tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm tại phòng kiểm nghiệm intertek - cần thơ

TÓM LƯỢC –&— Trong tình hình hiện nay, việc xuất khẩu thuỷ sản của nước ta đang phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh, hóa chất, kim loại n

LỜI CẢM ƠN

œ¯•

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin chân thành cảm ơn:

Quý thầy cô trong bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản cùng quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ đã trang bị cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập

Qua thời gian thực hiện đề tài em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Hoàng Bá Nghị, chị Phạm Bích Kiểu và các anh chị khác ở phòng kiểm nghiệm Intertek đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập trong thời gian qua

Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Vương Thanh Tùng, giáo viên hướng dẫn đã tận tình chỉ dạy cho em phương pháp thực hiện đề tài, cung cấp cho em nhưng tư liệu quí giá

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài

Cần Thơ, tháng 05 năm 2009 Sinh viên thực hiện DƯƠNG THỊ CẨM TRÚC

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

@&?

Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

@&?

Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009

TÓM LƯỢC

–&—

Trong tình hình hiện nay, việc xuất khẩu thuỷ sản của nước ta đang phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh,

hóa chất, kim loại nặng trong thủy sản và sản phẩm thủy sản

Sự tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong mặt hàng thủy sản khi xuất khẩu nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây ra những thiệt hại nặng nề cho doanh nghiệp chế biến thủy sản và cho uy tín của nước nhà Trước tình hình xuất khẩu ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất đi phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả trong nước và trên quốc tế, đảm bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết được vấn đề rào cản an toàn vệ

sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu phương pháp

kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ”

có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định lượng sự tồn lưu của nhóm kháng sinh, kim loại nặng … trong sản phẩm thủy sản

Qua quá trình tìm hiểu đã ghi nhận được một số phương pháp định lượng kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng…còn tồn lưu trong thủy sản và sản phẩm thủy sản

- Một số phương pháp kiểm kháng sinh

Định lượng Cloramphenicol trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc

- Một số phương pháp kiểm kim loại nặng

Phương pháp định lượng Cadmium (Cd) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

Phương pháp định lượng thủy ngân (Hg) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

Phương pháp định lượng chì (Pb) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

Phương pháp định lượng Arsenic (As) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

–&—

Những chữ viết tắt sau đây đã được sử dụng trong đề tài luận văn:

HACCP Hazard Analysis Critical Control Point

UV – VIS Ultraviolet-visible spectroscopy

AAS Atomic Absorption Spectroscopy

MS Mass spectrometry

FAAS Flame atomic absorption spectrometry)

NPSEM (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit

ppb Parts per billion

DANH SÁCH BẢNG

–&—

Bảng 4.1 Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn

m-CAP thêm vào để dựng đường chuẩn 16

Bảng 4.2 Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP 17

Bảng 4.3 Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn 21

Bảng 4.4 Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và LMG 22

Bảng 4.5 Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích Nitrofuran27 Bảng 4.6 Điều kiện phân mảnh MS/MS của hỗn hợp dẫn xuất của các chất trong nhóm Nitrofuran 28

Bảng 4.7 Chương trình nhiệt chạy trên NCI source khi phân tích thuốc trừ sau họ Chlor 31

Bảng 4.8 Chương trình nhiệt chạy trên EI source khi phân tích thuốc trừ sau họ Chlor 32

Bảng 4.9 Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm Hg vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn 35

Bảng 4.10 Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS 39

Bảng 4.11 Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS 42

Bảng 4.12 Các thông số cài đặt trên máy phá mẫu Multiwave 3000 46

Bảng 4.13 Thể tích chuẩn As 100ppb thêm vào để dựng đường chuẩn As 46

Bảng 4.14 Mối liện hệ giữa nồng độ và độ hấp thu của As khi chạy chuẩn 48

Bảng 4.15 Độ thu hồi của As trên mẫu spike 20ppb và mẫu spike 100ppb 49

Bảng 4.16 Độ tái lặp trên các nền mẫu khác nhau tại 20ppb 49

Bảng 4.17 Độ lặp lại trên mẫu tôm spike 1ppb ở 3 ngày khác nhau 50

Bảng 4.18 Độ hấp thu của As khi chạy 20 mẫu spike 20ppb và 20 mẫu blank 50

MỤC LỤC

–&—

LỜI CẢM ƠN ii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN iii

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN iv

TÓM LƯỢC v

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG x

MỤC LỤC xi

CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek 2

2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản 2

2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh 2

2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản 2

2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh 3

2.3 Quyết định của Bộ Thủy Sản 3

2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký 4

2.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí 5

2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC 6

2.4 3 Giới thiệu hệ thống AAS 11

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Các phương pháp và phương tiện thực nghiệm 13

3.1.1 Các phương pháp 13

3.1.2 Phương tiện thực hiện 13

3.2 Các bước thực hiện đề tài 13

3.3 Thời gian thực hiện đề tài 13

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ 14

4.1 Một số phương pháp kiểm các nhóm kháng sinh 14

4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol 14

4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green 18

4.1.3 Nhóm kháng sinh Nitrofuran: 23

4.2 Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu 28

4.3 Một số phương pháp phân tích kim loại nặng 33

4.3.1 Qui trình phân tích thủy ngân (Hg) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản 33

4.3.2 Qui trình phân tích Cadmium (Cd) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản 37

4.3.3 Qui trình phân tích Chì (Pb) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản 40

4.3.4 Qui trình phân tích Arsenic (As) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản 43

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề xuất 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 55

Chương I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, nhưng hiện nay ngành thủy sản nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng thuốc kháng sinh trong thủy sản và sản

phẩm thủy sản Dư lượng các thuốc kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất

có hại đối với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến nền kinh tế thị trường nước nhà

Bộ Thủy sản cho rằng do hoạt động kiểm soát dư lượng, hóa chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc tại tất

cả các công đoạn từ nuôi trồng, đánh bắt, thu mua vận chuyển nguyên liệu, đến chế biến, nên trong năm 2004 số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao (EU: 22 lô, Mỹ: 13 lô, Canada: 27 lô) Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng thuỷ sản Việt Nam trên thị trường thế giới Hậu quả là Tổng vụ Bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng EU (SANCO) đã cử Đoàn cán bộ thanh tra đến Việt Nam để kiểm tra hoạt động ngăn chặn hoá chất, kháng sinh có hại trong thủy sản ở Việt Nam trong tháng 4/2005; Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã kiểm tra chương trình HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point- Hệ thống phân tích các mối nguy cơ và điểm kiểm soát tới hạn) của các doanh nghiệp có liên quan của Việt Nam trong tháng 9/2005

TS Nguyễn Tử Cương, Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, An toàn Vệ sinh Thú y Thuỷ sản, nhận xét: “Công tác quản lý chất lượng, an toàn vệ sinh và thú y thuỷ sản đã duy trì ổn định, giải quyết kịp thời các rào cản của những thị trường xuất khẩu quan trọng như Nhật Bản, EU, Nga Nhưng năng lực của các

cơ quan địa phương còn hạn chế, chính quyền địa phương đầu tư chưa đúng mức, ngay cả ở các tỉnh trọng điểm”

Trước tình hình xuất khẩu ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất

đi phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả trong nước và trên quốc tế, đảm bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết được vấn đề rào cản an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu đối với mặt hàng thủy sản của nước ta và Intertek cũng là một trong những công ty kiểm định hàng đầu được quốc tế công nhận đã cung cấp dịch vụ đảm bảo chất lượng cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong đó có lĩnh vực thực phẩm thủy sản

và đã được VILAS công nhận đạt chuẩn ISO 17025:2005 Vì vậy, đề tài “Tìm

hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ” có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định

lượng sự tồn lưu của nhóm kháng sinh, kim loại nặng… trong sản phẩm thủy sản

Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek

- Cty TNHH Intertek Việt Nam – chi nhánh Cần Thơ được thành lập theo giấy phép số 011043000077 ngày 10/11/2008 do UBND thành phố Hà Nội cấp; chứng nhận đăng ký hoạt động chi nhánh số 5714000009F cấp ngày 17/02/2008 do UBND TP Cần Thơ, Sở kế hoạch đầu tư cấp, nghề kinh doanh: kiểm nghiệm và giám định sản phẩm, xác nhận chất lượng, cung cấp dịch vụ chứng nhận hệ thống quản lý chất lượng và sản phẩm, cấp chứng thư cho các sản phẩm, tư vấn về hệ thống, kỹ thuật phòng kiểm nghiệm

- Địa chỉ chi nhánh: M10, 11, 12, 13 Khu đô thị Nam Sông Cần Thơ, Phường Phú Thứ, Quận Cái Răng, TP Cần Thơ

- Đại diện Cty: Ông Hà Ngọc Long – Giám đốc Cty

- Phụ trách phòng kiểm nghiệm: Ông Hoàng Bá Nghị, trưởng phòng kiểm nghiệm

- Số mẫu phân tích hóa và sinh năm 2008: 15393 mẫu, 3 tháng đầu năm 2009: 2477 mẫu hóa ( mẫu thủy sản đông lạnh và đồ hộp), 1087 mẫu vi sinh (mẫu cá tra và vệ sinh công nghiệp) Mẫu do Trung Tâm vùng 6 gửi nhà thầu phụ

là Intertek chi nhánh Cần Thơ phân tích: 41 mẫu hóa

- Phòng kiểm nghiệm công ty đã được VILAS công nhận ISO 17025 :

2005 theo quyết định số 644/QĐ-CNCL ngày 31/12/2008 số hiệu VILAS 278, lĩnh vực hóa học, sinh học

- Chi nhánh gồm hai phòng, gồm phòng hành chính và phòng kiểm nghiệm (gồm hóa và vi sinh)

2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản

2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh

Kháng sinh là một nhóm chất hữu cơ phức tạp đầu tiên do vi sinh vật sản xuất ra trong lúc chúng sinh trưởng và với một lượng nhỏ có tác dụng gây hại đối với vi sinh vật khác, một số vi khuẩn, vi nấm có khả năng tạo ra kháng sinh, những kháng sinh này có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của một số vi khuẩn, virus, nấm bệnh và một số kí sinh trùng

2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản

Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản như:

- Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho thủy sản

- Kháng sinh cho vào nước để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh

- Kháng sinh cho thêm vào thức ăn thuỷ sản để bảo quản lâu hư

- Kháng sinh dùng trong thuốc thúy y thủy sản để chữa bệnh hoặc cho vào các sản phẩm thủy sản để kéo dài thời gian bảo quản

Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ

Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây kháng thuốc (Dựa theo nguồn tin Báo Nông nghiệp 12 – 10 – 2006)

2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh lên con người, vật nuôi và môi trường

- Tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc

- Tiết enzyme phân hủy thuốc

Điều 1: Ban hành kèm theo Quyết định này:

Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản nêu tại Phụ lục 1 và Danh mục hoá chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản nhằm khống chế dư lượng trong sản phẩm thuỷ sản thấp hơn giới hạn tối đa cho phép nêu tại Phụ lục 2

Điều 2: Không cho phép trộn lẫn quá 02 loại chất kháng sinh trong 01 sản phẩm thuốc, hoá chất; không cho phép trộn lẫn các hoạt chất cùng nhóm Fluoroquinolone với nhau Trong trường hợp một sản phẩm có chứa 02 loại hoạt

chất kháng sinh, cơ sở sản xuất phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn để đảm bảo trộn lẫn không làm giảm tính năng tác dụng của tứng loại và không phát sinh tác dụng xấu đối với động vật nuôi và môi trường

Mọi sản phẩm thức ăn, hoá chất tẩy rửa khử trùng, hoá chất tẩy rửa ao đầm nuôi, thuốc thú y, hoá chất bảo quản thủy sản phải ghi nhãn theo Quyết định

số 178/1999/QĐ-TTg ngày 308/1999 của Thủ tướng Chính phủ, Thông tư số 03/2000/TT-BTS ngày 22/9/2000 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản và kèm theo dòng

chữ: “Không chứa các chất cấm sử dụng theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS

ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản”

Điều 3: Quyết định này có hiệu lực thi hành sau mười lăm (15) ngày kể từ ngày đăng Công báo và thay thế Quyết định số 01/2002/QĐ-BTS ngày 22/1/2002 của Bộ Thủy sản về việc cấm sử dụng một số hoá chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh thủy sản và Danh mục thuốc thú y thủy sản hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ban hành kèm theo Quyết định số 17/2002/QĐ-BTS ngày 24/5/2002 của Bộ Thủy sản Riêng đối với các chất có số thứ tự từ 12 đến

17 tại Phụ lục 1 có hiệu lực thi hành từ ngày 1/7/2005

Điều 4: Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, an toàn vệ sinh và Thú y thủy sản chịu trách nhiệm tổ chức thực hiện và kiểm tra việc thực hiện Quyết định này

Chánh Văn phòng Bộ; Thủ trưởng các Cục, Vụ, Thanh tra Bộ; Giám đốc Trung tâm Khuyến ngư Quốc gia và Thủ trưởng các đơn vị sự nghiệp trực thuộc Bộ; Giám đốc các Sở thủy sản, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn có quản

lý Nhà nước về thủy sản; và các cá nhân, tổ chức sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu, sử dụng thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chế phẩm sinh học, vi sinh vật dùng trong hoạt động thủy sản chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này

2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký được xác định như là một qui trình, theo qui trình này chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học cúa các chất này trong một hệ thống hai hay nhiều pha Một trong các pha đó chuyển động theo hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện

độ linh động khác nhau là do sự khác nhau về: sự phân bố, sự hấp thụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan, áp suất hơi

Các chất riêng biệt được tách ra có thể xác định bằng các phương pháp phân tích Kỹ thuật chung của sắc kí đòi hỏi chất tan phải được phân bố giữa hai pha:

- Một pha là cố định gọi là pha tĩnh

- Một pha chuyển dịch được gọi là pha động

- Buồng tiêm mẫu

- Bộ phận phát hiện hay đầu dò (detector)

· Đầu dò dẫn nhiệt

· Đầu dò ion hóa ngọn lửa

· Đầu dò nhiệt ion hóa

Trong cột sắc kí xảy ra quá trình tách chất Mỗi chất đi qua cột với thời gian lưu nhất định Các chất trong cột được tách ra do ái lực của nó với chất áo trên cột Ái lực của chất với cột mạnh thì nó sẽ bị giữ lại trong cột lâu, thời gian lưu dài, chất có ái lực với cột nhỏ sẽ được khí mang ra khỏi cột trước, thời gian lưu nhỏ Trong cột sắc kí, các chất tách ra phụ thuộc rất nhiều vào quá trình thay đổi nhiệt độ (lập trình nhiệt) Nếu lập trình nhiệt không hợp lý các peak sẽ rất gần nhau rất khó đọc

Các chất tách ra từ cột lần lượt được đưa đến đầu dò gọi là Detector là một máy biến năng chuyển bứa xạ điện tử thành tín hiệu điện

Dòng tín hiệu từ đầu dò đi ra được khuếch đại đưa vào hệ thống ghi nhận kết quả và hiển thị trên màng hình máy vi tính

2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC

2.4.2.1 Sơ lược về hệ thống máy – nguyên tắc, cấu tạo của hệ thống máy

Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, chúng ta phải có hệ thống trang bị về kỹ thuật này Hệ thống trang bị của HPLC đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau đây:

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống máy HPLC (1)- Bình chứa dung môi động; (2)- Bơm cao áp; (3)- Bộ phận tiêm mẫu; (4)-Cột HPLC; (5)- Detector; (6)- Máy ghi

nhận tín hiệu

a) Bình đựng dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Trong trường hợp rửa giải thường (isocratic) chỉ cần một bình dung môi Trong trường hợp rửa giải gradient: thường dùng 2, 3, 4…bình dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp các dung môi trên được trộn trong quá trình sắc ký với tỷ lệ biến đổi theo chương trình đã định và có bộ phận đuổi khí dung môi trước khi vào cột

b) Bơm cao áp

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar), để tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký nằm trong vùng 0.5 – 3 ml/phút

c) Bộ phận bơm mẫu

Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50 hay 100ml Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu nhưng đối với van

10 chiều thì có tới 3 vòng mẫu

d) Cột HPLC

Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột tách có nhiều

cỡ khác nhau, tùy thuộc vào mức độ sắc ký Nói chung, các cột tách phân tích

thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong từ 2 – 5 mm

e) Trang bị phát hiện chất phân tích (detector)

Đây thường là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví

dụ:

- Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV–VIS

- Detector phổ nguyên tử AES hay AAS

- Detector phổ huỳnh quang

- Detector điện hóa (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng)

- Detector chiết suất

- Detector đo độ dẫn nhiệt…

- Detector diode phát quang và diode mảng

- Detector đo khối lượng (khối phổ: MS)

Tất nhiên, phải tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như đo định lượng chúng

f) Trang bị chỉ thị kết quả

Ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả

Đó là 6 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC Ngày nay, hệ thống HPLC còn có thêm bộ chương trình gradient dung môi (pha

động), bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống để xử lý kết quả tách, in kết quả tách…

2.4.2.2 Pha động và pha tĩnh trong HPLC

a) Pha tĩnh trong HPLC

Pha tĩnh (Stationary phase) trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 – 10 mm, diện tích

bề mặt riêng thường từ 50 –500 m2/g Pha tĩnh, ta chia nó ra làm nhiều loại như: pha tĩnh loại hấp phụ, phân bố, trao đổi ion

Pha tĩnh trong HPLC cũng phải thỏa mãn những điều kiện cơ bản sau đây:

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không

có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm bảo cơ chế của sự tách theo đúng bản chất chính của pha tĩnh, không mất chất phân tích cần tách

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt có đặc trưng độ xốp của nó và không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình tách sắc ký

- Cân bằng động của quá trình tách sắc ký phải xảy ra nhanh và lập lại tốt Có như thế mới đảm bảo thu được kết quả tách tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của các hạt lớn nhất so với các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10%, và trên 85% số hạt phải nằm trong vùng kích thước trung bình Có như thế cột tách mới có hiệu lực cao

Đó là các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật tách HPLC

b) Pha động trong kỹ thuật HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ đơn, như methanol, acetonitrile, benzene, n-hexane, nước hay cũng có thể là hỗn hợp của 2 hoặc 3 dung môi được trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp Ví dụ hỗn hợp của methanol với nước (MeOH + H2O) trong

tỷ lệ 70/30 (V/V), acetonitrile với nước (CH3CN + H2O) trong tỷ lệ 80/20 (V/V),…Nó cũng có thể là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo

phức, chất làm chậm,…với nồng độ nhất định Nói chung, với mỗi loại sắc ký sẽ

có các hệ dung môi (pha động: MP) rửa giải riêng phù hợp với nó, để có thể thu được hiệu quả tách tốt nhất

Trong kỹ thuật HPLC pha động cần phải thỏa mãn một số điều kiện sau đây:

- Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất

kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình tách

- Pha động phải hòa tan được chất mẫu Có như thế mới làm cho chất mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột tách (lúc nạp mẫu vào) đến cuối cột tách (lúc chất mẫu ra khỏi cột tách), khi thực hiện quá trình rửa giải (sắc ký)

- Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được trong quá trình sắc ký Nghĩa là nó không bị phân hủy hay thay đổi không theo ý muốn khi chạy sắc ký

- Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả tách Nghĩa là các chất để pha chế pha động phải có độ tinh khiết cao Vì thế, người ta thường dùng các loại hóa chất có

- Điều kiện cuối cùng là pha động đó phải có tính chất kinh tế, không hiếm, không quá đắt Tất nhiên, yếu tố này trong sắc ký điều chế có ý nghĩa rất lớn, nhưng trong phân tích, không ít trường hợp ta phải chấp nhận pha động đắt tiền để đảm bảo kết quả phân tích chính xác theo yêu cầu đặt ra, đặc biệt là việc phân tích lượng vết bên cạnh một lượng lớn chất khác

Đó là các yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách HPLC cho sự tách và phân tích một hỗn hợp mẫu nhất định Tất nhiên, các điều kiện đó cần được xem xét cụ thể trong mỗi trường hợp của hỗn hợp mẫu phân tích, để xem có thể bỏ qua được yếu tố nào, từ đó chọn một pha động tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu

2.4.2.3 Một số yêu cầu đối với detector dùng trong kỹ thuật HPLC

Detector cần phải thoả mãn được một số yêu cầu sau đây, mới có thể dùng được trong kỹ thuật HPLC

- Có tính chất chọn lọc cho chất phân tích hay một nhóm các chất phân tích, độ chọn lọc càng cao càng tốt

- Có độ nhạy cao đối với chất phân tích trong hỗn hợp mẫu Có như thế mới phát hiện và đo định lượng được các nồng độ nhỏ

- Phải hoạt động ổn định và bền vững với những điều kiện nhất định của

hệ pha trong quá trình sắc ký

- Vùng tuyến tính động học của phép đo không quá nhỏ Nghĩa là càng rộng càng tốt cho việc phát hiện và định lượng được các chất trong một vùng nồng độ rộng

- Không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng của các tác động của môi trường xung quanh, như độ ẩm, áp suất, nhiệt độ

- Không quá phức tạp,không khó sử dụng và không quá đắt tiền

- Độ nhiễu tự thân của detector phải nhỏ

- Ngày nay, có rất nhiều loại detector đã thoả mãn được những yêu cầu trên và đã được đưa vào sử dụng phổ biến với kết quả tốt

2.4.2.4 Phép ghi phổ khối lượng

a) Nguyên lí máy phổ khối lượng

Nói một cách đơn giản, máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (làm bay hơi mẫu nghiên cứu ở áp suất thấp và nhiệt độ thích hợp); tạo ra các ion từ các phân tử khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng / điện tích (m/z) của chúng Bởi vì, xác suất tạo thành các ion có z >1 là rất nhỏ và vì e = const (e

là điện tích của một electron), do đó thông thường m/z là khối lượng của ion Như thế, máy phổ khối lượng là một thiết bị “ sản suất “ ra các ion xác định khối lượng của chúng (phân tích các ion)

Về mặt nguyên lí hoạt động, có thể sơ đồ hóa một máy phổ khối lượng thành bốn khối: 1) Khối làm bay hơi mẫu, 2) Khối tạo ra các ion, 3) Khối phân tách các ion và 4) Khối thu nhận tín hiệu các ion, khuếch đại rồi ghi thành phổ Tất nhiên, máy phổ khối lượng phải được nối với máy tính để tự động hóa, để tăng hiệu quả sử dụng và khai thác các kết quả thu được

b) Nguyên tắc

Nguyên tắc là bằng một hiện tượng hóa lý thích hợp, ion được sinh ra từ một phân tử hóa chất ban đầu Các ion này được tách ra tùy theo khối lượng và điện tích của ion, rồi được hứng bằng một hệ thống vật lý thích nghi về một bộ

phận thu ion Dòng điện sinh ra từ các ion được khếch đại và được ghi nhận dưới dạng mũi ion trên một giản đồ cường độ mũi theo m/z (m: là khối lượng và z: là điện tích ion) Nếu z = 1 thì đó là giản đồ của tập hợp các mũi theo khối lượng

Từ đó khối phổ được gán cho giản đồ này Hiện nay, khối phổ thường được biểu diễn dưới dạng giản đồ vạch

Khối phổ cho biết khối lượng của phân tử và khối lượng của các mảnh vỡ được tạo ra từ nó Trong giản đồ MS trên, trục hoành chỉ khối lượng (thực tế là m/z, tỉ số của khối lượng đối với điện tích của ion), còn trục tung chỉ cường độ tương đối

2.4 3 Giới thiệu hệ thống AAS

2.4.3.1 Nguyên tắc của phép đo AAS

Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích

từ trạng thái ban đầu thành trạng thái hơi của nguyên tử tự do Đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu Nhờ đó ta có được đám hơi của các nguyên tử tự

do của nguyên tố trong mẫu phân tích

Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó

Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ thu toàn bộ chùm sáng , phân li

và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của

nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử

Thông thuờng có các kỹ thuật nguyên tử hóa trong hấp thu nguyên tử:

a Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa khí cháy (FAAS: flame atomic

absorption spectrometry)

b Nguyên tử hóa dùng lò nhiệt điện (electrothermal hay ET) mà phương

tiện hay dùng là lò graphic (graphite furnace), có thể gọi phương pháp này là AAS hay GF-AAS

ET-c Nguyên tử hóa thông qua việc tạo các hơi hydrua dễ nguyên tử hóa

(HGAAS: hydride generation atomic absorption spectrometry)

d Nguyên tử hóa qua phản ứng hóa học ở nhiệt độ thấp, CV-AAS (cold

900oC, tại đây hơi AsH bị phân hủy và As được nguyên tử hóa để cho tín hiệu hấp thu

Chương III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Các phương pháp và phương tiện thực nghiệm

3.1.1 Các phương pháp

Ø Phương pháp tổng kết kinh nghiệm:

- Nhận đề tài

- Sưu tầm và đọc tài liệu

- Xây dựng cơ sở lý thuyết

- Thực tập tại công ty và viết bài

3.1.2 Phương tiện thực hiện

- Các tài liệu có liên quan

- Sưu tầm tài liệu

- Nghiên cứu các tài liệu có liên quan

- Thực tập tại công ty để tìm hiểu các phương pháp kiểm kháng sinh, kim loại nặng

- Rút ra qui trình phân tích

- Viết bài báo cáo

3.3 Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 02/2009 đến 05/2009

Chương IV: KẾT QUẢ

Qua quá trình tìm hiểu các phương pháp kiểm nghiệm tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ trên mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản thu được một

số phương pháp phân tích kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng trên nền mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản

4.1 Một số phương pháp kiểm các nhóm kháng sinh

4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol

ĐỊNH LƯỢNG CLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG

SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS

1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng cloramphenicol trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.08ppb

2 Nguyên tắc

Cloramphenicol được chiết tách từ mẫu thủy sản bằng etylacetat, cô dịch chiết bằng khí nitơ ở 50oC, cặn khô được hòa tan trong dung dịch acid acetic 0.05%, sau đó được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (SPE C18) Hàm lượng cloramphenicol được xác định bằng LC/MS/MS Giới hạn phát hiện

là 0.08ppb

3 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động

- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)

- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3

- Cột LC: Waters brand Xterra C18 kích thước 2.1 x 150mm, kích thước hạt 3.5mm

- Máy Vortex, máy lắc

- Bộ thổi khí nitơ N – EVAP

- Cột SPE: C18 Varian Bond Elul 6cc/500mg

- Một số hóa chất sử dụng cho HPLC như: acetonitrile, ethyl acetate, ammonium hydroxide (NH3 30%), axit acetic

- Màng lọc Acrodisc (đường kính màng 13mm, đường kính lỗ 0.45mm)

4 Hóa chất

5 Dung dịch nội chuẩn

Dung dịch nội chuẩn sử dụng là meta – cloramphenicol (m – CAP)

5.1 Dung dịch nội chuẩn gốc m-CAP 100ppm: Cân 1 lượng tương đương 5mg nội chuẩn m-CAP bằng cân phân tích, chuyển vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng acetonitrile (ACN)

5.2 Dung dịch nội chuẩn trung gian 1ppm hay 1000ppb: Hút chính xác 0,1ml dung dịch nội chuẩn gốc (5.1) 100ppm vào bình định mức 10ml và định mức bằng ACN tới vạch

5.3 Dung dịch nội chuẩn làm việc 20ppb: Hút chính xác 5ml dung dịch nội chuẩn trung gian (5.2) 1000ppb vào bình định mức 250ml và định mức tới vạch bằng nước Mỗi 10g mẫu bổ sung thêm 150ml dung dịch nội chuẩn bổ sung 20ppb để được nội chuẩn có nồng độ là 0,3ppb

6 Dung dịch chuẩn cloramphenicol

6.1 Dung dịch chuẩn gốc cloramphenicol 100ppm: Cân 1 lượng tương đương 5mg chuẩn CAP bằng cân phân tích, chuyển vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng acetonitrile (ACN)

6.2 Dung dịch chuẩn trung gian 1ppm hoặc 1000ppb: Hút chính xác 0,1ml dung dịch chuẩn gốc (6.1) 100ppm vào bình định mức 10ml và định mức bằng nước tới vạch

6.3 Dung dịch chuẩn trung gian 100ppb: Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn trung gian (6.2) 1000ppb cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch bằng nước

6.4 Dung dịch chuẩn làm việc 20ppb: Hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn trung gian (6.3) 100ppb cho vào bình định mức 250ml và định mức tới vạch bằng nước

7 Các bước chuẩn bị mẫu

7.1 Chuẩn bị mẫu thử: Bóc vỏ nguyên liệu (nếu có) cho vào máy xay mẫu và xay nhuyễn cho đến khi mẫu đồng nhất

Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, thêm 150ml nội chuẩn m-CAP 20ppb

7.2 Chuẩn bị mẫu trắng: Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, thêm 150ml nội chuẩn m-CAP 20ppb Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như mẫu thử

7.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn

Cân lần lượt 5 mẫu trắng có khối lượng 10g vào ống ly tâm 50ml, bổ sung dung dịch chuẩn và nội chuẩn như sau:

Bảng 4.1 Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn m-CAP thêm vào để dựng đường chuẩn

0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

7.4 Cho thêm 20ml hỗn hợp (EtOAC:NH4OH, 98:2) đồng nhất bằng cách vortex cho đến khi toàn bộ khối mẫu rời ra (khoảng 30 giây) Trộn đều trên máy Multitube Vortex trong 10 phút

7.5 Ly tâm 7 phút ở tốc độ 4000 rpm, chuyển phần dung dịch vào ống ly tâm PP 50ml khác Thổi khí nitơ ở nhiệt độ 50oC

7.6 Lặp lại quá trình ly trích theo bước 7.4 và 7.5 hai lần

7.7 Làm khô hoàn toàn dịch chiết bằng khí nitơ

7.8 Thêm 30ml acid acetic 0.05% trong nước cho vào dịch trích đã được làm khô, vortex khoảng 5 phút

7.9 Thêm 10ml hexan vào ống 50ml và đậy nắp lại Vortex Ly tâm 3 phút ở 4000 rpm Dùng ống hút pipet để loại phần hexan trên mặt Lặp lại bước khử béo trên 2 lần với mỗi lần 5ml hexan và cuối cùng hút bỏ hết phần chất lỏng trên mặt phân cách giữa hexan và nước

7.10 Hoạt hóa cột SPE C18 bằng 3ml metanol và 3ml nước Chuyển phần dung dịch sau ly trích vào hệ thống cột SPE, tốc độ chảy khoảng 1 giọt/giây

7.11 Rửa giải cột với 2ml nước, giải hấp bằng 2ml MeOH vào trong ống

ly tâm 15ml Làm bay hơi MeOH bằng khí nitơ

7.12 Hỗn hợp ly trích sau khi làm khô được hòa tan lại bằng 0.5ml nước, vortex 5 phút để hòa tan phần còn lại và dùng ổng tiêm lọc qua màng lọc Acrodisc, cho vào vial để phân tích trên LC-MS

8 Thông số chạy máy

Pha động A: Nước

Pha động B: Acetonitrile

Gradient Program

Bảng 4.2 Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP

No Time, min Flow, ml/min A, % B, %

Column oven control is on Temp (oC): 30

Max pressure, bar: 400

9 Điều kiện phân mảnh MS/MS

- X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/m-CAP) cho dung dịch mẫu thử

- C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn, tính theo ng/g

- W là khối lượng mẫu thử, tính theo g

- Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/m-CAP trong dung dịch các chuẩn

- V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử tính theo ml

Dựng đồ thị hàm lượng CAP trong từng mẫu phân tích với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính

RF = ax + b

a: hệ số góc của đường chuẩn

b: tung độ gốc của đường chuẩn

Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu kiểm dựa theo hệ số tính hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn theo đơn vị ppb

4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LEUCOMALACHITE GREEN BẰNG SẮC KÝ LỎNG

GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS

1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp này hướng dẫn việc xác định dư lượng Leucomalachite Green và Malachite Green trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1ppb

2 Nguyên tắc

MG và LMG được trích bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng methylene chloride LMG sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm

3 Thiết bị, dụng cụ

3.1 Thiết bị

- Hệ thống LC-MS bao gồm:

- LC 1100 Agilent

- MS với nguồn ESI hoặc APCI

- Phần mềm điều khiển Xcaliber ( Version 1.3)

p-4.2.3 Dung dịch 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ): từ dung dịch chuẩn DDQ được pha loãng trong acetonitrile để được dung dịch làm việc DDQ 0.001M

4.2.4 Một số dung dịch khác

- Diethylene glycol

- Alumina

- Hydroxyamine hydrochloride 0.25g/ml

- Dung dịch p-TSA 1M trong nước

4.2.5 Dung dịch chuẩn gốc Malachite Green (MG) 100ppm: Cân 10g chuẩn MG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol

4.2.6 Dung dịch chuẩn trung gian MG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc MG (4.2.5) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol

4.2.7 Dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn trung gian MG (4.2.6) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol

4.2.8 Dung dịch chuẩn gốc Leucomalachite Green (LMG) 100ppm: Cân 10g chuẩn LMG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol

4.2.9 Dung dịch chuẩn bố sung LMG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.8) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol

4.2.10 Dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.9) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol

5 Các bước chuẩn bị mẫu

Mẫu được đồng nhất trước khi tiến hành ly trích, bảo quản mẫu bằng nước

đá khô hoặc trữ đông ở -20oC đến khi phân tích

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

Cân 5g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Cân 5g mẫu không chứa MG và LMG cho vào ống ly tâm 50ml

5.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn

Chuẩn bị lần lượt 6 mẫu trắng mỗi mẫu 5g cho vào ống ly tâm 50ml và bổ sung dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb và dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb để được dãy đường chuẩn có nồng độ lần lượt là 0, 1, 2, 4, 10 và 20ppb

Bảng 4.3 Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn

Sau đó tiến hành ly trích mẫu qua các bước sau:

- Thêm vào các ống nhựa chứa mẫu 5ml dung dịch đệm acetate, 100ml dung dịch p-TSA 1M, 1ml hydroxyamine (0.25g/ml) Lắc đều

- Thêm 25 ml acetonitrile, lắc 30 giây Sau đó thêm tiếp 5 – 6g alumina

và lắc tiếp 15 giây Ly tâm 4000rpm ở 0oC Chuyển dịch trong vào bình chiết thủy tinh 250 ml đã chứa sẵn 50 ml nước và 2 ml diethylene glycol

- Thêm 25 ml acetonitrile vào ống chứa mẫu Chuyển dịch trong vào cùng bình chiết thủy tinh 250 ml ở bước trên

- Thêm 25 ml methylene chloride vào trong bình chiết Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp Chuyển lớp methylene chloride (ở dưới) vào trong bình cầu quả

- Cho qua hệ thống chiết pha rắn với alumina và acid propylsulfonic với tốc độ 4ml/min

- Rửa cột bằng acetonitrile và MG được rửa giải bằng 4ml dung dịch đệm acetonitrile: ammonium acetate (50:50) và định mức lên 5ml cho mỗi mẫu

- Cho vào vial để phân tích trên máy bằng LC/MS/MS

6 Thông số chạy máy

Pha động A: Acid formic 0.1%

6.2 Điều kiện phân tích trên MS

7 Điều kiện phân mảnh

Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z)

3 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động

- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)

- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3

- Cột LC: Inertsil ODS-3 5m 130 x 2.0mm

- Tiền cột: ODS-3 5m 130 x 2.0mm

- Máy Vortex, máy lắc

- Bộ thổi khí nitơ N – EVAP