ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ bộ xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG FRUCTOSE và kẽm TRONG TINH DỊCH góp PHẦN xác ĐỊNH NGUYÊN NHÂN vô SINH NAM

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI BÍCH MAI ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ BỘ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG FRUCTOSE VÀ KẼM TRONG TINH DỊCH GÓP PHẦN XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN VÔ SINH NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 2 3 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI BÍCH MAI ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ BỘ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG FRUCTOSE VÀ KẼM TRONG TINH DỊCH GĨP PHẦN XÁC ĐỊNH NGUN NHÂN VƠ SINH NAM Chuyên ngành : Y sinh học- Di truyền Mã số : 60720102 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TRANG PGS.TS HOÀNG THỊ NGỌC LAN HÀ NỘI - 2018 4 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn quý báu, giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị, bạn bè gia đình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Sau đại học, Bộ mơn Y sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội thầy cô anh chị Bộ môn tạo điều kiện, giúp đỡ tận tình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trang - người hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn q trình nghiên cứu, học tập, truyền cho tơi niềm say mê nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Hồng Thị Ngọc Lan - Cô đồng hướng dẫn, hướng dẫn, giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình nghiên cứu Các Thầy cô Hội đồng khoa học thông qua đề cương bảo vệ luận văn đóng góp nhiều ý kiến q báu cho tơi q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin cảm ơn bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln động viên tơi, bạn bè giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2018 Bùi Bích Mai 5 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn: “Đánh giá giá trị xét nghiệm định lượng Fructose kẽm tinh dịch góp phần xác định nguyên nhân vô sinh nam” hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trang PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan hồn tồn tơi thực Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố trước Hà Nội, ngày 05 tháng năm 2018 Bùi Bích Mai MỤC LỤC 6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 5- Br- PAPS 5-Bromo-2-pyridiylazo (-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl) amino AZF Azoospermia Factor DNA Deoxyribonucleoid Acid FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Releasing Hormone HCl Axit chlohidric KTV Kĩ thuật viên LH Luteinizing Hormone NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reacion TCA Trichloroacetic Acid TESE Testicular Sperm Extracion WHO World Health Organization 7 DANH MỤC BẢNG 8 DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển xã hội nhận thức người dân bệnh tật ngày nâng cao việc chăm sóc sức khỏe sinh sản dần quan tâm nhiều tỉ lệ vô sinh muộn cặp vợ chồng ngày tăng Theo tổ chức Y tế Thế giới, 10% - 15% cặp vợ chồng độ tuổi sinh sản bị vô sinh, 40% nữ giới, 30-40% nam giới, 10% nam nữ, lại 10% khơng rõ nguyên nhân [1] Trong vô sinh nữ biết đến nghiên cứu từ lâu gần đây, vô sinh nam trọng nhiều Đã có nhiều phương pháp đời đề phục vụ cho việc chẩn đốn điều trị vơ nam siêu âm tinh hồn, mổ thăm dò tinh hồn, xét nghiệm gen, nhiễm sắc thể gần xét nghiệm hóa sinh tinh dịch áp dụng để đánh giá chức sinh sản nam giới Fructose kẽm hai chất có vai trò quan trọng sức khỏe nam giới định lượng phương pháp hóa sinh Theo WHO năm 2010, nồng độ fructose tinh dịch thấp đặc trưng cho tình trạng tắc nghẽn ống dẫn tinh (bất sản ống dẫn tinh, bất sản túi tinh ) [2] Nồng độ fructose tinh dịch bình thường khẳng định chức đường dẫn tinh, túi tinh bình thường, khơng gặp trường hợp tắc nghẽn [3] Chính lý này, phương pháp định lượng fructose tinh dịch có giá trị xác định bệnh nhân có tinh trùng hay không mà không cần sử dụng đến biện pháp xâm lấn Bên cạnh số fructose kẽm đóng vai trò quan trọng tinh trùng Nồng độ kẽm có liên quan đến số lượng, độ di động hình thái tinh trùng; cải thiện nồng độ testosterone máu cải thiện khả tình dục [4] Vì định lượng nồng độ kẽm tinh dịch cần thiết xét nghiệm thường quy để bổ sung cho xét nghiệm tinh dịch đồ 10 thơng thường, giúp bác sĩ lâm sàng có cách điều trị định chế độ ăn phù hợp để làm tăng số lượng chất lượng tinh trùng tăng khả thụ thai Ở Việt Nam, xét nghiệm định lượng fructose kẽm tinh dịch chưa phổ biến hóa chất xét nghiệm phải nhập từ nước với giá thành cao Xuất phát từ vấn đề thực tế trên, thực đề tài: “Đánh giá giá trị xét nghiệm định lượng fructose kẽm tinh dịch góp phần xác định ngun nhân vơ sinh nam” với mục tiêu sau: Xác định nồng độ fructose kẽm tinh dịch xét nghiệm tự pha chế kit thương mại Đánh giá giá trị xét nghiệm tự pha với kit thương mại 59 dịch HCl 15% (thay 30-32 % so với phương pháp ROE gốc) [51], phức hợp màu tạo fructose với HCl resocinol, đơn giản so với fructose + HCl+ resocinol+ axit benzoic phương pháp gốc [52] Chúng sử dụng hai phương pháp để tiến hành định lượng fructose tinh dịch cho 300 bệnh nhân chẩn đốn vơ sinh nam Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Kết cho thấy rằng, nhóm có số số TDĐ bất thường nhóm khơng có tinh trùng, có trường hợp ngưỡng với xét nghiệm tự pha ngưỡng với kit thương mại ngược lại (nồng độ ngưỡng với xét nghiệm tự pha dưỡi ngưỡng với kit thương mại) Có trường hợp kit cho kết gần quanh ngưỡng 1,3 g/l Cụ thể ví dụ nhóm khơng có tinh trùng, xét nghiệm tự pha cho kết nồng độ fructose 1,32 g/l kit thương mại cho kết 1,29 g/l, điều dẫn đến kết luận khác cho tình trạng bệnh nhân dẫn đến bỏ xót chẩn đốn xét nghiệm tự pha chế 4.1.2 Xác định nồng độ kẽm tinh dịch xét nghiệm tự pha kit thương mại Định lượng kẽm tinh dịch xét nghiệm bệnh nhân nam đến khám điều trị bệnh lý liên quan đến sức khỏe sinh sản nam Nồng độ kẽm tinh dịch người bình thường từ 0,31- 1,53 µmol/l Kẽm dưỡng chất chủ yếu dùng để điều trị rắc rối sức khỏe tình dục nam giới chứng tăng sản tiền liệt lành tính, rối loạn chức cương cứng vơ sinh nam giới Đặc điểm quan trọng kẽm nằm chỗ chúng nhân tố định cho chất lượng tinh trùng nam giới Tiến sĩ J Mayer- giáo sư dinh dưỡng học Đại học Harvard (Mỹ) TS Andre Voisin- nhà dinh dưỡng học tiếng Pháp, hàm 60 lượng nguyên tố kẽm ảnh hưởng tới phát dục, khả tình dục (giới tính) chi phối trạng thái hoạt động tuyến tiền liệt[53] Nghiên cứu tiến hành định lượng nồng độ kẽm mẫu tinh dịch với xét nghiệm tự pha kit thương mại nhằm đánh giá sơ khả định lượng nồng độ kẽm xét nghiệm tự pha với kit đạt chuẩn quốc tế Kết cho thấy rằng, nhóm khơng có tinh trùng nhóm chứng, hai xét nghiệm đưa kết nồng độ kẽm ngưỡng giới hạn bình thường Trong nhóm có số số bất thường, có trường hợp định lượng ngưỡng xét nghiệm tự pha bình thường với kit thương mại Bước đầu thấy xét nghiệm tự pha cho nồng độ kẽm thấp điều dẫn đến chẩn đoán sai lệch Cùng với xét nghiệm định lượng fructose, để khẳng định xét nghiệm tự pha có đạt chuẩn để định lượng nồng độ fructose/ kẽm giá trị định lượng có tương đương với xét nghiệm đạt chuẩn giới hay không, tiếp tục tiến hành đánh giá tính xác tính tương đương xét nghiệm tự pha chế 4.2 Đánh giá giá trị xét nghiệm tự pha với kit thương mại 4.2.1 Đánh giá độ xác xét nghiệm định lượng fructose kẽm tự pha chế Dựa vào yêu cầu phương pháp thực tế điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đánh giá độ xác bao gồm độ chụm độ 4.2.1.1 Khảo sát độ chụm Trong thử nghiệm, đặc biệt thử nghiệm định lượng, có nhiều yếu tố sai số ảnh hưởng tới thử nghiệm, dẫn tới không xác kết Do đó, để kiểm sốt yếu tố gây nhiễu này, cần thiết sử dụng khái 61 niệm độ chụm Độ chụm mô tả kết phụ thuộc vào yếu tố sai số ngẫu nhiên mà không liên quan đến kết thực mẫu Độ chụm thấp độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên lớn, ngược lại, độ chụm lớn hệ số biến thiên nhỏ Độ chụm tính tốn dựa thơng số: độ lặp lại, độ chụm trung gian độ tái lập Để tính thơng số thiết kế thực điều kiện khác Trong khuôn khổ nghiên cứu này, tiến hành thực nghiệm tính độ lặp lại độ chụm trung gian Do khơng có phòng thí nghiệm tương đương nên khơng thể tiến hành tính tốn độ tái lập Trong nghiên cứu này, xét nghiệm fructose chúng tơi có độ lặp lại với hệ số biến thiên CV% = 1,407 %, xét nghiệm kẽm có hệ số biến thiên thấp với CV% = 0,27 % Như vậy, hệ số biến thiên có giá trị khơng vượt q 5%, nói lên quy trình có độ lặp lại đạt u cầu phép phân tích Khi tính tốn độ chụm trung gian, thu hệ số biến thiên với xét nghiệm fructose CV% = 2,032%; xét nghiệm kẽm CV% = 0,64% Hệ số biến thiên có giá trị khơng vượt 5% Và vậy, quy trình đạt u cầu phép phân tích Như vậy, có tác động yếu tố sai số ngẫu nhiên, với mẫu, nồng độ đo điều kiện khác có sai số khoảng chấp nhận 4.2.1.2 Khảo sát độ Độ phương pháp cho thấy mức độ gần kết thu giá trị thực giá trị chấp nhận (µ) Với thực nghiệm kiểm định độ đúng, kết thu ttn = 0,906 xét nghiệm fructose ttn = 2,076 xét nghiệm kẽm Đồng thời tra bảng, giá trị t c thu 2,262 Như ttn < tc, điều đồng nghĩa với việc nồng độ fructose/ kẽm đo từ phương pháp 62 có kết giống với nồng độ thực mẫu Quy trình đạt độ theo u cầu phép phân tích Tóm lại, xét nghiệm chúng tơi có độ xác đạt yêu cầu phép phân tích 4.2.2 Đánh giá tương đương xét nghiệm tự pha kit thương mại Để chắn độ xác kit tự pha chế, tiếp tục thực nghiệm so sánh kết định lượng xét nghiệm tự pha với kit thương mại đạt chuẩn 4.2.2.1 Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu Độ nhạy độ đặc hiệu hai đại lượng thống kê phản ánh độ xác xét nghiệm Một xét nghiệm tốt cần có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có nghĩa sinh phẩm có kết dương tính giả âm tính giả thấp Đây hai tiêu chí quan trọng đánh giá chất lượng xét nghiệm Bộ xét nghiệm fructose đạt độ đặc hiệu 98,90%, độ nhạy 99,52% Bộ xét nghiệm kẽm có độ đặc hiệu cao xét nghiệm fructose đạt 100 % độ nhạy thấp đạt 99,05 % Độ nhạy độ đặc hiệu hai xét nghiệm cao 90 % sử dụng hai xét nghiệm để định lượng fructose kẽm tinh dịch với độ tin cậy cao 4.2.2.2 Đánh giá tương đương Sử dụng phương pháp Bland - Atman với xây dựng biểu đồ cơng cụ tính tốn đơn giản phương pháp hữu hiệu để đánh giá tương đương hai phương pháp đo lường, đặc biệt kiểm định phương pháp đo lường thay phương pháp đo lường chuẩn cơng nhận trước Quy trình định lượng fructose kẽm tinh dịch 63 xét nghiệm tự pha cho kết tương đương với kít thương mại kiểm định phương pháp xây dựng biểu đồ Bland - Atman Điều chứng tỏ giá trị tương đương xét nghiệm tự pha với quy trình đơn giản, giá thành thấp để thay cho kit thương mại phòng xét nghiệm Đối với xét nghiệm fructose, kết cho thấy có tương quan ý nghĩa phương pháp (r=0,990; p