Bài giảng phân tích định lượng bằng hplc

Phần I : Cơ sở lý thuyết HPLC  HPLC chữ viết tắt 04 chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)  Phương pháp đời từ năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày phát triển đại hoá cao nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích Hiện áp dụng lớn nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc Và cơng cụ đắc lực phân tích thuốc đa thành phần cho phép định tính định lượng Phần I : Cơ sở lý thuyết - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp chia tách pha động chât lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn ,hay chất mang biến đổi liên kết hố học với nhóm chức hữu Q trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) 2- Nguyên tắc trình sắc ký cột : Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký lọai sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận pha đảo Nếu pha tĩnh chất trao đổi Ion ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh chất Lỏng ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Phần I : Cơ sở lý thuyết Nếu pha tĩnh Gel ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử  Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích khỏi cột ,chúng ta cần có pha động  Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết chất A,B,C Sẽ tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác Chất phân tích A +B+C F1 Pha tĩnh F2 F3 Pha động Phần I : Cơ sở lý thuyết  Tổng 03 tương tác định chất rửa rải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ ( F1) ngược lại  Đối với chất ,sự lưu giữ qui định 03 lực F1,F2,F3 Trong F1 F2 giữ vai trò định F3 yếu tố ảnh hưởng không lớn  Ở F1 lực giữ chất phân tích cột F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột  Như với chất khác F1 F2 khác ,Kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột ( hình ) Phần I : Cơ sở lý thuyết Phần minh hoạ trình tách chất A B cột tách sắc ký Pha động Thời gian A B Phần I : Cơ sở lý thuyết - Phân loại sắc ký : Theo chế tách sắc ký người ta phân loai sau : 3.1 Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa hấp phụ mạnh ,yếu khác pha tĩnh chất tan rửa giải ( phản hấp phụ ) pha động để kéo chất tan khỏi cột Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học chất hấp phụ Trong trường loại có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực Loại sắc ký áp dụng thành công để tách hỗn hợp chất có tính chất gần tương tự thuộc loại khơng phân cực,phân cực yếu hay trung bình Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện sử dụng có loại sắc ký mà Phần I : Cơ sở lý thuyết  Chủ yếu sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP )  Trong dược điển USP tra cứu cột có giá trị tương ứng sau :  L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m  L7 : RP Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m  L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m  Và số loai cột khác cột Diol , Cột NH2,CN vv Phần I : Cơ sở lý thuyết - Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ Kết trình tách chất Detector phát ghi thành sắc ký đồ hình Phần I : Cơ sở lý thuyết To : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 : Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B tr2 tr1 t’r1 to t’r2 Phần I : Cơ sở lý thuyết Từ thông số peak ,nhiều đại lượng đặc trưng lý thuyết đưa để đánh giá trình sắc ký Dưới số đại lượng thường dùng thực tế cách thay đổi đại lượng có lơi cho q trình phân tích sắc ký 4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time Thời gian lưu chất thời gian tính từ bơm mẫu vào cột chất khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu chất định chất khác thời gian lưu khác điều kiện sắc ký chọn Vì thời gian lưu đại lượng để phát định tính chất Thời gian lưu phụ thuộc vào yếu tố : + Bản chất sắc ký pha tĩnh + Bản chất ,thành phần,tốc độ pha động + Cấu tạo chất phân tử chất tan + Trong số trường hợp thời gian lưu phụ thuộc vào pH pha động 10 Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Pha Động : Pha động dùng loại dung mơi có phân cực :Methanol ,Acetonitril,,nước hay loại dung dịch đệm ,hỗn hợp dung môi-đệm Sự tách chất nhồi loại cột có độ lặp lại cao ứng dụng chủ yếu phân tích Dược phẩm Hiện sử dụng loại chủ yếu Hiện pha tĩnh Silicagel có hàng trăm chất khác tùy thuộc vào nhóm ngun tử H ,ngồi cịn có lọai pha tĩnh Oxid Nhôm,trên chất hữu cao phân tử,trên mạch bon 39 Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.2 : Lựa chọn pha động - Dựa vào tài liệu ,Dược điển ,thành phần tính chất chất có mẫu phân tích .ta lựa chọn pha động phù hợp q trình rửa giải tách hồn tồn chất có mẫu đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn peak trình bày đồng thời phải có thời gian phân tich phù hợp nhằm tiết kiệm dung mơi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu hoạt động thiết bị - Pha động làm thay đổi : + Độ chọn lọc  + Thời gian lưu 40 Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký - Pha động làm thay đổi : + Hiệu tách cột + Độ phân giải + Tính đối xứng Peak Do ,Trong pha tĩnh chọn ta chọn pha động có thành phần phù hợp ta có hiệu suất tách sắc ký tốt hỗn hợp chất cần phân tích Chính pha động cần có cầu yêu cầu sau : + Pha động phải trơ với pha tĩnh có Khơng làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( vd giá trị pH : 2.5< pH