Virus dịch tả heo Châu Phi trên thai heo sảy và kết quả âm tính giả của realtime-PCR

Bài viết Virus dịch tả heo Châu Phi trên thai heo sảy và kết quả âm tính giả của realtime-PCR được nghiên cứu nhằm xác định nguy cơ virus DTHCP liên quan đến tình trạng gia tăng sảy thai trên nái, nhất là ở những trại heo đã từng có lịch sử nhiễm bệnh này; cũng như nguy cơ âm tính giả của kỹ thuật realtime-PCR theo quy trình của OIE trong xét nghiệm virus DTHCP trên thai sảy.

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 VIRUS DỊCH TẢ HEO CHÂU PHI TRÊN THAI HEO SẢY VÀ KẾT QUẢ ÂM TÍNH GIẢ CỦA REALTIME-PCR Nguyễn Ngọc Hải1,2, Nguyễn Thị Ngọc3, Nguyễn Thị Kim Yến3, Nguyễn Thị Phương Bình2, Trần Hồng Anh Thư2, Nguyễn Trung Quân3,2 TÓM TẮT Bệnh dịch tả heo châu Phi xuất Việt Nam từ tháng 2/2019 gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi heo Dịch bệnh tạm thời qua đi, thực tế virus DTHCP tồn đàn heo nuôi, đàn heo sinh sản trại bị mắc bệnh DTHCP Heo nái biểu lâm sàng bất thường bị sảy thai Các xét nghiệm RT-PCR virus PRRS, dịch tả heo cổ điển, PCR Parvovirus Aujeszky's thai sảy cho kết âm tính Tuy nhiên, xét nghiệm virus DTHCP mẫu thai sảy từ heo nái khác quy trình PCR thơng thường (OIE) nghiên cứu cho kết dương tính, xét nghiệm song song theo quy trình realtime-PCR (OIE) cho kết âm tính Kết nghiên cứu cho phép khẳng định virus DTHCP lưu hành đàn heo nái Việt Nam, đồng thời ghi nhận kết âm tính giả quy trình realtime-PCR (OIE) xét nghiệm virus DTHCP thai sảy Từ khoá: Virus DTHCP, thai heo sảy, PCR thơng thường, realtime-PCR, âm tính giả African swine fever virus on abortus and false negative result of realtime-PCR Nguyen Ngoc Hai, Nguyen Thi Ngoc, Nguyen Thi Kim Yen, Nguyen Thi Phuong Binh, Tran Hoang Anh Thu, Nguyen Trung Quan SUMMARY African swine fever (ASF) has appeared in Viet Nam since February, 2019 and caused the huge economic losses for the sector of pig husbandry Up to now, the ASF epidemic has temporarily passed, but ASF virus is still remaining in the pig herds, especially in the sow farms where the ASF epidemic has happened The sows did not show any specific clinic signs until miscarriage/absortion The result of RT-PCR tests for PRRS virus, classical swine fever virus, and PCR tests for Parvovirus and Aujeszky’s virus on the foetus of abortion were all negative However, the result of testing ASF virus on abortus samples from the different sows by conventional PCR procedure (OIE) in the study were positive, while the result of parallel test for ASF virus according to the realtime-PCR (OIE) procedure was negative The research results allow us to confirm that ASF virus is circulating in the sows in Viet Nam, and the false negative results of realtime-PCR test by (OIE) procedure for ASF virus in the foetus of abortion samples were recorded Keywords: African swine fever virus, pig foetus of abortion, conventional PCR, realtime-PCR, false negative Bộ môn Bệnh truyền nhiễm thú y cộng đồng, Khoa Chăn nuôi - Thú y, ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Phịng Chẩn đốn - Xét nghiệm thú y Hàn Việt, Khoa Chăn nuôi - Thú y, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Khoa Chăn nuôi - Thú y, ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 I ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả heo châu Phi (DTHCP) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm heo virus thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus gây Ở Việt Nam, ổ dịch bệnh dịch tả heo châu Phi đàn heo ni Hưng n Thái Bình Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn thơng báo thức vào ngày 20/2/2019 thời gian ngắn, bệnh xuất toàn 63 tỉnh/thành Việt Nam Các biện pháp kiểm soát dịch bệnh nghiêm ngặt áp dụng để ngăn chặn loại trừ bệnh, nhiên bệnh xảy nhiều địa phương Theo diễn tiến ghi nhận thực tế chăn nuôi heo nay, virus DTHCP lưu nhiễm đàn heo, với thể bệnh cấp tính, gây bệnh mạn tính dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người chăn nuôi Một bệnh lý quan trọng virus DTHCP gây sảy thai giai đoạn tuổi thai khác nái nhiễm virus mạn tính (Beltrán-Alcrudo ctv, 2017; Schlafer DH ctv, 1987) Hiện nay, tượng sảy thai nái gia tăng đáng báo động nhiều trại chăn nuôi heo Việt Nam, xét nghiệm xác định tác nhân phổ biến liên quan đến rối loạn sinh sản nái (PRRSV, virus dịch tả heo cổ điển, virus Aujeszky's…) cho kết âm tính Trước tình hình dịch tễ phức tạp bệnh DTHCP Việt Nam, virus DTHCP nên xem tác nhân cần đánh giá Mặt khác, xuất trường hợp nghi ngờ bỏ sót virus DTHCP xét nghiệm kỹ thuật realtime-PCR theo quy trình OIE (Ha Thi Thanh Tran ctv, 2020), trường hợp mạn tính (CISA-INIA, 2017) Nghiên cứu thực nhằm xác định nguy virus DTHCP liên quan đến tình trạng gia tăng sảy thai nái, trại heo có lịch sử nhiễm bệnh này; nguy âm tính giả kỹ thuật realtime-PCR theo quy trình OIE xét nghiệm virus DTHCP thai sảy II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Vật liệu, hoá chất dùng cho phản ứng PCR: GeneJET Viral DNA/RNA purification kit (Thermo, Mỹ), GoTaq G2 Green Master Mix (Promega, Mỹ), tinh ADN từ gel sau điện di kit GeneJET gel extraction and DNA micro kit (Thermo, Mỹ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tổng cộng mẫu thai heo sảy, thai heo lưu giai đoạn mang thai, từ nái khác thu thập trại heo có tiền sử bệnh DTHCP, xét nghiệm âm tính với virus PRRS, dịch tả heo cổ điển, Parvovirus Aujeszky's sử dụng để thực xét nghiệm PCR với cặp mồi PPA1: 5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' PPA2: 5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3', nhân đoạn ADN kích thước 257bp, gen VP73 (p72) (Augero ctv, 2003) theo quy trình khuyến cáo OIE (2019) Mẫu xét nghiệm phổi, gan, lách thai sảy Phản ứng PCR thực phịng Chẩn đốn Xét nghiệm thú y Hàn Việt, Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh gửi xét nghiệm đối chứng kỹ thuật realtime-PCR theo quy trình OIE phịng xét nghiệm khác Tp Hồ Chí Minh Vị trí bắt cặp cặp mồi theo Augero ctv (2003) nhân đoạn ADN virus DTHCP xác định so sánh phần mềm SnapGene 5.2 Trình tự nucleotide đoạn ADN nhân xử lý phần mềm Sequencher 5.4.6 (Genecodes) so sánh trình tự nucleotide với trình tự ASF tham khảo (bảng 1) phần mềm BioEdit 7.2.6 Cây di truyền xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining phần mềm MEGA 10.1.8 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 Bảng Danh sách chủng nghiên cứu chủng tham khảo di truyền virus DTHCP STT Tên chủng Nơi phân lập Năm Mã số truy cập Ngân hàng Gen Genotype VN/HV1/2019 Việt Nam 2019 MW648548 II VN/HV2/2020 Việt Nam 2020 MW648549 II VN/HV3/2020 Việt Nam 2020 MW648550 II VN/HV4/2020 Việt Nam 2020 MW648551 II VN/HV5/2020 Việt Nam 2020 MW648552 II E75 Tây Ban Nha FN557520 I L60 Bồ Đào Nha 1960 KM262844 I 47/Ss/2008 Italy 2008  KX354450 I 26544/OG10 Italy 2010 KM102979 I 10 Benin 97/1 AM712239 I 11 VNUA/TB-ASF1 Việt Nam 2019 MN793051 II 12 VNUA/HY-ASF1 Việt Nam 2019 MK554698 II 13 SY18 Trung Quốc 2018 MH713612 II 14 AnhuiXCGQ Trung Quốc 2018 MK128995 II 15 CAS19-01/2019 Trung Quốc 2019 MN172368 II 16 ASFV/NgheAn/2019 Việt Nam 2019 MT180393 II 17 ASFV/Hanoi/2019 Việt Nam 2019 MT180392 II 18 DB/LN/2018 Trung Quốc 2018 MK333181 II 19 Georgia 2008/1 Mỹ 2008 MH910495 II 20 Belgium/Etalle/wb/2018 Bỉ 2018 MK543947 II 21 Estonia/2014 Estonia 2014 LS478113 II 22 Warmbaths Nam Phi 1987 AY261365 III 23 N10 Uganda 2015 MH025919 IX 24 Ken06.Bus Kenya 2006 KM111295 IX 25 Kenya 1950 Kenya 1950 AY261360 X 26 RSA_2_2008 Nam Phi 2008 MN336500 XXII 27 ETH/1 Ethiopia 2011 KT795354 XXIII Benin III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết PCR xét nghiệm virus DTHCP minh họa qua hình Hình cho thấy mẫu xét nghiệm có đoạn ADN tương ứng với kích thước mẫu đối chứng dương (257bp) virus DTHCP Tuy nhiên, nhận thấy vạch ADN mẫu bệnh phẩm mờ nhiều so với vạch đối chứng dương Điều có lẽ lượng virus DTHCP mẫu so với mẫu đối chứng nên lượng đoạn ADN đích khơng nhiều Ngun nhân khác khơng loại trừ sản phẩm dương tính giả bắt cặp khơng đặc hiệu primer sử dụng nghiên cứu KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 Hình Kết điện di sản phẩm PCR xét nghiệm virus dịch tả heo châu Phi thai heo sảy Giếng - 4: Mẫu T1 – T4 Giếng 5: Đối chứng âm Giếng 6: Đối chứng dương ASFV (257 bp) Giếng 7: Thang trọng lượng chuẩn, 100 bp Để kiểm chứng giả thiết kết dương tính giả quy trình PCR nghiên cứu, mẫu ADN sử dụng phản ứng PCR gửi đến Chi cục Thú y vùng VI phịng thí nghiệm thứ 2, xét nghiệm đối chứng kỹ thuật realtime-PCR (OIE, 2019) Kết mẫu cho kết âm tính (bảng 2) Trong đánh giá so sánh quy trình realtimePCR PCR thơng thường OIE, Gallardo C ctv (2015) xét nghiệm 785 mẫu thực địa ghi nhận tỷ lệ phát mẫu dương tính với virus DTHCP tương đương kỹ thuật Kỹ thuật realtime-PCR định xét nghiệm virus DTHCP OIE, kết kết luận mẫu âm tính Tuy nhiên, theo báo cáo CISA-INIA (2017), quy trình xét nghiệm realtime-PCR OIE cho kết âm tính giả từ 15 - 21% so với quy trình xét nghiệm realtime-PCR khác Đặc biệt, trường hợp nhiễm virus DTHCP mạn tính nhiễm cận lâm sàng, hàm lượng virus mẫu thấp (Ct ≥ 35) quy trình realtime-PCR OIE cho kết âm tính giả 50% Trong nghiên cứu này, mẫu thai sảy lấy từ nái ngồi bình thường khơng có biểu lâm sàng đặc biệt khác trừ việc sảy thai Theo Beltrán-Alcrudo ctv (2017), biểu lâm sàng heo bệnh virus DTHCP thay đổi theo thể: từ thể cấp, cấp, cấp, mạn không biểu lâm sàng Mức độ biểu lâm sàng thay đổi tuỳ theo độc lực chủng virus DTHCP mà heo nhiễm Hàm lượng virus huyết virus DTHCP độc lực thấp thấp nhiều so với virus DTHCP độc lực cao Nghiên cứu Borca MV ctv (2020) ghi nhận hàm lượng virus huyết heo vào ngày thứ tư sau gây nhiễm chủng virus DTHCP độc lực cao đạt mức 107,5 đến 108,5 HAD50/ml, so với 101,8 đến 102,3 HAD50/ml chủng virus DTHCP độc lực thấp Thậm chí, heo có biểu sốt nhẹ (khoảng 39OC) bị gây nhiễm qua đường tiêm bắp với liều 106 chủng virus độc lực thấp Như vậy, nái sảy thai nghiên cứu nhiễm chủng virus DTHCP độc lực thấp, chủng thực địa, chủng virus vacxin khơng phép, chưa đánh giá đầy đủ độ an toàn Bảng Kết xét nghiệm virus dịch tả heo châu Phi kỹ thuật PCR realtime-PCR Mẫu Kết Hàn-Việt (PCR, OIE) Kết xét nghiệm phòng thí nghiệm (Realtime-PCR, OIE) Kết xét nghiệm phịng thí nghiệm (Realtime-PCR, OIE) Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Tương tự, kết âm tính giả quy trình realtime-PCR (OIE) xét nghiệm virus DTHCP công bố A D Truong ctv (2020), Ha Thi Thanh Tran ctv (2020) Theo nghiên cứu này, kết âm tính giả virus DTHCP thực địa có đột biến điểm vị trí gắn đoạn dị (probe) quy trình realtime-PCR OIE Ha Thi Thanh Tran ctv (2020) cho biết sau đoạn dò (probe) điều chỉnh từ OIE probe sang NIVR probe, mẫu heo bệnh thực địa trước có kết KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVIII SỐ - 2021 xét nghiệm virus DTHCP âm tính theo quy trình realtime-PCR OIE cho kết dương tính Kết Ha Thi Thanh Tran ctv (2020) ghi nhận số Ct mẫu cao nhiều (33,12 – 35,78 so với 22,18 – 25,08) Điều có nghĩa hàm lượng virus DTHCP mẫu thấp nhiều so với mẫu cho kết dương tính quy trình realtime-PCR OIE Dựa dấu hiệu nghi ngờ lâm sàng, kết xét nghiệm âm tính tác nhân gây rối loạn sinh sản nái khác PRRSV, dịch tả heo cổ điển, Parvovirus, virus Aujeszky's, báo cáo CISA-INIA (2017), để tăng thêm độ tin cậy kết PCR xét nghiệm virus DTHCP nghiên cứu, sử dụng phương pháp có độ tin cậy cao hơn, giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR, so sánh tương đồng với trình tự tham chiếu GenBank sử dụng Kết so sánh trình tự nucleotide thể qua bảng Trình tự nucleotide chủng nghiên cứu đăng ký Ngân hàng Gen với mã số: MW648548, MW648549, MW648550, MW648551 MW648552 Theo kết bảng 3, tương đồng trình tự nucleotide mẫu virus DTHCP nghiên cứu mức 92,4 – 100% với chủng virus DTHCP tham khảo GenBank, tương đồng 100% với chủng virus DTHCP tham khảo thuộc genotype II, kể với chủng virus DTHCP Việt Nam công bố năm 2019 Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide cao cho phép nghiên cứu khẳng định kết xét nghiệm virus DTHCP thai heo sảy phương pháp PCR hoàn toàn xác Ngồi ra, di truyền chủng với chủng tham khảo thực (hình 2) Hình Cây di truyền dựa trình tự nucleotide gen B646L (p72) virus DTHCP Cây di truyền xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining phần mềm MEGA 10.1.8 Các số nhánh đại diện cho phần trăm giá trị bootstrap với 1000 lần lặp lại (Giá trị