KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH SINH HỌC NGHIÊN CỨU VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BIOFIM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ SỮA BÒ TƯƠI Ở CẦN THƠ VÀ ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN P SINH VIÊN THỰC HIỆN MSSV LỚP SINH HỌC K43 2 Cần Thơ, 2021 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện được luận văn một cách thuận lợi và hoàn thiện một cách tốt nhất Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngô Thanh Phong đã tận tâm chỉ báo hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn Tôi xin.
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH SINH HỌC NGHIÊN CỨU VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BIOFIM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ SỮA BÒ TƯƠI Ở CẦN THƠ VÀ ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN P MSSV: LỚP: SINH HỌC K43 Cần Thơ, 2021 LỜI CẢM ƠN Để thực luận văn cách thuận lợi hồn thiện cách tốt Với lịng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Thanh Phong tận tâm báo hướng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến cố vấn học tập Trần Thanh Mến quan tâm tơi q trình học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô giảng viên, cán thuộc môn Sinh học – Khoa Khoa học Tự nhiên tận trình giảng dạy, giúp đỡ tơi q trình học tập Tôi xin cảm ơn anh/chị lớp Cao học, anh/chị lớp Sinh học Khóa 42 bạn Khóa 43 nghiên cứu phịng thí nghiệm Sinh học tế bào phân tử - môn Sinh học tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình làm thí nghiệm Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Người viết CAM KẾT KẾT QUẢ Tơi xin cam kết luận văn hồn thành dựa kết nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Ngô Thanh Phong kết trình luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu hay luận văn khác Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Cán hướng dẫn Người viết PGS.TS Ngô Thanh Phong TÓM LƯỢC Đề tài "Nghiên cứu xác định khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò tươi thành phố Cần Thơ Đồng Tháp" thực nhằm tìm đặc điểm hình thái, sinh hóa, khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò tươi nguyên liệu thành phố Cần Thơ Tỉnh Đồng Tháp Từ 10 mẫu sữa bò tươi nguyên liệu thu nhận từ trại ni bị sữa thành phố Cần Thơ tỉnh Đồng Tháp phân lập 40 dịng vi khuẩn Sau tiến hành khảo sát khả hình thành biofilm cho thấy có 20 dịng có khả sản sinh biofilm Trong dịng vi khuẩn BT28 Cần Thơ DDT15 Đồng Tháp có khả hình thành biofilm mạnh Tiến hành khảo sát đặc điểm sinh hóa dịng vi khuẩn BT28 ĐT15 cho thấy dịng vi khuẩn có hình que, Gram (-), Catalase (+), Oxidase (-), Gelatin (+), Citrate (+), Urease (-),Glucose(+),Gelatin (+) Sau 72 nuôi cấy, dịng vi khuẩn CT412 có khả sinh enzyme ngoại bào protease Từ khóa: biofilm, Thành phố Cần Thơ, sữa bò tươi, vi khuẩn Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sữa loại thức uống đặc biệt, mềm, dễ tiêu hóa dễ hấp thu, cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, khống chất có mùi vị thơm ngon Ngành sữa đóng vai trị quan trọng trong hệ thống thực phẩm toàn cầu phát triển bền vững khu vực nơng thơn Thực tế, ngành sữa đóng góp tích cực vào kinh tế nhiều cộng đồng, khu vực đất nước Hiện nay, cầu sữa giới có xu hướng tăng, thêm vào cơng nghiệp có xu hướng tồn cầu hóa dẫn đến gia tăng phạm vi mức độ giao dịch sữa toàn cầu.Ở khu vực Châu Á, Việt Nam lên quốc gia có ngành cơng nghiệp sản xuất, chế biến sữa phát triển động, đặc biệt năm gần Về công nghệ sản xuất, sản phẩm sữa nước Việt Nam chế biến đóng gói hai dạng trùng tiệt trùng Công nghệ tiệt trùng hiểu đơn giản tiến trình xử lý nhiệt cho sữa nhiệt độ cao (130-150oC) thời gian ngắn (3-15 giây) mơi trường vơ trùng khép kín Nhờ cơng nghệ mà sữa tiệt trùng giữ nhiều chất dinh dưỡng, bảo quản nhiệt độ thường thời hạn sử dụng kéo dài từ tháng đến năm Sữa tươi trùng đun nóng nhiệt độ 85-90oC thời gian ngắn (30 giây – phút) làm lạnh Cũng giống loại thực phẩm nào, sữa chứa thành phần gây hại, chât hóa học có tính độc, tác nhân gây dị ứng sữa lại có chất khó dung nạp cho thể Bên cạnh khơng thể không kể đến tồn loại vi sinh vật có mặt sữa, vi sinh vật gây thay đổi chất lượng sữa, tạo sản phẩm thứ cấp làm ảnh hưởng đến sức khỏe người sau hiệu kinh tế Trong nhóm vi khuẩn ưa lạnh có mặt sữa tươi xem vấn đề lớn ngành cơng nghiệp sữa liên quan đến trình làm hư hỏng sản phẩm Bên cạnh có số hình thành màng biofilm Trong suốt trình tồn trữ sữa tươi nguyên liệu, chúng sản sinh nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt thủy phân protein, chất béo làm sữa bị tủa, có vị đắng mùi ôi làm giảm chất lượng sản phẩm, gây uy tín thiệt hại kinh tế đáng kể cho nhà sản xuất (Downey, 1980) 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trên sở tham khảo tài liệu nghiên cứu, đề tài hướng đến việc "tìm hiểu đặc tính hình thái, sinh hóa khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò tươi nguyên liệu Thành phố Cần Thơ Đồng Tháp" Mục tiêu đề tài phân lậpcác dịng vi khuẩn có sữa bị tươi ngun liệu tiến hành khảo sát số đặctính sinh học (hình thái, sinh hóa), khả hình thành biofilm, khả sản sinh enzyme ngoại bào dòng vi khuẩn Từ đưa biện pháp phòng ngừa nguyên nhân gây hư hỏng sản phẩm sữa dòng vi khuẩn gây CHƯƠNG 2: TÀI LIỆU THAM KHẢO 2.1 Sơ lược vị trí thu mẫu 2.1.1 Thành Phố cần Thơ Thành phố Cần Thơ nằm tồn đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi đắp bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù sa dịng sơng Hậu Địa chất thành phố hình thành chủ yếu qua q trình bồi lắng trầm tích biển phù sa sông Cửu Long Cần Thơ nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, bão, quanh năm nóng ẩm, khơng có mùa lạnh Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C Một số khu vực địa bàn Thành phố Cần Thơ năm gần chăn ni bị sữa phát triển mạnh là: Long Hồ, Bình Thủy, Cái Răng, Tân Phú,… 2.1.2 Tỉnh Đồng Tháp Đồng Tháp 13 tỉnh vùng Đồng sông Cửu Long tỉnh có địa bàn hai bờ sơng Tiền Địa hình Đồng Tháp tương đối phẳng với độ cao phổ biến 1–2 mét so với mặt biển Địa hình chia thành vùng lớn vùng phía bắc sơng Tiền vùng phía nam sơng Tiền Đồng Tháp nằm vùng khí hậu nhiệt đới, đồng địa giới tồn tỉnh, khí hậu chia làm mùa rõ rệt mùa mưa mùa khơ Những đặc điểm khí hậu tương đối thuận lợi cho phát triển nông nghiệp tồn diện Chăn ni bị sữa tập trung chủ yếu huyện Lai Vung 2.2 Sơ lược sữa tươi Sữa tươi loại sữa động vật dạng nguyên liệu thô, dạng nước, chưa qua chế biến qua sơ chế chưa tiệt trùng hay khử trùng triệt để thiết bị xử lý nhiệt vi lọc, sữa tươi bảo quản vận chuyển điều kiện lạnh trước sử dụng Loại sữa tươi thông dụng sữa bị tươi tính phổ biến sản lượng sữa bò Theo nghiên cứu thành phần, ly sữa tươi cung cấp gần 30% lượng canxi hàng ngày 23% lượng photpho Ở nước phát triển, sữa tươi coi thực phẩm bổ dưỡng, giàu vitamin khoáng chất từ thiên nhiên, tốt cho thể Sữa tươi không sử dụng thường xun thức uống hàng ngày mà cịn có nhiều hình thức khác từ pha chế, trộn với trái cây, làm bánh thêm vào ăn Các bác sĩ, chun gia dinh dưỡng ln khuyến khích người tiêu dùng nên uống sữa tươi 100% thiên nhiên khơng dễ uống, mùi vị thơm ngon, sữa tươi cịn dễ hấp thu uống thường xuyên, liên tục 2.2.1 Thành phần sữa tươi Các thành phần dưỡng chất có sữa bị tươi ngun chất : Protein sữa bò tươi lượng protein calories (cal) cao khoảng 67Kcal/100ml sữa ,thành phần protein sữa chủ yếu nước casein.bên cạnh cịn có canxi ,magie,photpho,… Chất béo sữa tươi ngun chất có khoảng 4% chất béo.Vitamin sữa có lượng vitamin phong phú đa dạng nhóm vitamin A, vitamin B, vitaminB2,vitamin B12, vitamin D,… Các loại khống chất khác Thành phần sữa khơng giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: loại giống, điều kiện khí hậu ni, chế độ thức ăn, điều kiện chăm sóc, điều chỉnh dinh dưỡng sữa thơng qua điều chỉnh thức ăn, nhiều yếu tố khác Bảng phân tích thành phần hóa học sữa từ loại động vật khác dùng làm thực phẩm 2.2.2 Hệ vi sinh vật sữa Các vi khuẩn có lợi: - Vi khuẩn lactic: nhóm vi sinh vật quan trọng sữa, lên men lactic điển hình (Streptococus lactic, S bulgaricum, L acidophilum, ) lên men lactic khơng điển hình (S paracitrovorus, S diacetilactic, trực khuẩn Betabacteri, ) - Nấm men: • Nấm men rượu (Sacharomyces): lên men đường lactoza, có giá trị lớn việc làm sữa chua • Một số chủng giống Torulopsis có tác dụng làm rắn bơ Bên cạnh vi khuẩn có lợi, sữa tươi nguyên liệu chứa vi khuẩn có hại, điển hình là: - Streprococcus liquefaciens phát triển sữa sản phẩm sữa gây trình pepton hóa tạo vị đắng khó chịu cho sản phẩm - Vi khuẩn gây thối: Pseudomonas, Brevibacterium, Achromobacter, Bacillus putrificus, Bacillus subtilis, CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm Thời gian: tháng năm 2020 đến tháng năm 2021 Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh học phân tử - mơn Sinh – Khoa Khoa học Tự Nhiên – Đại học Cần Thơ 3.2 Phương tiện 3.2.1 Vật liệu Các mẫu sữa tươi nguyên liệu thu từ hộ chăn nuôi bò sữa Cần Thơ Đồng Tháp 3.3.2 Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: Đĩa petri, kim cấy, đèn cồn Ống nghiệm nắp đen Ống đong, ống hút Giá ống nghiệm Túi nilon, găng tay y tế, viết lông, sổ tay ghi chép Micropipette (10-100, 100-1000 1000-5000) Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng Lame, lamemlle Đầu cone Thiết bị: Nồi khử trùng nhiệt ước ( Hirayama, Nhật) Tủ cấy vô trùng (ESCO class II BSC) Tủ sấy (Memment, Đức) Tủ ủ (Memment, Đức) Tủ lạnh (Sharp, Nhật) Máy lắc (Stuart, Anh) Máy khuấy từ (Stuart, Anh) Máy đo quang phổ (Ultrospec Plus Spectrophotometer-Pharmacia LKB Mỹ) Kính hiển vi (Olympus PX51, Nhật Bản) Cân phân tích (Mettler Toler, Thụy Sĩ) Máy Vortex (VELP Scientifica, Slovenia) Và thiết bị khác phịng thí nghiệm 3.3 Hóa chất 3.3.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy trữ mẫu rịng • Mơi trường Cetrimide Agar (CA) (Flint Hartley, 1996): 45,3 g/L CA; 10 ml/L glycerol; 3,4 g/L agar 3.3.2 Mơi trường kiểm tra khả hình thành biofilm Môi trường Tryptone Soya Broth bổ sung Yeast Extract (TSB + Y): 30 g/L TSB; g/L Yeast Extract Dung dịch Phosphate Buffer Saline (PBS 1X): g/L NaCL; 0,2 g/L KCL; 1,44 g/L Na2HPO4; 0,24 g/L KH2PO4 Methanol Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) 1% Ethanol 95% 3.3.3 Mơi trường khảo sát đặc tính sinh hóa dịng vi khuẩn hình thành màng biofilm mạnh Mơi trường thử nghiệm khả hóa lỏng Gelatin (Gelatin Broth): 120 g/L Gelatin; g/L Peptone; g/L Yeast Extract Môi trường thử nghiệm Urease: 10 g/L Urea; 0,1 g/L Yeast; 9,5 g/L Na2HPO4; 9,1 g/L K2HPO4; 0,01 g/L Phenol Red 3.3.4 Môi trường kiểm tra khả thủy phân enzyme dịng vi khuẩn hình thành màng bioflm mạnh Mơi trường kiểm tra hoạt tính protease (Skim Milk Agar (SM agar)): 100 g/L skim milk; g/L peptone; g/L NaCl; g/L Yearst Extract; 15 g/L agar Mơi trường kiểm tra hoạt tính Lipase có bổ sung Tween 80: 10 g/L peptone; g/L NaCl; 0,1 g/L CaCl2.2H2O; 20 g/L agar; 10 ml/L tween 80 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thu mẫu sữa Mẫu sữa thu trang trại ni bị sữa hộ gia đình vắt vào ống ly tâm 15mL, làm lạnh chuyển phịng thí nghiệm vòng tiếng bảo quản ngăn mát tủ lạnh 24h tiến hành trải mẫu 3.4.2 Phân lập vi khuẩn Phân lập khâu quan trọng q trình nghiên cứu vi khuẩn Mục đích phân lập tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành dòng khiết để nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hóa Các bước tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành qua bước: pha lỗng trải mẫu mơi trường Cetrimide Agar (CA) (Flint and Hartley, 1996) Sau tiến hành làm thuần, quan sát hình dạng, khả chuyển động mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn phân lập Qui trình phân lập, quan sát vi khuẩn, khuẩn lạc vi khuẩn, trữ mẫu vi khuẩn ròng thực theo quy trình Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2002); Nguyễn Đức Lượng cộng sự, (2003); Trần Linh Thước, (2007) ❖ Phân lập vi khuẩn: Phương pháp pha loãng mẫu: dùng pipet vô trùng hút ml sữa từ ống đựng sữa cho vào ống nghiệm có nắp chứa sẵn ml nước cất vô trùng khuấy mạnh máy khuấy mẫu, dung dịch mẫu đạt tỉ lệ 10-1 Theo cách pha loãng liên tiếp đạt tỉ lệ 10-2, 10-3, 10-4 Hút 100 μl dung dịch pha lỗng nhỏ lên đĩa petri có môi trường phân lập CA, dùng que trải mẫu khắp mặt thạch, mở nắp đĩa để khô khoảng - 10 phút với lửa đèn cồn tủ cấy Đĩa môi trường trải mẫu ủ 32ᴏC 24 - 48 để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Chọn cấy chuyền nhiều lần từ khuẩn lạc riêng lẻ để tách ròng (làm thuần) dòng vi sinh vật Chỉ tiêu theo dõi: hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa, độ khuẩn lạc, đặc điểm tế bào kính hiển vi - Trong phân lập, vi khuẩn cần phải tách rời tế bào phát triển thành khuẩn lạc độc lập Tế bào vi khuẩn tách ròng kĩ thuật cấy ria tách ròng Sau cấy ria, chọn khuẩn lạc rời khác từ đĩa môi trường tiến hành cấy chuyển nhiều lần sang đĩa môi trường loại khuẩn lạc rời rạc, đồng Quan sát kiểm tra độ ròng mẫu Nếu mẫu ròng (xem dịng) đồng thời tiến hành quan sát hình dạng, khả chuyển động vi khuẩn Sau trữ mẫu rịng vào ống eppendorf chứa mơi trường để tiến hành thí nghiệm - Trữ mẫu vi khuẩn ròng: Các dòng vi khuẩn (xem dòng) đem cấy trữ giống eppendorf có chứa mơi trường phân lập vi khuẩn (trữ ống), trữ tủ lạnh (có thể trữ tháng, sau tiếp tục cấy chuyền) Các chủng vi khuẩn phân lập ròng cất trữ glycerol 20% nhiệt độ -70ᴏC trữ thời gian đến năm (Maniatis et al., 1982; Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002; Nguyễn Đức Lượng cộng sự, 2006) ❖ Mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Khi cấy chuyển vi khuẩn đĩa môi trường thạch đồng thời tiến hành đo kích thước quan sát hình thái khuẩn lạc bao gồm tiêu: màu sắc, hình dạng, độ dạng bìa khuẩn lạc mắt Các khuẩn lạc đo kích thước thước milimet (mm) 3.4.3 Quan sát hình dạng vi khuẩn, mơ tả đặc điểm khuẩn lạc dịng vi khuẩn phân lập Các mẫu vi khuẩn ròng phân lập từ thí nghiệm cấy trở lại đĩa môi trường CA để tiến hành mô tả đặc điểm khuẩn lạc sau 48 ủ nhiệt độ 37ᴏC tủ ủ Chỉ tiêu theo dõi: kích thước, hình dáng, độ mơ, màu sắc khuẩn lạc, khả di chuyển, nhuộm Gram Phương pháp nhuộm Gram: thực theo phương pháp Hucker cải tiến: Các bước tiến hành: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc (sau cấy 24 giờ) hoà vào giọt nước cất phiến kính, làm khơ khơng khí Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn - lần Nhuộm dung dịch tím kết tinh phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin - phút, rửa nước, để khơ khơng khí Soi kính: dùng vật kính có độ phóng đại 100 lần Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ (Nguyễn Lân Dũng Đinh Thúy Hằng, 2006) 3.4.4 Kiểm tra khả hình thành biofilm Phương pháp định lượng khả sản biofilm đĩa 96 giếng thực theo mô tả Stepanovic et al (2007) Fallah et al (2017) với bước thực sau: Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn môi trường lỏng: Nuôi cấy vi khuẩn ml dung dịch TSB+Y vơ trùng Lắc 200 vịng/12 tiếng Bước 2: Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn 1/10: Chuyển ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 môi trường TSB+Y vào ống nghiệm chứa ml môi trường TSB+Y mới, vô trùng Trộn máy vortex Lắc 200 vịng/12 tiếng Bước 3: Ni cấy tĩnh Chuyển 100 μl huyễn dịch vi khuẩn vào giếng có sẵn 100 μl môi trường TSB+Y đĩa nhựa vô trùng 96 giếng Mỗi mẫu lặp lại lần Ni cấy tĩnh 37 oC vịng 48 Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa: Loại bỏ hồn tồn vi khuẩn khơng nằm biofilm cách rửa giếng 200 μl PBS 1x; lặp lại lần sau thấm khơ hoàn toàn giếng Bước 5: Cố định biofilm: Cố định vi khuẩn bám vào thành/ đáy đĩa 200 μl methanol Giữ đĩa nhiệt độ phòng 20 phút Loại bỏ hoàn toàn methanol giếng cách vẩy thấm khô Bước 6: Nhuộm biofilm: Bổ sung vào giếng 200 μl dung dịch tím kết tinh (crystal violet) 1% Giữ đĩa nhiệt độ phòng 15 phút Loại bỏ hồn tồn dung dịch tím kết tinh cách vẩy thấm khơ Loại bỏ hồn tồn thuốc nhuộm thừa (không thấm vào lớp biofilm) cách rửa giếng 200 μl PBS 1x; lặp lại lần khơng cịn màu thuốc nhuộm sau thấm khô giếng Bước 7: Đo mật độ quang: Hịa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào biofilm cách bổ sung vào giếng 200 μl dung dịch ethanol 95% Giữ nhiệt độ phịng 20 phút Đo giá trị OD bước sóng 570 nm 3.4.5 Khảo sát số đặc điểm sinh hóa dịng vi khuẩn có khả hình thành biofilm mạnh ... sữa bò tươi thành phố Cần Thơ Đồng Tháp" thực nhằm tìm đặc điểm hình thái, sinh hóa, khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò tươi nguyên liệu thành phố Cần Thơ Tỉnh Đồng Tháp Từ 10... sở tham khảo tài liệu nghiên cứu, đề tài hướng đến vi? ??c "tìm hiểu đặc tính hình thái, sinh hóa khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò tươi nguyên liệu Thành phố Cần Thơ Đồng Tháp" Mục... trình nghiên cứu hay luận văn khác Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Cán hướng dẫn Người vi? ??t PGS.TS Ngơ Thanh Phong TĨM LƯỢC Đề tài "Nghiên cứu xác định khả hình thành biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa