước hạt nhồi 🡪 diện tích bề mặt tiếp xúc chất phân tích pha tĩnh, hình dạng hạt nhồi ảnh hưởng đến tính phức tạp dịng dung mơi pha qua cột ⮚ Bản chất chất phân tích: độ phân cực , tính acid base (quyết định dạng tồn 🡪 lực liên kết, phân bố), kích thước (trong sắc ký loại cỡ) khối lượng phân tử, loại nhóm chức phân tử (quyết định tính tân dầu thân nước 🡪 tương tác pha tĩnh), loại/vị trí nhóm 🡪 định momen lưỡng cực 🡪 ảnh hưởng đến phân cực phân tử , số/hệ số phân bố… ⮚ Môi trường: pH 🡪 ảnh hưởng đến liên kết acid/base , nhiệt độ: ảnh hưởng đến khả hấp thu, dễ làm phá vỡ liên kết yếu liên kết Hydro, liên kết van der waals F2: lực lôi kéo pha động gây lên chất phân tích 🡪 F2 lớn thời gian lưu giảm ngược lại F2 phụ thuộc vào ⮚ Bản chất thành phần dung môi pha động (độ phân cực), tốc độ dịng (ảnh hưởng tới tách thơng qua phương trình Vandeemton- p.tr tính bề dày đĩa lý thuyết) ⮚ Bản chất chất phân tích: phân tích ⮚ Với sắc ký tảo đổi ion cặp ion F2 cịn phụ thuộc vào pH pha động, lực ion pha động, tính chất trao đổi ion, chất ion tạo cặp F3: lực tương tác pha tĩnh pha động 🡪 định tốc độ di chuyển pha động cột 🡪 ảnh hưởng tới thời gian lưu.thông thường lựa chọn điều kiện sắc ký người ta lựa chọn pha tĩnh/động cho F3 nhỏ F3 phụ thuộc vào ⮚ ⮚ ⮚ ⇨ ⇨ ● ● Sự khác biệt chất hóa học pha động pha tĩnh (độ phân cực) Độ nhớt Nhiệt độ (ảnh hưởng thông qua độ nhớt) Từ loại tương tác tác cho thấy Frủa giải phụ thuộc vào yếu tố: Bản chất đặc trưng pha tĩnh, kiểu cấu trúc xốp, độ xốp, bề mặt hoạt động vcác nhóm chức hoạt động, kích thước hạt nhồi hình dạng hạt Bản chất dung môi tạo pha động thành phần chúng, tốc độ di chuyển pha động chạy sắc ký Tính chất đối ion ion tạo cặp (trong sắc ký ion) pH pha động Chất hoạt động bề mặt, chất tạo phức, chất làm chậm, chất điện ly có mẫu Nhiệt độ cột tách Trong F3 đóng vai trị thứ yếu Do đó, hai yếu tố quan chất pha tĩnh pha động Ứng với chất phân tích điều kiện sắc ký cụ thể có F1 F2 khác dẫn đến Frủa giải khác 🡪 tốc độ di chuyển cột khác 🡪 thời gian lưu khác 🡪 định tính Lưu ý: có trường hợp chất phân tích khác F1 F2 hai chất lại xấp xỉ (đồng phân đối quang) F1 F2 khác Frủa giải lại xấp xỉ thời gian lưu chất xấp xỉ 🡪 không khẳng định hai chất có thời gian lưu trùng Hay nói cách khác tiêu chí tzan lưu có ý nghĩa “chẩn đốn loại trừ” Định tính HPLC [1] Trong hệ pha điều kiện sắc ký định chất tan Xi có thời gian lưu tRi khác Chính đại lượng tính chất/ thơng số đặc trưng cho chất phân tích Xi dùng để phát (một cách “định tính”) chất hỗn hợp mẫu phân tích ❖ Nguyên tắc: B1: Chuẩn bị mẫu chuẩn tiến hành chạy sắc ký 🡪 thu lấy sắc ký đồ 🡪 Xác định thời gian lưu chất chuẩn B2: Chuẩn bị tiến hành chạy sắc ký mẫu phân tích (mẫu thử) 🡪 thu lấy sắc ký đồ 🡪 xác định thời gian lưu pic sắc ký đồ mẫu phân tích B3: Từ thời gian lưu pic sắc ký đồ mẫu phân tích, đem so sánh với thời gian lưu sắc ký đồ mẫu chuẩn từ xác định sơ mẫu phân tích có thành phần (nếu chúng có thời gian lưu xấp xỉ với thời gian lưu chất chuẩn) ❖ Tuy nhiên, có thời gian lưu thành phần mẫu thử ~ thời gian lưu chất chuẩn tương ứng khơng thể khẳng định chắn 100% thành phân có chất hóa học với chất chuẩn Do có tượng nhiều chất khác có thời gian lưu chạy điều kiện sắc ký, mặt khác thời gian lưu số tính chất đặc trưng chất phân tích nên chưa thể đại diện hết cho chất phân tích 🡺 Muốn nhận biết chất phân tích cần sử dụng thêm tính chất đặc khác phổ (chồng phổ 🡪 xác định hệ số march/ xác định độ tinh khiết pic…) ĐỊNH LƯỢNG HPLC [1] Dựa hai phương trình bản: S = k.Cb H = k.Cb - H chiều cao; S diện tích pic; C nồng độ; k số thực nghiệm; b lag số chất < b≤ 1) Khi b = 🡪 mối quan hệ H-C hay S-C tuyến tính S= k.C ; H = k.C Trong hai mối quan hệ quan hệ S = f(C) có khoảng tuyến tính rộng nên thực tế hay sử dụng Các phương pháp định lượng 1.1 Phương pháp đường chuẩn ❖ Nguyên tắc: B1: Pha dãy mẫu chuẩn chất phân tích X có nồng độ C0 🡪 C5 mẫu phân tích (mẫu thử) CX1, CX2…trong điều kiện phù hợp với C0 mẫu trắng B2: Chọn điều kiện (quy trình sắc ký) để chạy ghi sắc ký đồ dãy mẫu chuẩn mẫu phân tích (mẫu thử) B3: Xác định chiều cao hay diện tích píc pic sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử B4: Dựng đường chuẩn theo quan hệ Hi-Ci Si-Ci B5: Từ giá trị Hx hay Sx mẫu phân tích áp vào đường chuẩn tương ứng để xác định nồng độ tương ứng CX1, CX2… ❖ Ưu điểm - Phù hợp để xác định loạt mẫu có đối tượng phân tích - Đơn giản, nhanh dễ thực - Có thể định lượng lúc nhiều chất sắc ký đồ mẫu nhiều thành phần ❖ Hạn chế: Khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp (vd mẫu dược liệu, thực phẩm…) KHÔNG THỂ chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn phù hợp với mẫu phân tích mẫu, thành phần hóa học vật lý chất mẫu thực ( khơng biết thành phần tỷ lệ mẫu) khơng đánh giá hết ảnh hưởng mẫu 🡪 sai số đặc biệt phân tích thành phần có hàm lượng thấp Trong TH có hai cách giải (cải biến mẫu/ tốt phương pháp thêm chuẩn) 1.2 Phương pháp thêm chuẩn ❖ Nguyên tắc Trong trường hợp thành phần mẫu phức tạp (chưa biết) hàm lượng chất phân tích nhỏ nên sử dụng phương pháp thêm chuẩn để loại trừ ảnh hưởng thành phần mẫu 🡪 hạn chế sai số Nguyên tắc: B1: Dùng dung dịch mẫu thử để làm pha chế dãy mẫu chuẩn chất phân tích Cụ thể mẫu phân tích mà chất phân tích có nồng độ CX, lấy thể tích định mẫu ví dụ V1 ml vào bình định mức đánh số C0 🡪 C5 pha dãy chuẩn Sau cách gia thêm vào mẫu bình lượng xác nồng độ chất phân tích Xi theo cấp số cộng ΔC vùng tuyến tính Các chất Mẫu số Lượng mẫu (mL) Chất phân tích Xi (ΔC thêm, ppm) H Spic Dãy mẫu chuẩn Cx C1 V1 V1 C2 V1 C3 V1 C4 V1 C5 V1 10 2,0 2,10 5,54 5,60 8,10 8,20 10,65 10,70 13,20 13,30 4,5 4,55 B2: Tiếp theo tiến hành chạy sắc ký tất mẫu chuẩn mẫu thử Ghi lại sắc ký đồ tính giá trị Hx , SX chất phân tích X mẫu thử B3: Dựng đừng chuẩn H- ΔC hay S- ΔC B4: Ngoại suy đường chuẩn để xác định giá trị CX ❖ Ưu điểm: loại trừ ảnh hưởng thành phần mẫu phân tích cho kết xác trung thực phân tích chất có hàm lượng thấp (lượng vết) mẫu có thành phần phức tạp ❖ Tuy nhiên, thực tế trước định sử dụng phương pháp thêm chuẩn cần phải định lượng lại số mẫu chuẩn (mẫu biết nồng độ) để đánh giá độ độ xác phương pháp 1.3 Phương pháp chuẩn điểm Khi có vùng tuyến tính chất, nhiều trường hợp khơng cần thiết phải dựng đường chuẩn, mẫu chuẩn đắt, nên cần mẫu chuẩn để tính tốn nồng độ chất X mẫu thử, phương pháp thêm chuẩn điểm đời Phương phâp áp dụng hai tình huống: + Khi có chất chuẩn: Tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn mẫu thử, chạy sắc ký điều kiện ⇨ CX = Cch * 𝑆𝑡ℎử 𝑆𝑐ℎ Cách khó khăn mẫu phân tích có thành phần phức tạp khơng biết xác, khó chuẩn bị mẫu chuẩn có thành phần mẫu giống mẫu thử nên nhiều thường mắc sai số ảnh hưởng thành phần mẫu + Khi khơng có mẫu chuẩn (dùng cách thêm chuẩn) Lấy hai lượng mẫu thử (để có hai mẫu), mẫu để nguyên mẫu thêm lượng xác ΔCX chất X vào Rồi xử lý điều kiện sau chạy sắc ký, ghi sắc ký đồ có: Mẫu không thêm: SX = k.CX Mẫu thêm chuẩn; St.ch = k(CX + ΔC X) ⇨ 𝑆𝑋 𝑆𝑡.𝑐ℎ = 𝐶𝑋 𝐶𝑋 + Δ𝐶𝑋 ❖ Ưu điểm: loại bỏ ảnh hưởng thành phần mẫu mẫu thử mẫu thêm chuẩn có thành phần mẫu ❖ Tuy nhiên phương pháp cho kết mẫu thêm chuẩn mẫu thử nằm khoảng tuyến tính ❖ Một điểm cần lưu ý: áp dụng hệ số chắn trục tung khác khơng đáng kể Vì ta có SX = k.CX 1.4 Chuẩn hóa diện tích ❖ Ngun tắc: dựa sở tổng diện tích tất pic sắc ký chất có mẫu có sắc ký đồ ( khơng tính pic dung mơi) lằ 100% Khi %Xi = 𝑆𝑖 ∑𝑆𝑖 * 100% ❖ Ưu điểm: nhanh, không cần chất chuẩn ❖ Nhược điểm: Chỉ phương pháp tính gần bỏ qua số yếu tố gây sai số sau: ⮚ Một số chất thực tế có tồn mẫu phân tích detector lại khơng phát ⮚ Nếu độ nhạy detector bị giảm độ nhạy pic chất có nồng độ thấp khơng phát sắc ký đồ (mặc dù chúng có mẫu phân tích) 🡪 sai số ⮚ Hệ số đáp ứng chất detector khác nhiều: %Xi = 𝑓𝑖*𝑆𝑖 ∑𝑓𝑖*𝑆𝑖 fi hệ số đáp ứng chất Xi Muốn xác định fi phải có chất chuẩn có cách xác định Cách 1: chuẩn hóa điểm: Dùng dung dịch chuẩn có nồng độ Cch 🡪 chạy sắc ký đồ 🡪 xác định Sch 🡪 fi = 𝐶𝑖 𝑆𝑖 Trong mẫu có thành phần dùng nhiêu chất chuẩn 🡪 xác định hệ số fi Từ xác định hàm lượng Tuy nhiên cách sử dung hệ số chắn trục tung không đáng kể ( điểm cắt nằm gần gốc tọa độ) [2] Cách 2: chuẩn hóa đa điểm Dùng dãy dung dịch chuẩn có nồng độ C0, C1… 🡪 chạy sắc ký đồ 🡪 xác định Sch 🡪 lập đường chuẩn 🡪 fi = độ dốc đường chuẩn Cách áp dụng hệ số chắn trục tung đáng kể (điểm cắt nằm xa gốc tọa độ) [2] Sử dụng chuẩn ngoại: Yêu cầu: phải có chất chuẩn (chỉ cần chuẩn) Ưu điểm: cần cân lần nên nguy mắc sai số cân phương pháp chuẩn nội (phải cân lần chuẩn nội + chuẩn ngoại), tách sắc ký đồ dễ đạt chuẩn nội coi mẫu có thành phần) Nhược điểm: mắc sai số trình cân sử lý mẫu Sử dụng chuẩn nội: Yêu cầu phải có chất chuẩn (1 chuẩn ngoại + chuẩn nội) chất chuẩn nội phải tách khỏi chất phân tích/ chất chuẩn ngoại sắc ký đồ 🡪 cần khảo sát nghiêm ngặt so với chuẩn ngoại Thời gian lưu gần chất phân tích Ưu điểm: Hạn chế sai số mẫu trình sử lý mẫu sai số cân + tiêm sắc ký cho kết lặp lại tốt Nhược điểm: chất tìm chuẩn nội a Luận Phạm Luận (2016), "Phương Pháp phân tích sắc ký chiết tách ", pp B Harshad V Paithankar (2013), "Hplc method validation for pharmaceuticals: A review ", International Journal of Universal Pharmacy and Bio Sciences, pp ... thời gian lưu trùng Hay nói cách khác tiêu chí tzan lưu có ý nghĩa “chẩn đốn loại trừ” Định tính HPLC [1] Trong hệ pha điều kiện sắc ký định chất tan Xi có thời gian lưu tRi khác Chính đại lượng... tính chất đặc khác phổ (chồng phổ