Luật dược đã đặt ra có đủ thuốc bảo đảm chất lượng và giá thuốc hợp lý phục vụ cho nhu cầu cấp cứu, khám bệnh, chữa bệnh và phũng bệnh cú hiệu quả, góp phần bình ổn giá thuốc trên thị trường và bảo đảm cho người dân được thụ hưởng một dịch vụ y tế công b

Trong số các kỹ thuật này, phương pháp quang phổ đạo hàm và đạo hàm tỉ đối được biết đến với ưu điểm nổi bật cho phép định lượng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.VŨ ĐẶNG HOÀNGAA

TS LÊ THỊ HỒNG HẢO A

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ dược học, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đặng Hoàng người thầy kính mến đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Thị Hồng Hảo - Viện Phó Viện Vệ

Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Hóa

Phân Tích đã hết giúp quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực

hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học,

và các thầy cô giáo trường Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội đã giảng dạy và tạo

điều kiện tốt nhất cho quá trình học tập và nghiên cứu của tôi tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người bạn đã luôn sát cánh, động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu, những người đã luôn ở bên cạnh tôi trong suốt cuộc đời

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Vũ Tùng Lâm

MỤC LỤC

Trang bìa

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH 3

1.1.1 Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin 3

1.1.2 Đặc điểm dược động học và độc tính của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin [5] 4

1.1.2.2 Cloxacilin [5] 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 6

1.2.1 Các phương pháp định lượng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm6 1.2.2 Kết luận về các phương pháp phân tích tham khảo 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM (Derivative spectrophotometry) 7

1.3.1 Khái niệm 7

1.3.2 Các phương pháp định lượng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ đạo hàm 15

1.3.3 Phương pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative spectrophotometry) 16

1.3.4 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ số phổ (Ratio Spectra Derivative Spectrophotometry) 17

1.3.5 Ứng dụng quang phổ đạo hàm trong định lượng thuốc đa thành phần ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

2.3.1 Xây đựng phương pháp định lượng đồng thời AMO và CLO bằng các phương pháp quang phổ UV-VIS và sắc ký lỏng hiệu năng cao 23

2.3.2 Ứng dụng để định lượng đồng thời AMO và CLO trong viên nang Faclacin 2 24

2.3.3 Xử lý kết quả thực nghiệm [3] 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMO VÀ CLO 25

3.1.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 25

3.1.2 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Amo và Clo 26

3.1.3 Độ lặp của phương pháp 34

3.1.4 Độ đúng của các phương pháp 36

3.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 37

3.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 37

3.2.2 Kiểm tra lại phương pháp sắc ký lỏng áp dụng tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung ương 1 37

3.2.3 Khảo sát tính tích hợp của hệ thống 41

3.2.4 Khảo sát độ lặp của phương pháp 42

3.2.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp 43

3.3 KẾT QUẢ PHÉP ĐỊNH LƯỢNG 44

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

VKNTW : Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và

CLOXACILLIN NATRI 3

Bảng 1.2 Ứng dụng quang phổ đạo hàm ở Việt Nam từ năm 1990 đến nay 20

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO 32

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO 33

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của các phương pháp quang phổ UV-VIS 34

Bảng 3.6 Độ lặp của các phương pháp quang phổ UV-VIS 35

Bảng 3.7 Kết quả định lượng hỗn hợp mẫu tự tạo AMO 100mg/L và CLO 100mg/L bằng các phương pháp quang phổ 36

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO 100mg/L 38

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO 100 mg/L 39

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ của AMO và CLO 40

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 41

Bảng 3.12 Độ lặp của phương pháp HPLC 42

Bảng 3.13 Kết quả định lượng hỗn hợp mẫu tự tạo bằng phương pháp HPLC 43

Bảng 3.14 Kết quả định lượng AMO trong viên nang FACLACIN 2 44

Bảng 3.15 Kết quả định lượng CLO trong viên nang FACLACIN 2 45

Danh môc c¸c h×nh

Hình 1.1 Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss 9

Hình 1.2 Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ của 2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhưng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của trans – stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tương ứng 10Hình 1.3 Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1 [ 11Hình 1.4 Phân biệt các dải phổ bằng phép toán đạo hàm 12Hình 1.5 Phương pháp peak – zero (zn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích) 13

Hình 1.6 Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml (đường nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đường nét đứt) trong methanol Mũi tên chỉ bước sóng định lượng 16

Hình 1.7 (a) Phổ tỷ số phổ của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) (b) Phổ đạo hàm tỷ số phổ bậc 1 của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon)

là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) 18

Hình 3.8 Phổ hấp thụ của dung dịch AMO 100 mg/L, CLO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L 26Hình 3.9 PĐH bậc nhất của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) 28Hình 3.10 PĐH bậc 2 của dung dịch CLO nồng độ (60 – 140 mg/L) 29Hình 3.11 PĐHTĐ của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) với số chia CLO 60 mg/L 30

Hình 3.12 PĐHTĐ của dung dịch CLO nồng độ (60-140 mg/L) với số chia AMO

60 mg/L 31

Hình 3.13 Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bước sóng 258,7 nm 32

Hình 3.14 Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bước sóng 258 nm 33

Hình 3.15 Sắc kí đồ tách 2 chất AMO 100 mg và CLO 100 mg 38

Hình 3.16 Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L 39

Hình 3.17 Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L 40

MỞ ĐẦU

Kháng sinh là nhóm thuốc được sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam do mô hình bệnh tật của nước ta chủ yếu vẫn là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm ký sinh trùng và nhiễm nấm Do sự kháng thuốc của vi khuẩn và tính phức tạp của các bệnh nhiễm khuẩn ngày càng gia tăng, việc sử dụng kháng sinh đơn thành phần trong nhiều trường hợp không còn đáp ứng được yêu cầu điều trị Nhìn vào các đơn thuốc được

kê hiện nay, phổ biến có đến 2-3 loại kháng sinh được sử dụng cùng lúc để tăng hiệu quả trong điều trị Mặc dù vậy, việc phối hợp kháng sinh này có thể gặp phải một số tương tác bất lợi gây ra những tai biến đáng tiếc và hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc hết sức nguy hiểm

Amoxicillin và Cloxacillin là 2 kháng sinh thuộc nhóm Penicillin được sử dụng phổ biến hiện nay Amoxicillin bền vững với dịch vị có khả năng hấp thu qua đường tiêu hoá tốt nên kháng sinh nhóm Penicillin có hoạt phổ rộng này hay được

sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân Cloxacillin có tác dụng kháng penicillinase nên được chỉ định trong các bệnh do vi khuẩn gram dương tiết ra penicillinase nhất là các liên cầu khuẩn [1] Để nâng cao hiệu quả điều trị cũng như tạo điều kiện cho việc sử dụng thuốc thuận tiện, sự kết hợp Amoxicillin trihydrate

và Cloxacillin Natri trong cùng một chế phẩm đã và đang được chỉ định cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, sinh dục tiết niệu, da và mô mềm, điều trị cấp cứu các nhiễm khuẩn có nguy cơ cao khi chờ đợi kết quả kháng sinh đồ

Tuy các thuốc có chứa đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin đang lưu hành rộng rãi trên thị trường dưới dạng viên nang nhưng cho tới nay Dược điển Việt Nam vẫn chưa có chuyên luận riêng nào cho dạng chế phẩm này Việc định lượng Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa vào các công trình nghiên cứu đã biết [2, 4, 21,

đồng thời các chất trong hỗn hợp với tính chọn lọc, độ nhạy, độ đúng và độ lặp cao; đặc biệt với khả năng tích hợp nhiều loại detector khác nhau như UV-VIS, khối phổ, huỳnh quang, điện hóa, HPLC cho phép phân tích được hầu hết các dược chất Tuy nhiên, khi số lượng mẫu lớn kỹ thuật này thường đòi hỏi chi phí tốn kém (trang thiết bị, dung môi hóa chất) và thời gian phân tích kéo dài

Ngày nay với sự hỗ trợ của công nghệ tin học, các kỹ thuật quang phổ được ứng dụng nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc Trong số các kỹ thuật này, phương pháp quang phổ đạo hàm và đạo hàm tỉ đối được biết đến với ưu điểm nổi bật cho phép định lượng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiết hoặc tinh chế đối với hỗn hợp đa thành phần, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí [18, 22, 26] Do vậy, nghiên cứu ứng dụng quang phổ để định lượng đồng thời các hoạt chất trong hỗn hợp đa thành phần sẽ góp phần giảm sự phụ thuộc vào HPLC trong kiểm nghiệm thường qui Cho tới nay, đây là hướng nghiên cứu còn ít được phát triển ở Việt Nam

Với mong muốn đề xuất một phương pháp định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần có khả năng ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài “Định lượng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang Faclacin 2 bằng phương pháp phổ đạo hàm” với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Amoxicillin và Cloxacillin bằng các phương pháp quang phổ tử ngoại lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm phương pháp đối chiếu

2 Ứng dụng các phương pháp này để định lượng Amoxicillin và Cloxacillin trong một số lô của chế phẩm Faclacin 2 của Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung Ương I - Pharbaco

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH

1.1.1 Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin

Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicilin trihydrat và Cloxacillin được tóm tắt trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và

tan trong ether, cloroform, dầu; tan

trong các dung dịch acid hoặc

Bột kết tinh màu trắng, hoặc gần trắng, có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm

Dễ tan trong nước, methanol Tan trong ethanol Không tan trong ethylacetat

pH (dung dịch nước) = 5,0  7,0

[2,4]

AMOXICILLIN TRIHYDRAT CLOXACILLIN NATRI TL

TK amin)

Bị phân huỷ ở độ ẩm cao và nhiệt độ

mg, nồng độ amoxicilin đạt khoảng 8 - 10 microgam/ml Tăng liều gấp đôi có thể làm nồng độ thuốc trong máu tăng gấp đôi Amoxicilin uống hay tiêm đều cho những nồng độ thuốc như nhau trong huyết tương Nửa đời của amoxicilin khoảng 61,3 phút, dài hơn ở trẻ sơ sinh, và người cao tuổi ở người suy thận, nửa đời của thuốc dài khoảng 7 - 20 giờ

- Khoảng 60% liều uống amoxicilin thải nguyên dạng ra nước tiểu trong vòng 6 - 8 giờ Probenecid kéo dài thời gian thải của amoxicilin qua đường thận Amoxicilin có nồng độ cao trong dịch mật và một phần thải qua phân

b Tính độc tính của Amoxicilin

- Bệnh nhân được điều trị bằng Amoxicillin có thể gặp các hiện tượng như các phản ứng quá mẫn trầm trọng ở những người bệnh có tiền sử dị ứng với penicilin hoặc các dị nguyên khác, nên cần phải điều tra kỹ tiền sử dị ứng với penicilin, cephalosporin và các dị nguyên khác

- Nếu phản ứng dị ứng xảy ra như ban đỏ, phù Quincke, sốc phản vệ, hội chứng Stevens - Johnson, phải ngừng liệu pháp amoxicilin và ngay lập tức điều trị cấp cứu bằng adrenalin, thở oxy, liệu pháp corticoid tiêm tĩnh mạch và thông khí, kể

cả đặt nội khí quản và không bao giờ được điều trị bằng penicilin hoặc cephalosporin nữa

1.1.2.2 Cloxacilin [5]

a Dược động học của Cloxacilin

- Cloxacilin là kháng sinh diệt khuẩn, ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn như benzylpenicilin, nhưng kháng penicilinase của Staphylococcus Vì vậy thuốc có hoạt tính chống Staphylococcus sinh hoặc không sinh penicilinase với nồng độ tối thiểu ức chế khoảng 0,25 - 0,5 microgam/ml Nhưng cloxacilin không có hoạt tính với Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) do vi khuẩn này có những protein gắn penicilin (PBP) biến đổi Hoạt tính đối với Strepxococcus như Strepxococcus pneumoniae và Strepxococcus pyogenes thấp hơn benzylpenicilin, nhưng thường đủ tác dụng khi các vi khuẩn này cùng có mặt với Staphylococcus kháng penicilin Cloxacilin không có hiệu lực với Enterococcus faecalis

b Tính độc tính của Cloxacilin

- Tác dụng không mong muốn thường gặp nhất là phản ứng quá mẫn, đặc biệt là ban da, đôi khi có phản vệ Người suy thận cũng có nguy cơ cao.Tác dụng không mong muốn thường xảy ra là phát ban (khoảng 4% người bệnh tiêm cloxacilin) Ðối với người bệnh uống cloxacilin, các tác dụng không mong muốn

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.2.1 Các phương pháp định lượng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm

Để định lượng Amoxicillin và Cloxacillin trong các chế phẩm đơn thành phần, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được sử dụng hiện nay tại Việt Nam Theo qui định của các dược điển quốc tế, các hoạt chất này được tách ra khỏi nền mẫu bằng cột pha đảo cột C18 và phát hiện bằng detector tử ngoại tại bước sóng 254 nm (cho amoxicillin) và 225 nm (cho cloxacillin) [8, 19, 20] Để định lượng amoxicillin, thành phần pha động được sử dụng gồm có MeOH: dd NaCH3COO 0,01M (5:95) [31], acetonitril: dd KH2PO4 45% w/w (4:96) [31]; hoặc acetonitril: dd KH2PO4 0,05M pH 5,0 (1:99) [22] Để định lượng cloxacillin, thành phần pha động được sử dụng gồm có acetonitril: dd KH2PO4 0.05 M pH 5,0 (1:96) [29], acetonitril: dd KH2PO4 0,02M pH 6,8 (20:80) [31]; hoặc acetonitril: dd

KH2PO4 2,7 g/L, pH 5,0 (25:75) [22]

Ngoài ra, có thể định lượng amoxicillin trong chế phẩm bằng phép chuẩn độ

đo thế Theo phương pháp này, hàm lượng phần trăm của amoxicillin được tính bằng hàm lượng phần trăm của penicillin toàn phần trừ đi hàm lượng phần trăm của sản phẩm phân huỷ Chế phẩm được hòa tan vào dung dịch đệm boric pH 9,0 và anhydrid acetic, trước khi tiến hành phản ứng thuỷ phân trong môi trường kiềm và chuẩn độ bằng bằng Hg(NO)2 0,02M trong môi trường đệm acetate pH 4,6 Điểm kết thúc của chuẩn độ đo thế được xác định với điện cực so sánh là điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulfat; điện cực chỉ thị là điện cực platin (hoặc điện cực thuỷ ngân) [2,4] Amoxicillin cũng có thể định lượng bằng phép đo iod sau phản ứng thủy phân trong môi trường kiểm Sản phẩm phân hủy của amoxicillin được phản ứng với iod dư Định lượng iod dư bằng NaS2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lượng [4]

Hàm lượng cloxacillin trong chế phẩm có thể định lượng bằng phương pháp

vi sinh dựa vào mối quan hệ đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử và mẫu chuẩn

tỷ lệ thuận với lượng cloxacillin tương ứng có trong mẫu Phương pháp này sử dụng chủng chỉ thị: Bacillus subtilis ATCC 6633 [30]

1.2.2 Kết luận về các phương pháp phân tích tham khảo

Qua phân tích tài liệu tham khảo, phương pháp HPLC thường được triển khai cho công tác kiểm nghiệm thường qui chế phẩm đơn thành phần amoxicillin và cloxacillin Cho tới nay, chưa có phương pháp nào được công bố để định lượng đồng thời amoxicillin và cloxacillin trong hỗn hợp Có thể nhận thấy, phương pháp HPLC thường dùng dung môi hữu cơ có độc tính là acetonitril; chi phí kiểm nghiệm thuốc sẽ tăng khi số lượng mẫu phân tích lớn Ngoài ra phương pháp này cũng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và thời gian phân tích mẫu kéo dài Do vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng một phương pháp quang phổ tiến kiệm dung môi hóa chất, thời gian phân tích có khả năng thay thế HPLC trong công tác kiểm nghiệm

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM (Derivative spectrophotometry)

1.3.1 Khái niệm

Quang phổ đạo hàm là kỹ thuật phân tích được Giese và French giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1955 [20] Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sử dụng thuật toán lấy đạo hàm phổ hấp thụ nhằm thu được nhiều hơn các thông tin định tính, định lượng đối với các dải phổ không được phân tách hoàn toàn Phép lấy đạo hàm một đường cong hay hàm toán học của đường cong về bản chất là sự ước lượng độ dốc tại mỗi điểm trên đường cong khảo sát

Trong phương pháp quang phổ UV-VIS, mối quan hệ giữa khả năng hấp thụ ánh sáng và nồng độ của một dung dịch được miêu tả qua biểu thức toán học của định luật Bouguer – Lambert – Beer:

Hình 1.1 Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss [3]

Hình 1.1 biểu diễn phổ hấp thụ và các phổ đạo hàm tương ứng của một dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss Theo tính chất của đạo hàm, ta có thể nhận thấy:

- Các cực trị ở đạo hàm bậc n sẽ có giá trị 0 tại đạo hàm bậc n + 1 còn các điểm uốn ở đạo hàm bậc n lại trở thành cực trị ở đạo hàm bậc kế tiếp Do đó, xuất phát từ 1 peak ban đầu sau n lần đạo hàm sẽ cho n cực trị mới được gọi là cực trị ảo (virtual extrema) hay các vệ tinh (satellites)

- Sự xuất hiện của các cực trị ảo này sẽ làm tăng khả năng phân tích phổ hấp thụ ban đầu Hình 1.2 minh họa cho sự chuyển dạng từ phổ UV – VIS sang phổ đạo hàm cho thấy thông tin thu được trên phổ đạo hàm nhiều hơn phổ hấp thụ ban đầu (số cực trị tăng khi số bậc đạo hàm tăng) có thể ứng dụng được trong phân tích định tính

Hình 1.2 Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ của

2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhưng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của trans – stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tương ứng [29]

- Khi tăng bậc đạo hàm, độ nhọn của các dải phổ tăng lên tuy nhiên tín hiệu đạo hàm giảm và độ rộng của các dải phổ thu hẹp lại Đáng chú ý, khi tăng n tỷ số tín hiệu – nhiễu (signal to noise ratio) lại giảm đặc biệt với các peak tù Chính vì vậy, để ứng dụng quang phổ đạo hàm trong phân tích, phải cân nhắc giữa thuận lợi

và khó khăn để lựa chọn được bậc đạo hàm thích hợp

Một trong những ưu điểm nổi bật của quang phổ đạo hàm là có thể loại bỏ được hiện tượng trôi nền gây bởi sự không ổn định của trang thiết bị hoặc thao tác

và giảm ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng khi các tiểu phân nhỏ xuất hiện trong mẫu, qua đó cải thiện độ chính xác của phép định lượng (hình 1.3) Khi bậc đạo hàm tăng, cường độ tín hiệu của các dải phổ rộng sẽ giảm nhiều so với các dải phổ hẹp

Do vậy việc định lượng các dải phổ hẹp sẽ chính xác hơn (hình 1.4) Điều này cũng được ứng dụng để giảm thiểu sai số trong trường hợp tán xạ ánh sáng hoặc nhiễu nền do tia sáng lạc gây ra đối với các mẫu đục

Hình 1.3 Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1

[25]

Hình 1.4 Phân biệt các dải phổ bằng phép toán đạo hàm

Phép định lượng bằng quang phổ đạo hàm có nguyên tắc chung là dựa vào mối quan hệ tuyến tính giữa biên độ tín hiệu đạo hàm và nồng độ chất phân tích Trong phép định lượng, vị trí chính xác của các cực trị trong phổ đạo hàm không có vai trò quan trọng nếu điều kiện xử lý số liệu được giữ không đổi Các tín hiệu thu được từ phổ đạo hàm thông thường được lượng giá theo phương pháp peak-zero (giá trị tuyệt đối của đạo hàm tại bước sóng đó chọn tính từ đỉnh peak đến trục hoành: hình 1.5)

Hình 1.5 Phương pháp peak – zero (zn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích)

Để thực hiện phép lấy đạo hàm, về mặt kỹ thuật các máy quang phổ có thể

áp dụng các phương pháp như hình học (graphical), điện cơ (mechanical-eletrical), quang học (optical), tín hiệu trễ (signal delay), thuật toán tương tự (analog computing) và thuật toán kỹ thuật số (digital computing) Tuy nhiên trên thực tế, phép lấy đạo hàm bằng kỹ thuật điện tử (analog differentiation) và kỹ thuật số (digital diffenrentiation) là hai phương pháp hiện còn được ứng dụng trong các máy quang phổ vì chúng có khả năng tạo ra các phổ đạo hàm bậc cao (n > 2) Để sử dụng thuật toán trong phép lấy đạo hàm, phổ hấp thụ phải được số hóa với khoảng chênh lệch về bước sóng ∆ Độ lớn của ∆ được lựa chọn tùy theo độ rộng của dải phổ được khảo sát và độ rộng khe sáng của máy quang phổ sử dụng [28] Trong số các thuật toán đạo hàm, hàm đa biến Savitzky-Golay được sử dụng phổ biến nhất để tạo ra tín hiệu đạo hàm của phổ hấp thụ và các đường cong thu được từ các nguồn tín hiệu khác nhau [19]

Nguyên tắc của thuật toán này là miêu tả một cửa số phổ có chứa 2n + 1

Một nhược điểm điển hình của phổ đạo hàm là tỉ số tín hiệu – nhiễu giảm đi đáng kể với phổ đạo hàm bậc cao Để khắc phục nhược điểm này, các máy quang phổ luôn được bố trí thiết bị lọc nhiễu tương tự (analog filtering) hoặc kỹ thuật số (digital filtering) Thuật toán Savitzky – Golay cũng được áp dụng để làm trơn phổ đạo hàm khi coi điểm trung tâm của đoạn đường cong được xây dựng theo hàm đa thức là điểm mới được làm trơn

Giá trị của điểm yk bất kỳ trên đường cong được làm trơn thành (yk)s bằng phương pháp Savitzky-Golay có thể biểu diễn bằng phương trình sau:

(8)

Trong đó: Ai là trọng số (weighting coefficient) hay số nguyên tích chập (convolution integer)

Độ rộng của dải phổ được làm trơn (N) sẽ trải dài từ giá trị của bước sóng k

– n đi qua k tới k + n Theo lý thuyết N có thể thay đổi từ 5 đến 25 (các số lẻ) Nếu

N càng lớn hiệu quả của phép làm trơn sẽ càng tăng (nhiễu giảm đi nhiều) tuy nhiên hỡnh dạng của phổ sẽ bị biến dạng Đáng chú ý, tỉ số tín hiệu – nhiễu được cải thiện không chỉ phụ thuộc vào bậc của đa thức, N mà còn phụ thuộc vào số lần làm trơn phổ

1.3.2 Các phương pháp định lượng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ đạo hàm

Vì phổ đạo hàm là kết quả của phép biến đổi từ phổ hấp thụ nên giá trị của phổ đạo hàm tại các bước sóng cũng có sự cộng tính như phổ hấp thụ của dung dịch

có nhiều thành phần với điều kiện tương tác giữa các thành phần này là không đáng

1.3.3 Phương pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative spectrophotometry)

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong việc ứng dụng quang phổ đạo hàm để định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Phương pháp này dựa trên nguyên tắc bước sóng được lựa chọn là bước sóng tại đó đạo hàm độ hấp thụ của một trong hai thành phần cần định lượng bằng 0 và thành phần còn lại khác 0 Với phương pháp này phổ đạo hàm được sử dụng thường có bậc một hoặc hai (hình 1.6)

Hình 1.6 Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml (đường nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đường nét

đứt) trong methanol Mũi tên chỉ bước sóng định lượng [32]

Nếu hỗn hợp có ba thành phần, phương pháp này đòi hỏi phải tìm được một bước sóng để đạo hàm độ hấp thụ của cả hai trong ba thành phần bằng 0 và thành phần còn lại khác 0 Công việc này không phải lúc nào cũng thực hiện được Vì vậy, khi định lượng ba thành phần người ta thường áp dụng phương pháp đạo hàm

Tại một bước sóng xác định, phổ đạo hàm tỷ số phổ chỉ phụ thuộc vào nồng

độ của chất và nồng độ của dung dịch chuẩn Vì nồng độ của dung dịch chuẩn đã biết nên có thể xác định được nồng độ của chất trong dung dịch tại một bước sóng được lựa chọn thích hợp (tín hiệu đạo hàm có giá trị khác 0) (hình

Hình 1.7 (a) Phổ tỷ số phổ của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) (b) Phổ đạo hàm tỷ số phổ bậc 1 của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon)

là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) [27]

1.3.5 Ứng dụng quang phổ đạo hàm trong định lượng thuốc đa thành phần ở Việt Nam

Ở Việt Nam, số lượng các công trình nghiên cứu ứng dụng phổ đạo hàm còn rất hạn chế nếu so với số các công trình được công bố trên thế giới được thống kê cho tới nay [12, 13, 14, 15, 17, 18] Bảng 1.4 thống kê các công trình được công bố

ở hai tạp chí Kiểm nghiệm thuốc và Dược học trong giai đoạn 1990 cho tới nay Đa

số các nghiên cứu sử dụng phổ đạo hàm bậc nhất [7, 14, 17, 8, 9, 11] và đạo hàm bậc nhất phổ tỷ đối [15, 10, 12] để định lượng các chế phẩm hai thành phần Có thể nhận thấy, định lượng lượng bằng quang phổ đạo hàm đều có qui trình xử lý mẫu đơn giản, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, tiết kiệm chi phí và thời gian, có độ đúng và độ lặp lại cao Tuy nhiên, phổ đồ và trình tự tối ưu hóa phép lấy đạo hàm được trình bày trong các bài báo này còn khá đơn giản Việc kiểm tra

sự cộng tính của ánh sáng trong vùng bước sóng khảo sát và ảnh hưởng của tá dược (so sánh phổ hấp thụ của chất chuẩn và chế phẩm ở cùng nồng độ) chưa thực sự được chú trọng Khác với phần lớn các nghiên cứu trên thế giới, so sánh độ đúng và

độ lặp của phép định lượng bằng quang phổ và HPLC bằng thống kê toán học chỉ được thực hiện ở một số nghiên cứu [8, 9] Đáng chú ý, các nghiên cứu trong nước hoàn toàn chưa khai thác được những phần mềm xử lý tín hiệu tiên tiến cho phép lấy đạo hàm và làm trơn phổ Đây có thể là một trong những lý do hạn chế việc ứng dụng phổ đạo hàm trong công tác kiểm nghiệm thuốc hiện nay

Bảng 1.2 Ứng dụng quang phổ đạo hàm ở Việt Nam từ năm 1990 đến nay

Acid benzoic (Bc) và acid

Phổ đạo hàm bậc 2 tại 282,7 (Bc) và 322

nm (Sc); trong thuốc mỡ

59,40 – 139,9 (Bc), 30 – 90 µg/ml (Sc)

[6]

Cafein và natri benzoat Phổ đạo hàm tỷ đối bậc 2 tại 220 nm (natri

benzoat) và 226 nm (cafein) trong thuốc tiêm

Phổ đạo hàm bậc 1 tại 306,7 (L) và 261,8

nm (P); trong viên nén

5 – 50 (L), 180 – 1000 (P)

Loratadin (L) và

Pseudoephedrin sulfat (P)

HCl 0,1N

Đạo hàm bậc 1 tại 261,2 (P) và 306,6 nm (L); trong nguyên liệu và viên nén

Phổ đạo hàm bậc 1 (1) tại 240,5 (P) và 262,3, 271,8 nm (S) ; trong viên nén

Đạo hàm tỷ đối bậc 1 tại 251 (S) và 245 nm (T) trong viên nén

10 – 60 (S), 2 – 12 (T) µg/ml

[12]

Vitamin B1 và vitamin B6

HCl 0,1N

Phổ đạo hàm bậc 1 (1) tại 254, 290,6 (B1);

226,5 và 247,2 nm (B6), phổ đạo hàm bậc 2 (2) tại 228,6, 239,2 (B1) và 258,0 nm

2,5 – 40 µg/ml (B1, B6)

[9]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Viên nang Faclacin 2 của Công ty Cổ phần dược phẩm Trung ương I – Pharbaco với các đặc điểm sau:

+ Cloxacillin (dạng cloxacillin natri) : 250 mg

+ Amoxicillin (dạng Amoxicillin trihydrat) : 250 mg

+ Tá dược: tinh bột sắn, bột talc, magnesi stearat vừa đủ cho 1 viên

- Chất chuẩn nghiên cứu

+ Amoxicillin trihydrat (VKNTW): Hàm lượng: 98,40% Độ ẩm: 13,20% + Cloxacillin Natri (VKNTW): Hàm lượng: 98,30% Độ ẩm: 4,37%

- Dung môi và hoá chất khác

+ Nước cất 2 lần được xử lí loại bỏ ion

+ Methanol dùng cho HPLC

+ Kali dihydrophosphat (KH2PO4) loại tinh khiết phân tích

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Máy quang phổ hai chùm tia Unicam UV 300 (ThermoSpectronic) được kết nối với máy tính (chạy trên hệ điều hành Windows XP) với phần mềm chuyên dụng Vision 32

Chế độ đo:

+ Start Lambda: 200 nm - Stop Lambda: 400 nm

+ Data Mode : Absorbance

+ Band width : 1,5nm

+ Scan Speed : Intelliscan nm/min