Bài viết trình bày nghiên cứu tính đa hình gen CYP2C19 và ảnh hưởng của nó lên đáp ứng với clopidogrel ở bệnh nhân nhồi máu não.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2019 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ LÊN ĐÁP ỨNG VỚI CLOPIDOGREL Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU NÃO Đỗ Đức Thuần1; Phạm Đình Đài1; Trần Văn Khoa2 TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu tính đa hình gen CYP2C19 ảnh hưởng lên đáp ứng với clopidogrel bệnh nhân nhồi máu não Đối tượng phương pháp: nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang có phân tích Khoa Đột quỵ, Bệnh viện Quân y 103 từ tháng - 2017 đến - 2018: 144 bệnh nhân nhồi máu não điều trị clopidogrel 75 mg/ngày, đo độ ngưng tập tiểu cầu phương pháp đo độ truyền quang với adenosine diphosphate µg/l sau ngày điều trị, xác định kháng clopidogrel độ ngưng tập tiểu cầu > 50%, xác định đa hình gen giải trình tự Sanger Kết quả: tỷ lệ bệnh nhân mang alen CYP2C19*1 59,72%, alen CYP2C19*2 92,36%, alen CYP2C19*3 43,75% Kiểu hình chuyển hóa clopidogrel gặp 40,29% Kháng clopidogrel kiểu gen CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2 kiểu gen CYP2C19*1/*3 45,83%, kiểu gen CYP2C19*2/*3 54,17% Kết luận: bệnh nhân nhồi máu não mang alen CYP2C19 chức chiếm tỷ lệ cao yếu tố góp phần tăng khả kháng clopidogrel * Từ khóa: Nhồi máu não; Gen CYP2C19; Tính đa hình; Clopidogrel ĐẶT VẤN ĐỀ Clopidogrel (methyl [+]-[S]-a-[2chlorophenyl]-6,7-dihydrothieno [3,2-c] pyridin-5 [4H]-acetate hydrogen sulfate) thuộc nhóm thienopyridine, tiền chất, sau hấp thu đường tiêu hóa chuyển hóa gan enzym CYP2C19, isoenzym enzym cytochrom P450 [5] Lợi ích clopidogrel công nhận rộng rãi điều trị dự phòng nhồi máu não (NMN), có bệnh nhân (BN) bị NMN tái phát điều trị với clopidogrel [10] Một nguyên nhân cho đa hình gen CYP2C19 [5] Ở châu Á, kiểu gen mang alen CYP2C19*2,*3 chiếm tỷ lệ cao cho kiểu hình enzym khơng có tác dụng chuyển hóa clopidogrel [7], từ gây hiệu sử dụng clopidogrel điều trị dự phòng biến cố huyết khối BN NMN Ở Việt Nam, thuốc clopidogrel định rộng rãi điều trị dự phòng NMN [1, 3] Để nâng cao hiệu sử dung clopidogrel lâm sàng, tiến hành: Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 ảnh hưởng tới tính đáp ứng clopidogrel BN NMN Bệnh viện Quân y 103 Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Đức Thuần (dothuanvien103@gmail.com) Ngày nhận bài: 19/06/2019; Ngày phản biện đánh giá báo: 24/07/2019 Ngày bỏo c ng: 05/08/2019 30 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 6-2019 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 144 BN NMN điều trị Khoa Đột quỵ, Bệnh viện Quân y 103 từ tháng - 2017 đến - 2018 * Tiêu chuẩn lựa chọn: - BN đủ tiêu chuẩn chẩn đoán đột quỵ não theo định nghĩa Tổ chức Y tế Thế giới (1989) [11] - Có hình ảnh NMN phim chụp cắt lớp vi tính lớp cắt cộng hưởng từ có từ lực 1,5 Tesla - Dùng clopidogrel 75 mg/ngày ≥ ngày điều trị - BN điều trị NMN theo liệu trình khơng thay đổi ngày nghiên cứu Với thuốc bảo vệ tế bào thần kinh, BN có chung phác đồ: cerebrolysin 20 ml tiêm tĩnh mạch chậm, piracetam g tiêm mạch chậm, choline alfoscerate g tiêm bắp * Tiêu chuẩn loại trừ: - Dị ứng với clopidogrel - BN sử dụng thuốc chống đông thuốc chống ngưng tập tiểu cầu khác clopidogrel trước thời điểm nghiên cứu vòng tuần thời điểm nghiên cứu - BN dùng thuốc tiêu huyết khối để điều trị NMN giai đoạn cấp - BN nong bóc tách nội mạc động mạch cảnh - BN có rối loạn nước điện giải nặng - BN có rối loạn ý thức đột quỵ NMN có vùng chi phối > 1/3 vùng chi phối động mạch não hình ảnh CT MRI sọ não - Có hình ảnh chảy máu não CT MRI + Hemoglobin < 80 g/l > 160 g/l - Tiểu cầu < 100 G/l > 450 G/l - BN có bệnh như: nhồi máu tim, rung nhĩ, suy tim độ (theo NYHA), viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, phẫu thuật tim hay có dị tật bẩm sinh tim mạch - Viêm gan, xơ gan, ung thư gan - BN có mức lọc cầu thận < 30ml/ phút/1,73m2 da lọc máu chu kỳ mắc bệnh khác với tính chất nặng - BN người đại diện pháp lý không đồng ý tham gia nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu: tiến cứu, mơ tả cắt ngang có phân tích - Xét nghiệm độ ngưng tập tiểu cầu (ĐNTTC): sử dụng phương pháp đo ĐNTTC cách đo độ truyền quang học với ADP µg/l để đánh giá ĐNTTC Mẫu máu lấy lúc đói với áp lực âm tính hệ thống chân khơng có chất chống đơng natri citrat 3,2% Mẫu bảo quản nhiệt độ 18 - 250C, xét nghiệm thực vòng sau lấy mẫu, máy Chrono - Log 530 VS (Mỹ) Khoa Huyết học, Bệnh viện Quân y 103 - Tiêu chuẩn kháng clopidogrel: BN dùng clopidogrel 75 mg/ngày, ngày, xác định ĐNTTC phương pháp LTA với ADP µg/l 50% [6] - Xét nghiệm gen CYP2C19: tách chiết ADN từ máu ngoại vi (chống đông EDTA) DNA blood mini kit (Qiagen, c) 31 Tạp chí y - dợc học quân sè 6-2019 Nhân gen PCR hệ thống Mastercycle ProS (Eppendorf, Đức) với cặp mồi đặc hiệu đặt tổng hợp từ Hãng IDT (Mỹ) Chu trình nhiệt: 95oC x 11 phút; 94oC x phút; 57oC x phút (*2) 56oC x phút (*3), 72 oC x phút] x 35 chu kỳ, 72oC x 20 phút, dừng 4oC Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Các mẫu có chất lượng tốt mẫu cho băng điện di sáng, rõ, có băng tương ứng với băng 168 bp (sản phẩm phân tích *2), 270 bp (sản phẩm phân tích *3) Giải trình tự theo nguyên lý Sanger để xác định đa hình gen CYP2C19 (CYP2C19*2 CYP2C19*3), sử dụng Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit, phân tích phần mềm BioEdit Xét nghiệm gen CYP2C19 thực Bộ môn Sinh học Di truyền Y học, Học viện Quân y KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Thực xét nghiệm gen cho 150 BN, kết nghiên cứu phân tích 144 BN, BN loại không đủ tiêu chuẩn nghiên cứu Bảng 1: Đặc điểm nhóm nghiên cứu *1/*1 (n = 6) *1/*2, *1/*3 (n = 80) *2/*3 (n = 58) Tổng (n = 145) p 71,33 ± 7,20 67,35 ± 11,17 68,10 ± 10,96 67,82 ± 10,92 > 0,05 Giới (nam, %, n) 71,43 (5) 56,25 (45) 53,45 (31) 55,86 (81) > 0,05 Đái tháo đường (%, n) 33,33 (2) 26,25 (21) 32,76 (19) 29,17 (42) > 0,05 Tăng huyết áp (%, n) 100,00 (6) 85,00 (68) 84,50 (49) 85,42 (123) > 0,05 Đang hút thuốc (%, n) 33,33 (2) 18,75 (15) 18,97 (11) 19,44 (28) > 0,05 0,0 (0) 7,50 (6) 6,90 (4) 6,94 (10) > 0,05 83,33 (5) 67,50 (54) 75,86 (44) 71,53 (103) > 0,05 Kiểu gen Tuổi (năm) Nghiện rượu (%, n) Rối loạn mỡ máu (%, n) Axít uric máu (mmol/l) 345,08 ± 93,60 360,36 ± 102,01 364,55 ± 109,04 361,30 ± 103,91 > 0,05 Tiểu cầu (máu ngoại vi) G/l 243,53 ± 24,76 245,52 ± 60,93 245,94 ± 56,35 245,60 ± 57,78 > 0,05 Chẹn kênh Ca+ (%, n) 16,67 (1) 67,50 (54) 57,17 (32) 60,42 (87) > 0,05 Ức chế men chuyển (%, n) 50,00 (3) 33,75 (27) 32,76 (19) 34,03 (49) > 0,05 Statin (%, n) 50,00 (3) 38,75 (31) 27,59 (16) 34,72 (50) > 0,05 Metfomin 16,67 (1) 6,25 (5) 8,62 (5) 7,64 (11) > 0,05 Sulfamide 16,67 (1) 6,25 (5) 13,79 (8) 9,72 (14) > 0,05 (alen CYP2C19*1: *1; CYP2C19*2: *2; CYP2C19*3: *3) Tỷ lệ giới tính, đái tháo đường, tăng huyết áp, hút thuốc lá, nghiện rượu, rối loạn lipid máu, thuốc sử dụng BN chẹn kênh canxi, ức chế men chuyển khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê nhóm gen với p > 0,05 Tuổi, lượng axít uric máu, số lượng tiểu cầu trung bình máu ngoại vi nhóm gen khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 32 Tạp chí y - dợc học quân sè 6-2019 Tính đa hình CYP2C19 BN NMN Tỷ lệ % 100% 92,36% 80% 59,72% 60% 43,75% 40% 20% 0% Alen *1 Alen *2 Alen *3 Biểu đồ 1: Tỷ lệ phân bố alen CYP2C19 nhóm nghiên cứu Tỷ lệ BN mang alen CYP2C19*1 59,72%, BN mang alen CYP2C19*3 gặp 43,75%, cao BN mang alen CYP2C19*2 (92,36%) Tỷ lệ BN mang alen CYP2C19*1 (alen có chức chuyển hóa clopidogrel bình thường) nghiên cứu 59,72%, tương đương với kết Yamazaki H (2014) tỷ lệ CYP2C19*1 người châu Á 61,5% [15], thấp so với Yang CS (2012) nghiên cứu BN đột quỵ có dùng clopidogrel, 92,90% BN mang alen CYP2C19*1 [16] Tỷ lệ BN mang alen giảm chức chuyển hóa clopidogrel (CYP2C19*2,*3) nghiên cứu cao so với nghiên cứu nước Veiga CS (2009) nghiên cứu người Việt Nam bình thường: 31% mang alen CYP2C19*2; 6% mang CYP2C19*3 [13] Nguyễn Thúy Mậu CS (2017) nghiên cứu BN nhồi máu tim cấp thấy 54,7% BN mang alen CYP2C19*2; 7,8% mang CYP2C19*3 [2] Sự khác biệt khác đối tượng, quần thể BN thời gian nghiên cứu Bảng 2: Phân bố kiểu gen, kiểu hình CYP2C19 BN NMN Kiểu hình CYP2C19 Chuyển hóa mạnh (EM) Chuyển hóa trung bình (IM) (kiểu hình BN mang alen CYP2C19*2 CYP2C19*3) Chuyển hóa (PM) Kiểu gen Tỷ lệ % (n) *1/*1 4,17 (6) *1/*2, *1/*3 55,56 (80) *2/*3 40,29 (58) (EM: Extensive metabolizer; IM: Intermediate metabolizers, PM: Poor metabolizer) 33 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 6-2019 Theo Scott S.A, kiểu hình có chức chuyển hóa clopidogrel mạnh 35 - 50%, chuyển hóa trung bình 18 - 45%, chuyển hóa - 15% [12] Yang J CS (2012) nghiên cứu BN người Trung Quốc bị đột quỵ NMN thấy kiểu hình có chức chuyển hóa mạnh 47,54%; chuyển hóa trung bình 45,36%; chuyển hóa 7,1% [16] Như vậy, BN đột quỵ NMN nghiên cứu có kiểu hình chức chuyển hóa clopidogrel mạnh chiếm tỷ lệ ít, chuyển hóa chiếm tỷ lệ cao, cảnh báo cho BN đột quỵ dùng clopidogrel Ảnh hưởng tính đa hình gen CYP2C19 đến tính đáp ứng clopidogrel Bảng 3: Ảnh hưởng tính đa hình gen CYP2C19 tới ĐNTTC Kiểu gen (n) ĐNTTC (%) *1/*1 (6) 30,00 ± 14,97 *1/*2 (75) 39,20 ± 18,02 *1/*3 (5) 40,60 ± 10,71 *2/*3 (58) 47,02 ± 18,40 Tổng (144) p < 0,05 42,01 ± 18,29 ĐNTTC BN có kiểu gen CYP2C19*1/CYP2C19*1 thấp nhóm kiểu gen (30,00 ± 14,97%) ĐNTTC BN mang alen chức chuyển hóa clopidogrel cao (47,02 ± 18,40%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, tương tự nghiên cứu Yang J.C CS (2012) [16], Y.H Jeong CS (2011) [8] Guillaume Paré CS (2010) [17]: BN mang alen CYP2C19*2, CYP2C19*3 làm giảm chuyển hóa clopidogrel thành chất có hoạt tính, kết làm giảm khả chống ngưng tập tiểu cầu Bảng 4: Ảnh hưởng đa hình gen CYP2C19 tới tính kháng clopidogrel Kiểu gen Kháng (n = 48) Không kháng (n = 96) *1/*1, *1/*2, *1/*3 45,83%(22) 66,67% (64 ) *2/*3 54,17%(26) 33,33% (32 ) 33,10%(48) 66,90% (96) Tổng Nhóm BN mang kiểu gen CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3 có tỷ lệ kháng clopidogrel thấp (45,83%) Chức chuyển hóa clopidogrel BN có kiểu gen mang hai alen (CYP2C19*2/*3) có tỷ lệ kháng cao (54,17%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 34 p < 0,05 Nhiều nghiên cứu nhận thấy người mang alen CYP2C19*2, CYP2C19*3 nguyên nhân gây kháng clopidogrel [9, 14] Clopidogrel tiền chất, để thành chất co hoạt tính cần chuyển hóa gan, enzym CYP2C19 đóng vai trò [4] Khi BN mang alen T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2019 mt chc cho kiểu hình enzym CYP2C19 khơng chuyển hóa clopidogrel thành chất có hoạt tính [5, 14] Vì vậy, FDA Hoa Kỳ đưa cảnh báo giảm tác dụng clopidogrel lên ức chế ngưng tập tiểu cầu giảm khả chuyển hóa thuốc thành dạng có hoạt tính BN có alen CYP2C19 giảm chức [7] KẾT LUẬN Nghiên cứu 144 BN NMN, tuổi trung bình 7,82 ± 10,92, nam 55,86%, chúng tơi nhận thấy: 59,72% BN mang alen CYP2C19*1, 4,17% đồng hợp tử CYP2C19*1/*1 BN mang alen CYP2C19*2 chiếm tỷ lệ cao (92,36%), không gặp đồng hợp tử CYP2C19*2/*2 43,75% BN mang alen CYP2C19*3 gặp dạng dị hợp tử Kiểu hình chuyển hóa clopidogrel chiếm 40,29% Bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, CYP2C19*3 làm tăng trung bình độ ngưng tập tiểu cầu tỷ lệ kháng clopidogrel sau điều trị: độ ngưng tập tiểu cầu BN có kiểu gen CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3 CYP2C19*2/*3 tương ứng 39,20 ± 18,02%, 40,60 ± 10,71% 47,02 ± 18,40% 45,83% BN có kiểu gen CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2 kiểu gen CYP2C19*1/*3 kháng clopidogrel, 54,17% BN có kiểu gen CYP2C19*2/*3 kháng clopidogrel TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Chương Nhồi máu não Thực hành lâm sàng Thần kinh học, Tập Nhà xuất Y học Hà Nội 2005, tr.43-73 Nguyễn Thị Thúy Mậu, Vũ Ngọc Trung, Nguyễn Hữu Hiếu CS Bước đầu đánh giá mối liên quan đa hình gen CYP2C19 độ ngưng tập tiểu cầu BN nhồi máu tim cấp số bệnh viện Hà Nội Tạp chí Khoa học ĐHQGHN 2017, tập 33, số 2, tr 68-74 Nguyễn Văn Thông Xử trí cấp cứu BN đột quỵ não cấp Bệnh học Thần kinh Nhà xuất Y học Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược lâm sàng 108 Hà Nội 2013, tr.31-41 Ancrenaz V, Daali Y, Fontana P et al Impact of genetic polymorphisms and drugdrug interactions on clopidogrel and prasugrel response variability Curr Drug Metab 2010, 11 (8), pp.667-677 Dahabreh I.J, Moorthy D, Lamont J.L et al Testing of CYP2C19 variants and platelet reactivity for guiding antiplatelet treatment AHRQ Publication Rockville (MD) 2013 Gurbel P.A, Tantry U.S "Clopidogrel resistance? Thrombosis Research 2007, 120, pp.311-321 Holmes D.R, Jr Dehmer G.J, Kaul S et al ACCF/AHA clopidogrel clinical alert: Approaches to the FDA "boxed warning": A report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on clinical expert consensus documents and the American Heart Association endorsed by the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions and the Society of Thoracic Surgeons J Am Coll Cardiol 2010, 56 (4), pp.321-341 Jeong Y.H, Tantry U.S, Kim I S et al Effect of CYP2C19*2 and *3 loss-of-function alleles on platelet reactivity and adverse clinical events in East Asian acute myocardial infarction survivors treated with clopidogrel and aspirin Circ Cardiovasc Interv 2011, (6), pp.585-594 Mega J.L, Close S.L, Wiviott S.D et al Cytochrome P-450 polymorphisms and response to clopidogrel N Engl J Med 2009, 360, pp.354-362 35 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2019 10 Sacco R.L, Diener H.C, Yusuf S et al Aspirin and extended-release dipyridamole versus clopidogrel for recurrent stroke The New Eng Land Journal of Medicine 2008, 359, pp.1238-1251 11 Sacco R.L, Kasner S.E, Broderick J.P et al An updated definition of stroke for the st 21 century Stroke 2013, 44, pp.2064-2089 12 Scott S.A, Sangkuhl K, Gardner E.E, Stein C.M, Hulot J.S, Johnson J.A, Roden D.M, Klein T.E, Shuldiner A.R Clinical pharmacogenetics implementation consortium guidelines for cytochrome P450-2C19 (CYP2C19) genotype and clopidogrel therapy Clin Pharmacol Ther 2011, 90 (2), pp.328-332 13 Veiga M.I, Asimus S, Ferreira P.E et al Pharmacogenomics of CYP2A6, CYP2B6, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5 and 36 MDR1 in Vietnam Eur J Clin Pharmacol 2009, 65, pp.355-363 14 VlachoJannis G.J, Dimitropoulos G, Alexopoulos D Clopidogrel resistance: Current aspects and future directions Hellenic Journal of Cardiology 2011, 52, pp.236-245 15 Yamazaki Hiroshi Fifty years of cytochrome P450 research Springer Japan 2014 16 Yang J, Zhao H.D, Tan J et al CYP2C19 polymorphism and antiplatelet effects of clopidogrel in Chinese stroke patients Pharmazie 2012, 68 (3), pp.183-186 17 Paré Guillaume, R Mehta Shamir, Yusuf Salim, Anand Sonia, J Connolly Stuart, Hirsh Jack, Simonsen Katy, Bhatt Deepak, Fox Keith, Eikelboom John Effects of CYP2C19 genotype on outcomes of clopidogrel treatment 2010, Vol 363, pp.1704-1714 ... nghiên cứu có kiểu hình chức chuyển hóa clopidogrel mạnh chiếm tỷ lệ ít, chuyển hóa chiếm tỷ lệ cao, cảnh báo cho BN đột quỵ dùng clopidogrel Ảnh hưởng tính đa hình gen CYP2C19 đến tính đáp ứng. .. CYP2C19* 2, CYP2C19* 3 làm giảm chuyển hóa clopidogrel thành chất có hoạt tính, kết làm giảm khả chống ngưng tập tiểu cầu Bảng 4: Ảnh hưởng đa hình gen CYP2C19 tới tính kháng clopidogrel Kiểu gen. .. (CYP2C19* 2,*3) nghiên cứu cao so với nghiên cứu nước Veiga CS (2009) nghiên cứu người Việt Nam bình thường: 31% mang alen CYP2C19* 2; 6% mang CYP2C19* 3 [13] Nguyễn Thúy Mậu CS (2017) nghiên cứu