Bài viết này được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định các đa hình gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 (G681A và G636A) và Leu33Pro (T1565) gen ITGB3 bằng kỹ thuật realtime - PCR ở BN mạch vành đã đặt stent.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ỨNG DỤNG REALTIME - PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH NHANH CÁC ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ ITGB3 TRONG CHẨN ĐỐN TÍNH KHÁNG THUỐC CLOPIDOGREL VÀ ASPIRIN BỆNH NHÂN ĐẶT STENT ĐỘNG MẠCH VÀNH Nguyễn Thị Minh Ngọc*; Nguyễn Thị Trang* Lương Thị Lan Anh*; Nguyễn Thị Mai Ngọc**; Triệu Tiến Sang*** TÓM TẮT Hiện nay, nhiều nghiên cứu đa hình CYP2C19*2, CYP2C19*3 gen CYP2C19 PlA1/PlA2(Leu33Pro) gen ITGB3 có liên quan đến đề kháng clopidogrel aspirin Tách ADN từ 40 bệnh nhân (BN), sử dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định đa hình gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 PlA1/PlA2 (Leu33Pro) Khi phân tích đa hình gen CYP2C19 (CYP2C19*2 CYP2C19*3) phát 21 người (52,5%) có mang đột biến gen, 14 người (35%) mang gen dị hợp tử người (10%) mang đồng hợp tử đột biến CYP2C19*2 người mang gen dị hợp CYP2C19*3 Với đa hình PlA1/PlA2 gen ITGB3, phát người mang gen dị hợp tử (10%) Như vậy, tỷ lệ phát đa hình gen cao nhóm BN điều trị kép clopidogrel aspirin * Từ khóa: Bệnh mạch vành; CYP2C19; Kháng clopidogrel; ITGB3; Kháng aspirin Realtime-PCR Application for Determine Polymorphism of CYP2C19 and ITGB3 Gene in Clinical Diagnostic Clopidogrel and Aspirin Resistance in Patients Placed Coronary Stent Summary Numerous studies have shown that the polymorphisms of CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) of the ITGB3 gene are associated with clopidogrel and aspirin resistance DNA was extracted from 40 patients Using realtime-PCR technique to identify polymorphisms CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gene ITGB3 Results: In 40 samples, carriers of at least one CYP2C19 loss-of-function approximately 52.5% of the study population CYP2C19*2: 10% homozygous genotype, 35% heterozygous genotype and 55% wild type CYP2C19*3: 7.5% heterozygous genotype and 92.5% wild type Carriers of the Leu33Pro polymorphism of ITGB3 gene approximately 10% of the study population Conclusions: Initial description of polymorphisms of CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gene ITGB3 have been found to be high rate in group patient used clopidogrel and aspirin dual therapy * Keywords: Coronary artery disease; CYP2C19; Clopidogrel resistance; ITGB3; Aspirin resistance * Trường Đại học Y Hà Nội * Viện Tim mạch Quốc gia *** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Trang (trangtrang1182@yahoo.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 06/09/2017 311 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh mạch vành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước phát triển Tại nước phát triển, có Việt Nam, bệnh mạch vành có xu hướng gia tăng nhanh năm gần Đặt stent động mạch vành qua da phương pháp điều trị hiệu cho BN mạch vành cần can thiệp Khuyến cáo Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ Hiệp hội Tim mạch châu Âu nhấn mạnh tầm quan trọng trì thuốc kháng tiểu cầu kép sau đặt stent động mạch vành Cụ thể, BN can thiệp mạch vành (nong bóng động mạch vành đặt stent) cần dùng phối hợp aspirin với thuốc kháng tiểu cầu thuộc nhóm ức chế P2Y12 clopidogrel để giảm nguy nhồi máu tim tử vong Tuy nhiên, đáp ứng thuốc BN khác Nhiều nghiên cứu giới đề kháng clopidogrel aspirin bị ảnh hưởng nhiều yếu tố di truyền, cụ thể liên quan đến kiểu gen enzym chuyển hóa thuốc CYP2C19 ITGB3 CYP2C19*2 (CYP2C19 G681A, rs 4244285) CYP2C19*3 (CYP2C19 G636A, rs 4986893) hai alen quy định enzym CYP2C19 giảm khả chuyển hóa clopidogrel nhiều nghiên cứu chứng minh có liên quan đến gia tăng biến cố tim mạch [2, 3, PlA1 PlA2 (Leu33Pro, rs5918) đa hình gen ITGB3 có liên quan đến đáp ứng với aspirin [5 Undass CS (2001) mối liên quan đa hình PlA2 với tăng cường chức thrombin giảm chức 312 chống kết tập tiểu cầu aspirin sử dụng thuốc chấn thương vi mạch [6 Như vậy, trước BN mạch vành đặt stent, để xác định phác đồ điều trị chống kết tập tiểu cầu hiệu nhất, cần xác định đa hình gen liên quan đến chuyển hóa thuốc clopidogrel aspirin Phương pháp realtime - PCR phương pháp xác định đa hình xác với ưu điểm kỹ thuật tương đối đơn giản, thời gian nhanh chóng, mở nhiều triển vọng cho việc ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm thường quy trước định điều trị clopidogrel aspirin cho BN mạch vành đặt stent Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: Xác định đa hình gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 (G681A G636A) Leu33Pro (T1565) gen ITGB3 kỹ thuật realtime - PCR BN mạch vành đặt stent ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 40 BN mạch vành (được chẩn đoán mắc hội chứng vành cấp: nhồi máu tim, đau thắt ngực không ổn định), đặt stent động mạch vành qua da có định điều trị clopidogrel aspirin Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết AND từ máu ngoại vi (chống đông EDTA) kít tách ADN Express (Hãng Lytech, Nga) Sử dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định đa hình gen CYP2C19(CYP2C19*2 CYP2C19*3) PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gen ITGB3 với trình tự mồi: TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 1: Đa h nh Tr nh tự mồi CYP2C19*2 (G681A) CYP2C19*3 (G636A) Leu33Pro (T1565C) FP 5’ - CCCACTATCATTGATTATTTCTCG - 3’ ASP 5’- CCCACTATCATTGATTATTTCTCA - 3’ RP 5’ - ACGCAAGCAGTCACATAACTA - 3’ FP 5’ - GGATTGTAAGCACCCCCAGG - 3’ ASP - GGATTGTAAGCACCCCCAGA - 3’ RP 5’ - TCACCCCATGGCTGTCTAGG - 3’ FP 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAC - 3’ ASP 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAT - 3’ RP 5’ - GGGGACTGACTTGAGTGACCT - 3’ (FP: forward primer; ASP: allele specific primer; RP: reverse primer) Thực kỹ thuật realtime - PCR máy CFX96 (BioRad, Mỹ) với chu trình luân nhiệt: 93oC - phút, 35 chu kỳ (93oC - 10s, 64oC - 10s, 72oC - 20s), 72oC - phút Sử dụng kít ADN-express để tách chiết ADN kỹ thuật realtime - PCR nhân gen phân tích đột biến phương pháp tiết kiệm thời gian: trung bình 45 phút cho tách chiết ADN 90 phút cho xác định đa hình gen Như vậy, kỹ thuật có khả ứng dụng cao thực hành lâm sàng để xác định nhanh xác kiểu gen BN trước đưa phác đồ, liều điều trị clopidogrel aspirin * Đạo đức nghiên cứu: Số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan sở nghiên cứu xác nhận chấp thuận Thơng tin BN giữ bí mật phục vụ công tác nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung mẫu nghiên cứu Bảng 2: Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu Đặc điểm T lệ (n = 40) Tuổi (trung bình ± độ lệch) 62,6 ± 9,5 Giới: nam nữ 34 ( 85%) (15%) Tăng huyết áp 29 (72,5%) Đái tháo đường (22,5%) Rối loạn lipid máu 13 (32,5%) Số lần đặt stent ≥ lần (17,5%) 313 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 40 BN tham gia nghiên cứu, độ tuổi từ 39 - 79,nam giới chiếm đa số (85%) BN có yếu tố nguy cao bệnh tim mạch chiếm tỷ lệ tương đối lớn, đặc biệt tăng huyết áp rối loạn lipid máu Tỷ lệ phát đa hình gen CYP2C19 ITGB3 kỹ thuật realtime - PCR Bảng 3:Tỷ lệ phát đa hình gen CYP2C19 ITGB3 nhómnghiên cứu Chỉ số Gen CYP2C19 Gen ITGB3 Gi i Đa hình gen *2, *3 Đa hình gen Leu33Pro Nam 16 (47,1%) (8,8%) Nữ (66,7%) (16,7%) Chung 21 (52,5%) (10%) Tỷ lệ đa hình gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 nhóm nghiên cứu tương đối lớn: 52,5% BN mang alen CYP2C19 làm giảm chức chuyển hóa clopidogrel Bên cạnh đó, 10% BN có đa hình gen ITGB3 liên quan đến đề kháng aspirin T lệ đa h nh gen CYP2C19 ITGB3 nhóm nghiên cứu Bảng 4: Kết xác định kiểu gen CYP2C19 ITGB3 nhóm nghiên cứu Tần số kiểu gen Gen Bình thường Dị hợp tử Đồng hợp tử đa hình (%) (%) (%) n = 22 n =14 n=4 (55%) (35%) (10%) CYP2C19*2 (G681A) CYP2C19*3 (G636A) n = 37 n=3 n=0 (92,5%) (7,5%) (0%) PlA1/PlA2 n = 36 n=4 n=0 (T1565C) (90%) (10%) (0%) 45% BN mang alen CYP2C19*2, chủ yếu kiểu gen dị hợp tử (35%), kiểu gen đồng hợp tử 10% 7,5% BN mang alen CYP2C19*3, có kiểu gen dị hợp tử 10% BN mang alen PlA2 - có kiểu gen dị hợp tử BÀN LUẬN Bệnh mạch vành ngày gia tăng chiếm tỷ lệ lớn bệnh tim mạch nói riêng mơ hình bệnh tật nói chung Liệu pháp chống kết tập tiểu cầu đóng vai trò thiết yếu điều trị hội 314 chứng vành cấp thủ thuật can thiệp mạch vành qua da Hiện nay, phương pháp điều trị phối hợp aspirin clopidogrel xem liệu pháp kháng tiểu cầu chuẩn cho bệnh lý Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đề kháng với aspirin clopidogrel làm TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 giảm hiệu điều trị Theo nghiên cứu Boris T CS (2009), tỷ lệ không đáp ứng với aspirin dao động từ - 60%, với clopidogrel - 25% hai thuốc 10,4% [7 Ở Việt Nam, Đỗ Quang Huân (2013) khảo sát 174 BN mạch vành thấy tỷ lệ không đáp ứng với aspirin 21,3%, với clopidogrel 26,4% [1 Như vậy, nghiên cứu yếu tố liên quan đến đề kháng clopidogrel aspirin, đặc biệt yếu tố di truyền cần thiết việc phòng điều trị bệnh mạch vành Trong nghiên cứu chúng tơi, 52,5% BN có mang alen CYP2C19 làm giảm khả chuyển hóa clopidogrel (CYP2C19*2 CYP2C19*3) Kết tương tự với nghiên cứu Liu Mao CS (2013): khoảng 55% người châu Á mang alen làm giảm hoạt tính enzym CYP2C19 [8 Trong đó, chủ yếu BN có kiểu gen dị hợp CYP2C19*2 (14 BN - 35%) BN mang kiểu gen dị hợp CYP2C19*3 (7,5%) Như vậy, kiểu gen chuyển hóa mức trung bình (intermediate metabolizers) clopidogrel chiếm tỷ lệ tương đối lớn Kiểu gen chuyển hóa (poor metabolizers) đồng hợp CYP2C19*2 đồng hợp CY2C19*3 có BN(10%) Theo khuyến cáo Hội Dược lý Lâm sàng Điều trị Hoa Kỳ (ASCPT) (2013) sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu dựa kiểu gen CYP2C19 [9 , BN có kiểu gen CYP2C19 chuyển hóa trung gian chuyển hóa cần xem xét tăng liều clopidogrel điều trị thay prasugrel, ticagrelor… Ngoài ra, nghiên cứu chúng tơi ghi nhận BN (10%) mang đa hình Leu33Pro gen ITGB3, tất BN có kiểu gen dị hợp tửPlA1/PlA2 Khơng có BN mang kiểu gen đồng hợp tử PlA2/PlA2 Nghiên cứu Sperr W.R CS (1998) người châu Âu thấy 20 30% nhóm nghiên cứu mang kiểu gen PlA1/PlA2 - 3% mang kiểu gen PlA2/PlA2 [10 Nghiên cứu kiểu gen PlA1/PlA2 PlA2/PlA2 làm tăng phản ứng hoạt hóa thrombin so với kiểu gen đồng hợp tử PlA1/PlA1 Do làm giảm tác dụng chống kết tập tiểu cầu aspirin, hay nói cách khác, người có mang alen PlA2 tăng khả kháng thuốc aspirin Nghiên cứu Jussi M CS (2000) người Phần Lan thấy nhóm nghiên cứu có 73,1% mang kiểu gen PlA1/PlA1, 24,2% PlA1/PlA2 2,7% PlA2/PlA2 [11 Nghiên cứu mối liên quan chặt chẽ alen PlA2 gia tăng biến cố tim mạch huyết khối động mạch đột quỵ Với kết nghiên cứu chúng tôi, bước đầu thấy tỷ lệ mang đa hình gen CYP2C19 làm giảm khả chuyển hóa clopidogrel đa hình gen ITGB3 làm giảm đáp ứng với aspirin nhóm BN mạch vành Việt Nam tương đối lớn, người thầy thuốc cần quan tâm trước điều trị phác đồ chống kết tập tiểu cầu kép KẾT LUẬN Tỷ lệ BN mang đa hình gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 nghiên cứu 52,5%, tỷ lệ BN mang đa hình Leu33Pro gen ITGB3 10% Như vậy, số BN có khả đáp ứng với clopidogrel aspirin tương đối lớn, cần xác định kiểu gen để cân nhắc liều lượng thuốc, thay thuốc cho phù hợp 315 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 phác đồ điều trị BN sau đặt stent ĐMV Kỹ thuật realtime - PCR phương pháp xác định đa hình gen nhanh chóng, xác chi phí phù hợp với điều kiện Việt Nam, có khả ứng dụng tốt lâm sàng Qua kết nghiên cứu bước đầu ứng dụng kỹ thuật realtime - PCR, nhận thấy cần đưa xét nghiệm trở thành thường quy để xác định kiểu gen liên quan đến chuyển hóa thuốc clopidogrel aspirin trước điều trị cho BN mạch vành L I CẢM ƠN Nghiên cứu thực trường Đại học Y Hà Nội, thời gian từ tháng - 2016 đến - 2017, với hỗ trợ đồng nghiệp Bộ môn Y sinh học Di truyền TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Quang Huân, Hồ Tấn Thịnh Tỷ lệ không đáp ứng với điều trị thuốc chống kết tập tiểu cầu BN can thiệp động mạch vành qua da Tạp chí Y học Thực hành (878) 2013, số 8, tr.9-13 Brant J.T, Close S.L, Iturria S.J et al Common polymorphysm of CYP2C19 and CYP2C9 affect the phamacokinetic and pharmacodynamic respone to clopidogrel but not prasugrel J Thromb Heamost 2007, 5, pp.2429-2436 Mega J.L, Close S.L, Wiviott S.D et al Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel N Engl J Med 2009, 360 (4), pp.354-62 Collet J.P, Hulot J.S, Pena A et al.Cytochrome P450 2C19 polymorphism in 316 young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction: a cohort study Lancet 2009, 373 (9660), pp.309-17 Newman P.J, Derbes R.S, Aster R.H The human platelet alloantigens, Pl(A1) and Pl(A2), are associated with a leucine(33)/proline(33) amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa, and are distinguishable by ADN typing J Clin Invest 1989, 83, pp.1778-1781 Undas A, Brummel K, Musial J et al Pl(A2) polymorphism of beta-3 integrins is associated with enhanced thrombin generation and impaired antithrombotic action of aspirin at the site of microvascular injury Circulation 2001, 104, pp.2666-2672 Boris T.I, Mareike Sausemuth H.I, Evangelos G et al.Dual antiplatelet drug resistance is a risk factor for cardiovascular events after percutaneous coronary intervention Clinical Chemistry 2009, 55, pp.1171-1176 Liu Mao et al.Cytochrome CYP2C19 polymorphism and risk of adverse clinical events in clopidogrel-treated patients: A metaanalysis based on 23035 subjects Archives of Cardiovascular Disease.2013, 106, pp.517-527 Scott S.A, Sangkuhl K, Stein C.M et al Clinical pharmacogeneticsimplementation consortium guidelines for CYP2C19 genotype and clopidogrel therapy: 2013 update Clin Pharmacol Ther 2013, 94 (3), pp.317-23 10 Sperr W.R, Huber K, Roden M et al Inherited platelet glycoprotein polymorphisms and a risk for coronary heart disease in young central Europeans Thromb Res 1998, 90, pp.117-123 11 Jussi Mikkelsson, Markus Perola et al Glycoprotein IIIa PlA1/A2 polymorphism and sudden cardiac death Journal of AmericanCollege of Cardiology 2000, 36 (4), pp.1317-23 ... Tỷ lệ phát đa hình gen CYP2C19 ITGB3 kỹ thuật realtime - PCR Bảng 3:Tỷ lệ phát đa hình gen CYP2C19 ITGB3 nhómnghiên cứu Chỉ số Gen CYP2C19 Gen ITGB3 Gi i Đa hình gen *2, *3 Đa hình gen Leu33Pro... - PCR BN mạch vành đặt stent ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 40 BN mạch vành (được chẩn đoán mắc hội chứng vành cấp: nhồi máu tim, đau thắt ngực không ổn định) , đặt stent. .. kép sau đặt stent động mạch vành Cụ thể, BN can thiệp mạch vành (nong bóng động mạch vành đặt stent) cần dùng phối hợp aspirin với thuốc kháng tiểu cầu thuộc nhóm ức chế P2Y12 clopidogrel để giảm