Khảo sát giá trị của xét nghiệm định danh vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn mắt dựa trên đoạn GEN 16s rDNA

Nội dung của bài viết trình bày về phương pháp nuôi cấy thông thường trong nhiễm khuẩn mắt và phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở bệnh phẩm mắt. Kết quả nghiên cứu cho thấy, giải trình tự đoạn gen 16s rDNA là phương pháp phù hợp để phát hiện và định danh vi khuẩn ở mắt nhiễm trùng.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN MẮT DỰA TRÊN ĐOẠN GEN 16s rDNA Lê Xuân Trường*, Nguyễn Vũ Uyên** TĨMTẮT Đặt vấn đề: Phương pháp ni cấy thơng thường nhiễm khuẩn mắt thường cho kết dương tính thấp thời gian trả kết lâu Để rút ngắn thời gian trả kết có kết dương tính cao, gần người ta nói đến kỹ thuật định danh vi khuẩn dựa đoạn gen 16s rDNA sinh học phân tử Để đánh giá kỹ thuật trên, tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm phát triển phương pháp định danh vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử bệnh phẩm mắt Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân có định ni cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ Bệnh viện Mắt thành phố Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang Trong 72 bệnh nhân nghiên cứu, tăm vô trùng dùng để lấy mẫu sau cấy vào dung dịch BHI từ 24 – 48 Dung dịch BHI sau song song định danh xét nghiệm nuôi cấy thông thường giải trình tự đoạn gen 16s rDNA Kết giải trình tự so sánh ngân hàng gen NCBI để định danh vi khuẩn Cuối so sánh kết ni cấy giải trình tự đoạn gen 16s rDNA Kết quả: Trong tổng số 72 mẫu làm xét nghiệm, có 39 mẫu dương tính với kỹ thuật PCR, 32 mẫu dương tính với phương pháp ni cấy thơng thường Ni cấy dương tính với vi khuẩn: Acineto bacter baumannii (n=2), Pseudomonas (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase âm (n=2), Staphylococci coagulase âm kháng methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2) Nói chung, có 39/72 mẫu (chiếm 45,2 %) cho kết 16s rDNA dương tính, có 32/72 mẫu (tức 44,4%) ni cấy dương tính Khơng có mẫu ni cấy dương tính cho kết định danh 16s rDNA âm tính Kết luận: Giải trình tự đoạn gen 16s rDNA phương pháp phù hợp để phát định danh vi khuẩn mắt nhiễm trùng Xét nghiệm cho kết nhanh phát vi khuẩn không phát phương pháp nuôi cấy thơng thường Từ khóa: kỹ thuật PCR, DNA, định danh vi khuẩn ABSTRACT SURVEY VALUE TEST FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA BASED ON GENE OF 16S rDNA IN INFECTION EYES Le Xuan Truong, Nguyen Vu Uyen * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 77 - 80 Background: Conventional culture method for eye infection specimens often results in low positive and lasting results time pay To shorten the duration of high culture as well as positive results are high, we mention about modern techniques in molecular biology To evaluate the new technique, we conducted this research topic to develop methods of bacterial identification by molecular biology techniques in eye swabs, this new method will result in faster than culture * Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM ** Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Mắt TPHCM Tác giả liên lạc: TS BS Lê Xuân Trường ĐT: 01269872057 Email: lxtruong57@yahoo.com Mắt 77 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Material and method: Patients indicated bacterial culture and antimicrobial susceptibility at Eye Hospital of Ho Chi Minh City from 02/09/2013 - 30/09/2013 Cross-sectional descriptive study From 72 patients in survey, swabs were taken and cultured in BHI for 24 – 48 hours After that, we parallel identify bacteria by both culture and sequencing 16s rDNA Sequences were compared with sequences of known bacteria listed in the NCBI data bank Finally, the results were compared with results obtained from conventional cultivation Results: In 72 specimens, there are 39 specimens gave positive for PCR technique, 32 specimens gave positive conventional culture Culture was only positive for: Acineto bacter baumannii (n=2), Pseudomonas (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=2), Staphylococci coagulase negative (n=2), Staphylococci coagulase negative resist methicillin (n=20), Staphylococcus aureus (n=2) In total, 45.2 % (39/72) analyzed specimens have 16s rDNA positive, whereas only 44.4% (32/72) were culture positive No specimen positive by culture gave negative results by 16s rDNA Conclusions: 16S rDNA sequence analyses are appropriated methods for the detection and identification ocular infections of bacteria that might not be detected by conventional cultivation and this PCR test gave quicker result Keyword: PCR technique, DNA, identify bacteria ĐẶT VẤNĐỀ Các bệnh lý nhiễm trùng mắt bệnh lý thường gặp Nhãn khoa, định danh vi khuẩn vô cần thiết giúp chẩn đoán điều trị, việc định danh vi khuẩn khơng phải dễ dàng số vi khuẩn tăng trưởng môi trường nuôi cấy đặc biệt Hơn nữa, lượng bệnh phẩm từ mắt thường nên ni cấy cho kết dương tính thấp thời gian ni cấy lâu từ 3-4 ngày Để giải khó khăn trên, ứng dụng kỹ thuật vào việc định danh vi khuẩn Nhãn khoa cách giải mã trình tự đoạn gen 16s rDNA với kỹ thuật PCR Tại Việt Nam có nghiên cứu VMNN (viêm mủ nội nhãn) Bệnh viện Mắt Trung Ương “Ứng dụng PCR giải trình tự chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ nội nhãn nội sinh vi khuẩn”(1), nhiễm trùng Mắt có tác giả Nguyễn Thị Bình Minh, Phùng Thị Tục thuộc bệnh viện tỉnh Hà Tây thực nghiên cứu “Nhận xét 84 trường hợp viêm loét giác mạc điều trị Khoa Mắt bệnh viện tỉnh Hà Tây ”(3) tác giả Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân thực nghiên cứu “Viêm loét giác mạc 78 nhiễm trùng bệnh viện Mắt Trung Ương đặc điểm lâm sàng vi sinh”(5) Các nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử vào trường hợp VMNN mà chưa có nghiên cứu khả ứng dụng xét nghiệm 16s rDNA vào bệnh nhiễm trùng Mắt chúng tơi thực nghiên cứu ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng Tất bệnh nhân có định nuôi cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ bệnh viện Mắt TP.Hồ Chí Minh từ 02/9/2013 – 30/9/2013 Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu thuận tiện mẫu xét nghiệm định nuôi cấy làm kháng sinh đồ, bao gồm mẫu nuôi cấy dương tính âm tính Mẫu xét nghiệm lấy tăm vô trùng hay dịch mủ nội nhãn đem nuôi cấy dung dịch BHI qua đêm Sau 24 – 48 dung dịch BHI cấy chuyển lên thạch, mẫu dung dịch BHI lại làm xét nghiệm 16s rDNA dù vi khuẩn có mọc hay không Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Bảng So sánh tỷ lệ dương tính nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN Bảng So sánh kết dương tính xét nghiệm Dương tính 32 (44,4%) 39 (54,2%) Nuôi cấy 16s rDNA (2) Ấn Độ (4) Đại Học Y Vienna, Áo Chúng Bảng So sánh xét nghiệm 16s rDNA dương 16s rDNA âm Tổng cộng Nuôi cấy dương 32 32 Nuôi cấy âm 33 40 Tổng cộng 39 33 72 Độ nhạy xét nghiệm 16s rDNA Ss = 32/32 = 100 % Bảng Kiểm định McNemar Nuôi cấy P Dương tính n Âm tính n Dương tính n 32 16 s rDNA 0,015 Âm tính n 33 Kiểm định McNemar với p = 0,015 cho thấy có khác biệt xét nghiệm Bảng Thống kê mẫu dương tính định danh nuôi cấy Tên Acineto bacter baumannii Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa Staphylococci coagulase âm Staphylococci coagulase âm kháng methicillin Staphylococcus aureus Tổng cộng Số lượng 2 Tỷ lệ (%) 6,25 12,5 6,25 6,25 20 62,5 32 6,25 100 Bảng 5: Thống kê mẫu dương tính định danh 16s rDNA Tên Acineto bacter calcoacetius Bacillus cereus Bulkhoderia cenocepacia Corynebacterium sp Kocuria sp Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas otitidis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus heamolyticus Staphylococcus hominis Streptococcus intermedius Streptococus mitis Streptococus oralis Tổng cộng Mắt Nghiên cứu Y học Số lượng Tỷ lệ (%) 2,56 2,56 2,56 2,56 2,56 12,83 5,14 5,14 18 46,16 7,69 2,56 2,56 2,56 2,56 39 100 % Sinh học phân % Ni cấy tử dương tính dương tính 31,6% 22% 45% 22% 54,2% 44.4% Theo nghiên cứu trường Đại Học Y Vienna, Áo(4), tỷ lệ dương tính PCR 45% ni cấy dương tính có 22% Kết xét nghiệm 16s rDNA nghiên cứu 54,2% nuôi cấy 44,4% phù hợp với thống kê bệnh viện Mắt hàng tháng tỷ lệ ni cấy dương tính, kết nghiên cứu chúng tơi khác biệt phân bố mẫu nghiên cứu vi khuẩn nấm có khác biệt, nghiên cứu Ấn Độ(2) có 48 mẫu vi khuẩn 66 mẫu nấm Nói chung nghiên cứu cho thấy khả định danh vi khuẩn tốt kỹ thuật sinh học phân tử so với phương pháp ni cấy cổ điển có khả phát trường hợp âm tính giả nuôi cấy hạn chế kỹ thuật Các mẫu ni cấy âm tính cho 16s rDNA dương tính, có số loại vi khuẩn khơng phát nuôi cấy như: Bacillus cereus, Corynebacterium sp., Kocuria sp., số lượng khơng nhiều góp phần giúp khơng bỏ sót chẩn đốn hỗ trợ điều trị KẾT LUẬN Xét nghiệm 16s r DNA cho tỷ lệ dương tính 54,2% cao kết ni cấy có 44,4% Kỹ thuật sinh học phân tử 16s rDNA cơng cụ hữu ích giúp hỗ trợ chẩn đoán điều trị bệnh lý nhiễm trùng mắt Đây xét nghiệm với độ nhạy cao 100% Các mẫu nuôi cấy âm tính 16s rDNA dương tính góp phần giúp khơng bỏ sót chẩn đốn hỗ trợ điều trị TÀI LIỆU THAMKHẢO Bệnh viện Mắt Trung Ương (2009) “Ứng dụng PCR giải trình tự chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ nội nhãn nội sinh vi khuẩn”, http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/ung-dung-pcr- 79 Nghiên cứu Y học 80 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 va-giai-trinh-tu-trong-chan-doan-dinh-danh-nguyen-nhanviem-mu-noi-nhan-noi-sinh-do-vi khuan/5177.yhoc Kim E, Chidambaram JD, Srinivasan M, Lalitha P, Wee D, Lietman TM, Whitcher JP, Van Gelder RN (2008) “Prospective comparison of microbial culture and polymerase chain reaction in the diagnosis of corneal ulcer” Am J Ophthalmol, 146 (5): 714-23;723 e1 Nguyễn Thị Bình Minh, Phùng Thị Tục (2000) “Nhận xét 84 trường hợp viêm loét giác mạc điều trị Khoa Mắt bệnh viện tỉnh Hà Tây (1999-2000)”, bệnh viện Mắt Trung Ương, http://www.vnio.vn/Cac-so-TCNK-Cong-trinh-nghien-cuuTCNK-so-2/nhn-xet-84-trng-hp-viem-loet-giac-mc-iu-tr-tikhoa-mt-bnh-vin-tnh-ha-tay-1999-2000.html, Schabereiter-Gurtnerm C, et al (2001) “16S-rDNA-based identification of bacteria from conjunctival swabs by PCR and DGGE fingerprinting” Invest Ophthalmol Vis Sci, 42 (6), 1164-71 Vũ Hoàng Việt Chi, Phạm Thị Khánh Vân (2011) “Viêm loét giác mạc nhiễm trùng bệnh viện Mắt Trung Ương đặc điểm lâm sàng vi sinh”, http://thaythuocvietnam.com.vn/Viem-loat-giac-mac-nhiemtrung-tai-Benh-vien-Mat-Trung-Uong-dac-diem-lam-sang-vavi-sinh-di1239 n7597 Ngày nhận báo:01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét báo:26/11/2013 Ngày báo đăng: 05/01/2014 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt ... VẤNĐỀ Các bệnh lý nhiễm trùng mắt bệnh lý thường gặp Nhãn khoa, định danh vi khuẩn vô cần thiết giúp chẩn đoán điều trị, vi c định danh vi khuẩn khơng phải dễ dàng số vi khuẩn tăng trưởng môi trường... khả ứng dụng xét nghiệm 16s rDNA vào bệnh nhiễm trùng Mắt thực nghiên cứu ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng Tất bệnh nhân có định ni cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ bệnh vi n Mắt TP.Hồ Chí... sinh vi khuẩn (1), nhiễm trùng Mắt có tác giả Nguyễn Thị Bình Minh, Phùng Thị Tục thuộc bệnh vi n tỉnh Hà Tây thực nghiên cứu “Nhận xét 84 trường hợp vi m loét giác mạc điều trị Khoa Mắt bệnh vi n