TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TPHCM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHIẾT XUẤT VÀ SO SÁNH HÀM LƯỢNG SAPONIN CỦA LOÀI BẢY LÁ MỘT HOA PHÍA NAM (Paris polyphylla var yunamensis) VÀ LOÀI BẢY LÁ MỘT HOA PHÍA BẮC (Paris polyphylla var chinensis) Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành D420201 Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện BÙI TRUNG THÔNG Mã số sinh viên 13126301 Niên khóa 2013 2017 Tháng 08 năm 2017 i LỜI.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP Hồ Chí Minh, có địa chỉ tại 41 Đinh Tiên Hoàng, Phường Bến Nghé, Quận 1 Thời gian thực hiện đề tài kéo dài từ tháng 01/2017 đến tháng 07/2017.
Vật liệu nghiên cứu
Loài Bảy lá một hoa được thu hái từ các vùng phía Nam (Kon Tum) và phía Bắc Dược liệu này sau khi thu hoạch được phơi khô và nghiền mịn theo tiêu chuẩn dược liệu Một phần của dược liệu được lưu trữ tại trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM.
Hình 3.1 Đối tượng nghiên cứu phía Nam
A: Thân rễ loài Bảy lá một hoa ở phía Nam
B: Bột dược liệu loài Bảy lá một hoa ở phía Nam
Hình 3.2 Đối tượng nghiên cứu phía Bắc
A:Thân rễ loài Bảy lá một hoa ở phía Bắc
B: Bột dược liệu loài Bảy lá một hoa ở phía Bắc
- Tủ sấy, Cân điện tử
- Dụng cụ chứa: hũ thũy tinh, becher
- Bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck)
- Ống đong các loại, pipet các loại, ống bóp cao su
- Bông thủy tinh (có thể thay thế bằng bông gòn thông thường)
- Máy cô quay BUCHI (Đức)
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
3.3.1.1 Xác định độ tinh khiết nguyên liệu
Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Sử dụng chén cân có nắp mài để xác định khối lượng bì, sau đó sấy ở nhiệt độ 105°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi Tiếp theo, cân khoảng 1 g dược liệu cho vào bì và sấy ở 105°C trong tủ sấy dưới áp suất thường trong 4 giờ Sau khi sấy, để mẫu nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút trước khi cân ngay Tiến hành sấy tiếp và cân sau mỗi 2 giờ, lặp lại cho đến khi khối lượng không thay đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,5 mg) Quy trình này được thực hiện 3 lần để đảm bảo độ chính xác Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: a 100% b.
X: độ ẩm mẫu (%) a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g) b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g)
Xác định độ tro toàn phần của nguyên liệu
Đầu tiên, nung một chén bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, sau đó để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén Tiếp theo, cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu vào chén, trải đều mẫu và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn Sau đó, đưa chén vào lò nung ở nhiệt độ 550 oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn, khi tro không còn màu đen Để nguội trong bình hút ẩm và cân lại, sau đó đặt chén vào lò nung tiếp và tiếp tục cân sau 2 giờ Quy trình này lặp lại cho đến khi khối lượng chênh lệch giữa hai lần cân không quá 0,5 mg, và được thực hiện 3 lần Cuối cùng, tro toàn phần được tính theo công thức: h) 100%.
A: Độ tro toàn phần (%) a: Khối lượng chén có tro (g) b: Khối lượng chén không tro (g) c: Khối lượng mẫu (g) h: Độ ẩm của mẫu (%)
Xác định độ tro không tan trong acid clohydric của nguyên liệu
Để xác định tro không tan trong acid, lấy chén nung chứa tro toàn phần, thêm 25 ml acid hydrochloric 2 M, và đun sôi trong 10 phút trước khi để nguội Sau đó, lọc chất không tan qua phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc giấy lọc không tro, và rửa bằng nước cất nóng cho đến khi dịch lọc có phản ứng trung tính Tiếp theo, cho giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt và nung ở 550 °C trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm và cân, sau đó nung đến khối lượng không đổi Quy trình này được lặp lại 3 lần, và tro không tan trong acid được tính theo công thức.
X: tro không tan trong acid của dược liệu (%) a: khối lượng chén có mẫu (g) b: khối lượng chén không (g) c: khối lượng mẫu dùng (g)
3.3.1.2 Định tính xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu Định tính xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu bằng phương pháp hóa học
Chiết 1 g bột dược liệu với cồn 80% bằng cách đun hồi lưu trong 30 phút rồi lọc
Cô bốc hơi dịch lọc cho đến cắn Dùng cắn đề làm thử nghiệm tính tạo bọt và phản ứng Liebermann - Burchard
Để thực hiện phản ứng tạo bọt, hòa tan cắn vào 5 ml nước nóng, sau đó lọc vào ống nghiệm và để nguội Tiếp theo, thêm nước cho đủ 10 ml và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (30 lần lắc) Cuối cùng, để yên ống nghiệm và quan sát lớp bọt để đánh giá kết quả.
Phản ứng Liebermann - Burchard là phương pháp xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu Để thực hiện, hòa tan cắn trong 1 ml anhydride acetic, sau đó thêm 0,5 ml chloroform Sử dụng pipet Pasteur, cẩn thận thêm 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc xuống đáy ống nghiệm Phản ứng dương tính khi mặt ngăn cách giữa hai lớp có màu từ nâu đỏ tới đỏ tím Để định tính xác định hợp chất saponin, sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các điều kiện sắc ký thích hợp.
Bản mỏng Silicagel tráng sẵn 60F254 Merck
Dịch chấm sắc ký: lấy 1 mg cắn n-Butanol của nguyên liệu và cao chiết cồn hòa tan trong 1 ml methanol làm dịch chấm
Dung môi khai triển: CH2Cl3 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2)
Chấm các dung dịch thử lên một bản mỏng riêng biệt Sau khi triển khai, để bản mỏng khô Tiếp theo, phun thuốc thử 10% H2SO4 trong cồn và sấy ở nhiệt độ thích hợp.
105 o C đến khí xuất hiện vết Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường
3.3.1.3 Định lượng hợp chất saponin toàn phần trong nguyên liệu bằng phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 5 g nguyên liệu và chiết xuất hoạt chất bằng phương pháp chiết siêu âm với cồn 80%, đảm bảo dịch chiết không còn vết màu tím sau khi thử với H2SO4 10% Sau đó, dịch chiết được cô đặc và hòa với 10 ml nước, lắc với diethyl ether cho đến khi hết màu, rồi thu lấy pha nước Tiếp theo, dịch nước lắc với n-Butanol bão hòa nước, rửa n-Butanol bằng nước cất 3 lần và cô bốc hơi để thu được dịch n-Butanol Cuối cùng, tập trung dịch n-Butanol đến cắn và sấy khô ở 105°C đến khối lượng không đổi Quy trình này được lặp lại 3 lần để tính hàm lượng saponin theo dược liệu khô tuyệt đối.
X: Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%)
A: khối lượng cắn saponin thu được (g) d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%)
M: khối lượng dược liệu đem chiết (g)
3.3.2 Chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ thân rễ 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam
3.3.2.1 Chiết xuất cao tổng phương pháp chiết ngấm kiệt
Chiết ngấm kiệt 1300 g nguyên liệu phía Bắc bằng 17,5 lít dung môi cồn 80% Đầu tiên, làm ẩm nguyên liệu với 500 ml cồn 80%, sau đó cho vào bình ngấm kiệt, thêm 2 lít cồn 80% và ngâm trong 24 giờ Tiếp theo, thêm dung môi và rút dịch chiết với tốc độ 30 ml/phút cho đến khi kiệt hoạt chất, xác định bằng cách phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn trên bản sắc ký, khi dịch chiết không còn vết màu tím Cuối cùng, dịch chiết được cô quay ở 70 o C để thu được cao tổng.
3.3.2.2 Chiết các cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng
Cân chính xác 200 g cao toàn phần và hòa với nước Lắc dịch nước với diethyl ether cho đến khi ether không còn màu Tiến hành cô đặc dịch ether dưới áp suất giảm ở 45 độ C để thu được cao diethyl ether Tiếp tục lắc dịch nước với ethyl acetate cho đến khi không còn xuất hiện vết màu xanh đen sau khi phun thuốc thử.
Dịch chiết FeCl3 5% trong cồn được xử lý qua sắc ký Sau khi cô quay dịch ethyl acetate ở 60°C, thu được cao ethyl acetate Tiếp theo, dịch nước được lắc với n-Butanol bão hòa nước cho đến khi không còn vết màu tím khi thử với H2SO4 10% trong cồn Cô quay dịch n-Butanol ở 80°C thu được cao n-Butanol, và cuối cùng, dịch nước được cô quay ở 80°C để thu được cao nước.
3.3.3 Tiêu chuẩn hóa cao tổng
3.3.3.1 Xác định độ tinh khiết cao tổng
Để xác định độ tinh khiết cao của tổng, cần thực hiện việc xác định độ ẩm và độ tro toàn phần theo phương pháp đã được trình bày trong mục 3.3.1.1.
3.3.3.2 Định tính xác định hợp chất saponin trong cao tổng
Thực hiện tương tự theo phương pháp được trình bày ở mục 3.3.1.2
3.3.3.3 Định lượng saponin toàn phần trong cao tổng bằng phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao và hòa với 20 ml nước, sau đó lắc dịch nước với diethyl ether cho đến khi hết màu Tiếp theo, lắc dịch nước với n-Butanol bão hòa nước và rửa dịch n-Butanol bằng nước cất ba lần Tập trung dịch n-Butanol cô lại đến cắn và sấy khô cắn n-Butanol ở 105°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi rồi cân Quy trình này được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trong cao được tính theo công thức.
X: Hàm lượng saponin toàn phần trong cao (%)
A: khối lượng cắn saponin thu được (g) d: độ ẩm của cao (%)
