Đang tải... (xem toàn văn)
KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TÍCChuẩn bịmột công đoạn cho phương pháp khác: thu hồi DNA, phân tách DNA Kiểu điện di: điện di agarose, điện di polyacrylamide, điện di trên điện trường xung, điện di mao quảnH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email ntmnuonghcmus edu vn Nội dung1 Điện di Mục tiêu + Định tính sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước.
PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn Điện di: Nội dung - Mục tiêu: + Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước + Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng + Chuẩn bị/một công đoạn cho phương pháp khác: thu hồi DNA, phân tách DNA - Kiểu điện di: điện di agarose, điện di polyacrylamide, điện di điện trường xung, điện di mao quản Đo quang phổ: - Mục tiêu: + Định lượng tuyệt đối: nồng độ nucleic acid + Định tính: độ tinh mẫu, tính chất nucleic acid - Kiểu đo quang phổ: UV, huỳnh quang Điện di Điện di ngang Điện di đứng ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE - Điện di theo phương nằm ngang - Giá thể gel agarose - Phát với màu nhuộm ethidium bromide, … phát huỳnh quang đèn tử ngoại - Khả phân giải trung bình, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt nồng độ agarose (0,5 – 5%) ĐIỆN DI TRONG TRƯỜNG XUNG (PULSED-FIELD ELECTROPHORESIS) - Tương tự điện di gel agarose - Điện trường theo nhiều phương - Dùng phân tách DNA kích thước lớn: 50.000 – 250.000 bp ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PAGE) - Điện di theo phương thẳng đứng - Giá thể gel polyacrylamide - Phát với màu nhuộm Coomassie blue, nhuộm bạc, phát phim tín hiệu đồng vị phóng xạ - Khả phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide Điện di protein SDS-PAGE Phân tách dựa vào trọng lượng phân tử CÁC BƯỚC CHÍNH Trước bắt đầu, cần xác định: - Mục tiêu => thiết kế thí nghiệm, chọn phương pháp - Kích thước protein mục tiêu => nồng độ gel, thang điện di - Số lượng mẫu cần phân tích => khn, số giếng - Đặc tính mẫu: điều kiện hòa tan, cấu trúc, nồng độ => xử lý mẫu phù hợp Chuẩn bị gel Điện di Nhuộm: comassive/bạc Chụp ảnh phân tích Kết ví dụ 15kDa 10kDa 11 kDa Chú thích: 1: Thang 2: E.coli không cảm ứng biểu Sap-2 3: E.coli biểu Sap-2 – pha tổng 4: E.coli biểu Sap-2 – pha tan 5: Sap-2 sau tinh – phân đoạn 6: E.coli biểu Sap-2 – pha tủa 7: Dịch Sap-2 qua cột (những thành phần không bám cột khơng có gắn His) 8: Sap -2 sau tính – phân đoạn Điện di chiều protein gel polyacrylamide (2D PAGE) Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis ) - Điện di ống mao quản - Mẫu nucleic acid đánh dấu huỳnh quang => phát hệ thống phát thu tín hiệu huỳnh quang - Độ nhạy cao, nhanh, tốn cơng, chạy nhiều mẫu lúc, tự động hóa Kết ví dụ 13 Đo quang phổ Đo độ hấp thu bước sóng 260 nm NanoDrop Đo huỳnh quang Qubit fluorometer Agilent 2100 BioAnalyzer KỸ THUẬT RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM – ĐA HÌNH KÍCH THƯỚC CÁC TRÌNH TỰ CẮT GIỚI HẠN 16 VNTR (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS) Phân tích VNTR để nhận biết tính đa hình di truyền cá thể Sử dụng mẫu dò kết hợp với RE để phân tích VNTR 17 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ Ví dụ việc sử dụng PCR điện di xác định phả hệ Đây phả hệ Sa hoàng, vợ, con, bác só gia đình người hầu 18 KỸ THUẬT “ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY : PHÁT HIỆN NHÂN TỐ TRANS Các phân đọan protein ủ với đoạn DNA đánh dấu phóng xạ có mang trình tự CIS Các tổ hợp sau phân tích điện di không biến tính (đối với protein) Các phân đọan DNA không gắn protein di chuyển xa phân đọan trình tự CIS liên kết với protein (7, hình) Như phân đọan protein tương ứng với tổ hợp xác định 19 CÂU HỎI - PHẦN Các điểm khác biệt phương pháp tiến hành điện di gel agarose gel polyacrylamide Các ứng dụng điện di gel agarose, điện di gel polyacrylamide Phương pháp đo mật độ quang (OD) : - Nguyên lý cách xác định hàm lượng nucleic acid - Nguyên lý cách xác định độ nucleic acid Nguyên lý cách tiến hành phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Nguyên lý cách tiến hành phương pháp VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Nguyên lý cách tiến hành phương pháp Electrophoretic Mobility Shift Assay 20 ... trường xung, điện di mao quản Đo quang phổ: - Mục tiêu: + Định lượng tuyệt đối: nồng độ nucleic acid + Định tính: độ tinh mẫu, tính chất nucleic acid - Kiểu đo quang phổ: UV, huỳnh quang Điện di Điện... - Mục tiêu: + Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước + Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng + Chuẩn bị/một công đoạn cho phương pháp khác: thu hồi DNA, phân tách DNA... đồng vị phóng xạ - Khả phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide Điện di protein SDS-PAGE Phân tách dựa vào trọng lượng phân tử CÁC BƯỚC CHÍNH Trước bắt đầu, cần xác định: - Mục tiêu =>