Ảnh hưởng của Fluoxetine đến hoạt động của enzyme adenylate cyclase và mối quan hệ với con đường tín hiệu AMPK trong tế bào leydig mLTC-1

Trong nghiên cứu Ảnh hưởng của Fluoxetine đến hoạt động của enzyme adenylate cyclase và mối quan hệ với con đường tín hiệu AMPK trong tế bào leydig mLTC-1 đã khảo sát ảnh hưởng của FLX đến hoạt động của enzyme adenylate cyclase dưới tác động kích thích của hLH trong tế bào Leydig mLTC-1 và tìm hiểu mối liên kết với protein AMPK, để có được cái nhìn chính xác hơn về cơ chế hoạt động của FLX trong tế bào Leydig.

N.T.Tho, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 6(49) (2021) 111-117 111 6(49) (2021) 111-117 Ảnh hưởng Fluoxetine đến hoạt động enzyme adenylate cyclase mối quan hệ với đường tín hiệu AMPK tế bào leydig mLTC-1 Effect of Fluoxetine on the LH-stimulated adenylate cyclase activity in MLTC Leydig cells linked with the AMP activated protein kinase pathway Nguyễn Thị Thoa, Đỗ Thu Hàb,c, Nguyễn Thị Mộng Điệpd* Nguyen Thi Thoa, Do Thu Hab,c, Nguyen Thi Mong Diep d* Khoa Giáo dục Tiểu học Mầm non, Trường Đại học Quy Nhơn, Việt Nam Department of Primary and Preschool Education, Quy Nhon University, Vietnam b Trung tâm Sinh học phân tử, Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, Đà Nẵng, Việt Nam b Center for Molecular Biology, College of Medicine and Pharmacy, Duy Tan University, Da Nang, 550000, Vietnam c Khoa Dược, Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, Đà Nẵng, Việt Nam c Department of Medicine, College of Medicine and Pharmacy, Duy Tan University, 550000, Da Nang, Vietnam d Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Quy Nhơn, Việt Nam d Faculty of Natural Sciences, Quy Nhon University, Vietnam a a (Ngày nhận bài: 20/9/2021, ngày phản biện xong: 8/11/2021, ngày chấp nhận đăng: 06/12/2021) Tóm tắt Protein AMPK (5’-AMP activated protein kinase) biết đến protein tham gia điều chỉnh q trình chuyển hóa lượng nội bào cân lượng Những khám phá gần AMPK đóng vai trị sinh sản nam sản xuất hormone steroid Fluoxetine (FLX), loại thuốc chống trầm cảm sử dụng rộng rãi chủ yếu hoạt động chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc (SSRI) hệ thần kinh trung ương, chứng minh thể chế hoạt động khác nhiều loại tế bào khác Do đó, có tác dụng phụ khơng mong muốn, khơng liên quan đến mục đích sử dụng nó, việc điều hịa nội tiết sinh sản Chúng cho thấy báo sau nuôi cấy tế bào leydig mLTC-1 với FLX, phản ứng adenosine monophosphate vòng (cAMP) Luteinizing Hormone (LH) bị giảm xuống Nồng độ ATP giảm kèm theo hiệu ứng này, cho thấy kích thích hoạt động protein AMPK Một kết tương tự tìm thấy sử dụng metformin (MET) chất kích hoạt gián tiếp AMPK Kết luận, nghiên cứu chúng tơi cho thấy FLX làm giảm tích tụ cAMP thơng qua hoạt hóa AMPK tế bào mLTC-1 ức chế hình thành steroid LH tế bào Từ khóa: mLTC-1; cAMP; Adenylyl cyclase; AMPK; Fluoxetine; Metformin Abstract 5’-AMP activated protein kinase (AMPK) is a known key sensor and regulator of intracellular energy metabolism and energy balance Recent discoveries have shown that AMPK also plays a role in male reproduction and steroid hormone production Fluoxetine (FLX), a widely used antidepressant primarily acting as a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) in central nervous system, has been shown to exhibit other mechanisms of action in various other cell types Consequently, it might have unexpected adverse effects not related to its intended use, possibly in the endocrine regulation of reproduction In this context, we show in the present report that after a 1-hour preincubation of mLTC-1 Leydig cells with FLX, the intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responses to Luteinizing Hormone (LH) is reduced A drop in ATP concentration accompanies this effect, suggesting the stimulation of 5’-AMP activated 112 N.T.Tho, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 6(49) (2021) 111-117 protein kinase activity A similar result has also been found with the indirect AMPK activator, metformin (MET) In conclusion, our study shows that FLX diminished cAMP accumulation through AMPK activation in mLTC-1 cells and consequently inhibited LH-induced steroidogenesis in these cells Keywords: mLTC-1; cAMP; Adenylyl cyclase; AMPK; Fluoxetine; Metformin Đặt vấn đề Protein AMPK (5’-AMP activated protein kinase) protein kinase hoạt động cảm biến lượng tế bào Sự hoạt hóa AMPK kích thích đường dị hóa sản xuất lượng ATP (Adenosine triphosphate) đồng thời ức chế đường đồng hóa tiêu thụ lượng ATP, điều chỉnh cân lượng tế bào [1-2] AMPK protein dị phân tử bao gồm tiểu đơn vị xúc tác α hai tiểu đơn vị điều hòa, β γ, với khác loài đồng dạng đặc trưng cho mơ Vì hoạt hóa AMPK kích thích đường dị hóa sản xuất ATP đồng thời ức chế đường đồng hóa tiêu thụ ATP [12], nên nghiên cứu tác động có Fluoxetine (FLX) phản ứng tế bào thông qua hoạt hóa AMPK cần thiết Thật vậy, nồng độ testosterone tăng cao chuột KO α1AMPK- ∕- tế bào Leydig hoạt động yếu [3] cho thấy tác dụng ức chế AMPK trình sản sinh hormone steroid thể Hơn nữa, hoạt động AMPK ức chế tạo thành steroid theo chu kỳ cAMP dòng tế bào Leydig (tế bào MA-10 mLTC-1) cách cản trở biểu chất điều hịa q trình sản sinh steroid chất mang cholesterol, StAR thụ thể hạt nhân Nr4a1 báo cáo [4] Là chất chống trầm cảm ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc (SSRI), FLX sử dụng để giảm trầm cảm [5], ức chế kênh ion khác [6-10] chuỗi hơ hấp ti thể [7] FLX cải thiện trí nhớ chức nhận thức [5] FLX chứng minh ức chế sản xuất β-amyloid ngăn chặn thối hóa tế bào thần kinh mơ hình chuột APP/PS1 [11] Hơn nữa, Li et al (2004) FLX tăng cường đáng kể q trình phosphoryl hóa GSK3β [12] Pilar-Cuellar et al (2012) tiết lộ FLX làm tăng mức β-catenin [13] Do đó, dự kiến làm giảm sản xuất ATP kích thích hoạt động protein AMPK Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng FLX đến hoạt động enzyme adenylate cyclase tác động kích thích hLH tế bào Leydig mLTC-1 tìm hiểu mối liên kết với protein AMPK, để có nhìn xác chế hoạt động FLX tế bào Leydig Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Vật liệu: Dòng tế bào mLTC-1 từ chuột Viện Nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia (INRAe) Pháp cung cấp bảo quản nuôi cấy Học viện Quân y, Hà Nội Hóa chất: Tất hóa chất mua từ Sigma-Aldrich trừ có ghi khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào Tế bào mLTC-1 nuôi cấy mơi trường RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen) có bổ sung huyết bò 48 tiếng trước tra vào giếng đĩa nuôi cấy 96 giếng, khoảng 100.000 tế bào/giếng, sau mang ủ 37°C với 5% CO2 vòng 24 tiếng Phương pháp xác định cAMP nội bào cAMP nội bào tích lũy tác động hormone tế bào mLTC-1 đo phát quang oxiluciferin sản xuất tác dụng luciferase phụ thuộc cAMP N.T.Tho, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 6(49) (2021) 111-117 Tế bào mLTC-1 sau 24 tiếng nuôi cấy transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển XtremeGENETM-HP-DNA Plasmid bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme cAMP [14] Sau dịch mơi trường transfection loại bỏ thay môi trường RPMI 1640 huyết chứa chất luciferase luciferin có bổ sung IBMX Tế bào sau ủ với FLX MET 28°C trước kích thích hLH Nồng độ cAMP xác định máy đo quang phổ huỳnh quang đầu đọc Polarstar OPTIMA (BMG labtech) [14] Xác định mức lượng ATP tế bào Các tế bào mLTC-1 tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng Sau 48 nuôi cấy nhiệt độ 37°C, môi trường thay môi trường khơng có huyết có bổ sung FLX MET Đĩa tế bào ủ thêm nhiệt độ 37°C trước thêm 50μl Cell-TiterGlo 2.0 Assay Promega vào giếng Sau đĩa tế bào lắc với vận tốc nhẹ 10 phút tối ủ thêm phút nhiệt độ phòng trước ghi lại phát quang thuốc thử Cell-Titer-Glo 2.0 Giá trị cường độ phát quang thu tương đương với giá trị nồng độ ATP tế bào sống [14] Phương pháp đánh giá khả sống tế bào mLTC-1 Các tế bào mLTC-1 gieo vào đĩa 96 giếng với 100.000 tế bào/giếng Hai ngày sau, môi trường thay môi trường khơng có huyết có bổ sung FLX MET Sau ủ nhiệt độ 37°C trước bổ sung 20µl CellTiter-Blue Reagent (Promega, Madison, WI, USA) đến giếng Sau ủ 37°C, thay đổi huỳnh quang ghi lại 113 máy đo quang phổ Spectra Gemini (Sunnyvale, CA) bước sóng kích thích 560nm bước sóng phát xạ 640nm Tín hiệu huỳnh quang từ thuốc thử CellTiter-Blue tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống [14] Phương pháp Western-Blotting Protein tổng số chiết xuất từ tế bào mLTC-1 dung dịch đệm ly giải Protein sau điện di với gel SDS-PAGE 10% lai qua màng nitrocellulose Sau đó, màng ủ với kháng thể sơ cấp AMPKα (62kDa) phospho-Thr172-AMPKα (62kDa), kháng thể pha loãng BSA 5% (độ pha loãng cuối 1: 1000), ủ qua đêm 4°C Sau đó, màng tiếp tục ủ kháng thể thứ cấp IgG thỏ (H + L) (CF ™ 770 Conjugate) (độ pha lỗng cuối 1: 2000) Cường độ tín hiệu băng protein phân tích máy Odyssey, phiên 1.2 (LICOR Biosciences, Lincoln, Hoa Kỳ) [14] Phương pháp xử lý số liệu Trong thí nghiệm, lần lặp lại thực giá trị trung bình sai số chuẩn giá trị trung bình (SD) xác định Phân tích thống kê thực phần mềm Graphpad Prism Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng Fluoxetine Metformin đến nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích hLH AMPK protein tham gia đường điều hịa cân lượng tế bào, có liên quan đến việc điều hòa axit béo, tổng hợp cholesterol [15], nhiều đường đồng hóa khác [16-17] Biểu AMPK tuyến sinh dục chứng minh rõ ràng [18-20] AMPK có nhiều tế bào sinh dục tế bào hạt, tế bào theca, tế bào trứng tế bào hoàng thể, tế bào Sertoli, Leydig tế bào mầm nhiều loài [21] N.T.Tho, Đ.T.Hà, N.T.M.Điệp / Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân 6(49) (2021) 111-117 114 Protein AMPK tham gia vào trình hình thành steroid tuyến sinh dục, trưởng thành tế bào mầm, tăng sinh tồn tế bào, phân cực, hình thành trì phức hợp nối tế bào động lực học tế bào Sự hoạt hóa AMPK kích hoạt thay đổi cấu trúc AMP gây ra, cho phép phosphoryl hóa threonine 172 tiểu đơn vị xúc tác α protein kinase Liver kinase B1 (LKB1) Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase β (CaMKK) [16] AMPK giảm tích tụ cAMP kích thích hormone human Luteinizing Hormone (hLH), phản ứng tổng hợp progesterone kích thích hLH dịng tế bào mLTC-1 Thật vậy, Hình 3.1 cho thấy động học huỳnh quang oxiluciferin phụ thuộc cAMP kích thích hLH giảm đáng kể FLX phụ thuộc vào liều lượng Sự ức chế gần hoàn toàn quan sát thấy sau ủ với nồng độ 100µM FLX (Hình 1a) Hơn nữa, chúng tơi nhận kết tương tự MET, chất kích hoạt gián tiếp AMPK (Hình 3.2) Nghiên cứu FLX MET (chất kích hoạt gián tiếp protein AMPK) làm tăng q trình phosphoryl hóa (A) (B) 25000 0µM 800 AUC (60 min) mean +/- SEM Luminescence (+/- SEM) 1000 12.5µM 600 400 50µM 200 100µM 0 20 40 20000 15000 *** 10000 *** 5000 *** 60 0.01 100 FLX (µM) Times (min) Hình 3.1 Ảnh hưởng Fluoxetine Metformin đến nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích hLH Lượng hormone hLH tra vào giếng đĩa 96 giếng giống 10µl, nồng độ lặp lại lần Số liệu trình bày biểu đồ giá trị trung bình cường độ tín hiệu biểu cAMP lần *** (P< 0.001): Có ý nghĩa thống kê so sánh mẫu đối chứng (0µM) mẫu thí nghiệm có FLX (B) (A) 40 Times (min) 60 0) 20 tr l( 10 0µ M 200000 50 µM 5000 400000 µM 10000 *** 600000 12 0µM 12.5µM 50µM 100µM C Luminescence (+/- SEM) 15000 AUC (60 min) mean +/- SEM ** ns Hình 3.2 Ảnh hưởng Metformin đến nồng độ cAMP nội bào tác động kích thích hLH Lượng hormone hLH tra vào giếng đĩa 96 giếng giống 10µl, nồng độ lặp lại lần Số liệu trình bày biểu đồ giá trị trung bình cường độ tín hiệu biểu cAMP lần *** (P