Cân chính xác khoảng 200 g cao toàn phần đem hòa với nước. Dịch nước thu được lắc với diethyl ether (đến khi dịch diethyl ether hết màu) .Tập trung dịch ether cô quay giảm áp ở 45oC thu được cao diethyl ether. Dịch nước lắc tiếp với athyl acetate đến khi dịch acetate không con xuất hiện vết màu xanh đen sau khi phun thuốc thử FeCl3 5% trong cồn trên bản sắc ký. Dịch ethyl acetate dêm đi cô quay ở 60oC thu được cao ethyl acetate. Dịch nước tiếp tục lắc với n-Butanol bão hòa nước đến khi dịch chiết không còn vết màu tím sau sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn trên bản sắc ký. Cô quay dịch n-Butanol thu được ở 80oC thu được cao n-Butanol. Dịch nước cuối cùng được cô quay ở 80oC thu được cao nước.
3.3.3. Tiêu chuẩn hóa cao tổng
3.3.3.1. Xác định độ tinh khiết cao tổng
Xác định đọ tinh khiết cao của tổng bao gồm xác định độ ẩm và xác định độ tro toàn phần thực hiện tương tự theo phương pháp được trình bày ở mục 3.3.1.1
3.3.3.2. Định tính xác định hợp chất saponin trong cao tổng
Thực hiện tương tự theo phương pháp được trình bày ở mục 3.3.1.2
3.3.3.3. Định lượng saponin toàn phần trong cao tổng bằng phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao, hòa với 20 ml nước, dịch nước được lắc với diethyl ether đến khi hết màu. Dịch nước lắc với n-Butanol bão hòa nước, rửa dịch n-Butanol bằng nước cất 3 lần. Tập trung dịch n-Butanol cô đến cắn. Sấy khô cắn n-Butanol ở 1050C đến khối lượng không đổi và cân. Quy trình được lặp lại 3 lần. Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần có trong cao được tính theo công thức:
d) (M M 100 A X Trong đó:
X: Hàm lượng saponin toàn phần trong cao (%). A: khối lượng cắn saponin thu được (g).
d: độ ẩm của cao (%). M: khối lượng cao (g).
22
Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
4.1.1. Kết quả độ tinh khiết trong nguyên liệu 4.1.1.1. Độ ẩm nguyên liệu 4.1.1.1. Độ ẩm nguyên liệu
Bảng 4.1 Kết quả độ ẩm nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 7,42 11,19
2 7,35 11,25
3 7,27 11,24
Độ ẩm trung bình 7,35 ± 0,0075 11,22 ± 0,03
Độ ẩm trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 7,35% với SD =0,075 và RSD = 0,001. Độ ẩm trung bình của nguyên liệu phía Nam là 11,22% với SD = 0,03 và RSD = 0,27. Độ ẩm của nguyên liệu phía Bắc thấp hơn so với nguyên liệu phía Nam và trong giới hạn cho phép tiêu chuẩn dành cho dược liệu (<13%) cho phép theo DĐVN IV.
4.1.1.2. Độ tro toàn phần nguyên liệu
Bảng 4.2 Kết quả độ tro toàn phần trong nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 3,46 3,09
2 3,48 3,29
3 3,57 3,21
Độ tro trung bình 3,50 ± 0,059 3,23 ± 0,1
Độ tro trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 3,5%, với SD = 0,059 và RSD = 0,018. Độ tro trung bình của nguyên liệu phía Nam là 3,23%, với SD = 0,1 và RSD = 0,031.Độ tro toàn phần trung bình của 2 loài thấp, trong cao phía Nam có độ tro toàn phần trung bình thấp hơn so với phía Bắc.
23
4.1.1.3. Độ tro không tan trong acid clohydrid trong nguyên liệu
Bảng 4.3 Kết quả độ tro không tan trong acid clohydrid nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 0,70 0,36
2 0,58 0,38
3 0,63 0,36
Độ ẩm trung bình 0,64 ± 0,06 0,37 ± 0,01
Độ tro không tan trong acid hydrochloric trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 0,64% với SD = 0,06 và RSD = 0.09 . Độ tro không tan trong acid hydrochloric trung bình của nguyên liệu phía Nam là 0,37% với SD = 0,01 và RSD = 0,03. Độ tro không tan trong acid clohydrid trung bình của cao phía Nam thấp hơn cao phía Bắc.
4.1.2. Kết quả định tính xác định sự hiện diện của saponin trong nguyên liệu 4.1.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
Hình 4.1 Phản ứng Liebermann - Burchard.
A: Bảy lá một hoa phía Bắc B: Bảy lá một hoa phía Nam Ống 1: ống trắng, Ống 2: có mẫu
Phản ứng Liebermann - Burchard xuất hiện vòng ngăn cách giữa 2 lớp có màu nâu đỏ nên cũng kết luận phản ứng dương tính chứng tỏ rằng có sự hiện diện saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa.
1 2 1 2
24
Hình 4.2 Phản ứng tạo bọt.
1: Bảy lá một hoa phía Bắc , 2: Bảy lá một hoa phía Nam Ống A: ống trắng, Ống B: có mẫu
Phản ứng tạo bọt xuất hiện lớp bọt bền trên 30 phút nên kết luận phản ứng dương tính chứng tỏ rằng có sự hiện diện saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa.
4.1.2.2 Định tính saponin trong nguyên liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng
Hình 4.3 Sắc ký lớp mỏng định tính saponin trong nguyên liệu.
A: hệ CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) (8 : 2), B: hệ n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2) 1 : Nguyên liệu phía Bắc, 2 : Nguyên liệu phía Nam
Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) có xuất hiện các vết màu tím có giá trị Rf tương đồng là 0,62 và 0,52. Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi hệ n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2) có xuất hiện các vết màu tím có giá trị tương đồng Rf = 0,35 và Rf = 0,52 trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và
Rf = 0,35 Rf = 0,52 A B A B Rf = 0,62 A B A 1 2 Rf = 0,62 Rf = 0,52 1 2 1 2
25
phía Nam. Chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong nguyên liêu 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam. Tuy nhiên trong nguyên liệu của loài Bảy lá một hoa phía Bắc có sự xuất hiện của vệt tím với Rf = 0,625 nên có sự khác biệt giữa thành phần saponin trong 2 loài này.
4.1.3. Định lượng hợp chất saponin toàn phần trong nguyên liệu bằng phương pháp cân
Bảng 4.4 Hàm lượng saponin trong nguyên liệu Lần lặp lại
Hàm lượng saponin trong nguyên liệu
phía Bắc (%)
Hàm lượng saponin trong nguyên liệu
phía Nam (%) 1 6,70 6,89 2 6,79 6,82 3 6,64 7,05 Hàm lượng saponin trung bình 6,71 ± 0,045 6,92 ± 0,12
Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung bình có trong nguyên liệu phía Bắc là 6,71% với SD = 0,045 và RSD = 0,006.
Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung bình có trong nguyên liệu phía Nam là 6,92% với SD = 0,12 và RSD = 0,017.
Hàm lượng saponin toàn phần trung bình trong nguyên liệu phía Bắc thấp hơn 0,21% so với hàm lượng saponin toàn phần trung bình ở phía Nam.
4.2 Kết quả chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ Bảy lá một hoa phía Bắc và Bảy lá một hoa phía Nam Bảy lá một hoa phía Nam
Từ 1300 g dược liệu Bảy lá một hoa phía Bắc ban đầu, bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với 17,5 lít dung môi cồn 80% thu được 250 g cao tổng. Cao tổng phía Nam được trung tâm Sâm và dược liệu tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
26
Bảng 4.5 Kết quả chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn Khối lượng cao
phía Bắc (g)
Khối lượng nguyên liệu phía Nam (g)
Cao tổng 150 150
Cao diethyl ether 2,5 2,7
Cao ethyl acetate 12,3 8,4
Cao n-Butanol 74,5 81
Cao nước 64,7 50,9
Tổng khối lượng cao phân đoạn 142 143
Kết quả cao khối lượng diethyl ether có khối lượng bé nhất, khối lượng cao n-Butanol là lớn nhất ở cả 2 loài Bảy lá một hoa. Hợp chất chủ yếu trong phân đoạn n-Butanol là saponin chứng tỏ rằng dược liệu có thành phần chủ yếu là saponin.
4.3. Kết quả tiêu chuẩn hóa cao tổng
4.3.1. Kết quả xác định độ tinh khiết cao tổng 4.3.1.1 Kết quả độ ẩm cao tổng 4.3.1.1 Kết quả độ ẩm cao tổng
Bảng 4.6 Kết quả độ cao tổng Lần lặp lại Độ ẩm cao phía
Bắc (%)
Độ âm cao phía Nam (%)
1 19,71 18,08
2 19,79 18,05
3 19,69 17,97
Độ ẩm trung bình 19,73 18,01
Độ ẩm trung bình của cao phía Bắc là 19,73% với SD = 0,053 và RSD = 0,003. Độ ẩm trung bình của cao phía Nam là 18% với SD = 0,057 và RSD = 0,003. Độ ẩm của 2 loài nằm trong giới hạn cho phép về cao đặc (<20%) theo quy định của DĐVN IV.
27
4.3.1.2. Kết quả độ tro toàn phần cao tổng
Bảng 4.7 Kết quả độ tro toàn phần trong cao tổng Lần lặp lại Độ tro cao phía
Bắc (%)
Độ tro cao phía Nam (%)
1 5,61 5,37
2 5,60 5,34
3 5,47 5,36
Độ tro trung bình 5,56 5,36
Độ tro trung bình của cao tổng Bảy lá một hoa phía Bắc là 5,56% với SD = 0,078 và RSD = 0,014.
Độ tro trung bình của cao tổng Bảy lá một hoa phía Nam là 5,36% với SD = 0,015 và RSD = 0,003.
4.3.2. Định tính xác định hợp chất saponin trong cao tổng
4.3.2.1. Định tính saponin trong cao tổng bằng phản ứng hóa học
Hình 4.4 Phản ứng Liebermann - Burchard.
1: Báy lá một hoa phía Bắc, 2: Bảy lá một hoa phía Nam Ống A: ống trắng, Ống B: ống mẫu
Phản ứng Liebermann - Burchard xuất hiện vòng ngăn cách giữa 2 lớp có màu nâu đỏ nên cũng kết luận phản ứng cương tính.
1
A B A 2
28
Hình 4.5 Phản ứng tạo bọt.
1: Báy lá một hoa phía Bắc, 2: Bảy lá một hoa phía Nam Ống A: ống trắng, Ống B:ống mẫu
Phản ứng tạo bọt xuất hiện lớp bọt bền trên 30 phút nên kết luận phản ứng dương tính. Kết quả hai phản ứng dương tính trên chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong cao tổng của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam
4.3.2.2.Định tính saponin trong cao tổng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Hình 4.6 SKLM hệ n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2).
A: Báy lá một hoa phía Bắc, B: Bảy lá một hoa phía Nam 1: nguyên liệu, 2: cao tổng
A B
Rf = 0.52 Rf = 0.35 Rf = 0.62
29
Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2) xuất hiện các vệt tím trên 2 bản sắc ký chứng tỏ trong cả 2 loài Bảy lá một hoa đều có sự hiện diện của saponin. Cả 2 loài đều có vệt tương đồng với Rf = 0,52. Tuy nhiên với vệt khác nhau có Rf = 0,62 của loài phía Bắc và Rf = 0,35 của loài phía Nam.
Hình 4.7 SKLM hệ CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1).
C: phía Bắc, D: phía Nam 1 : Nguyên liệu, 2 : Cao tổng
Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) có các vết màu tím có giá trị Rf = 0,52 và Rf = 0,62 tương đồng giữa 2 loài Bảy lá một hoa chứng tỏ trong cả 2 loài Bảy lá một hoa đều có sự hiện diện của saponin.
4.3.3. Kết quả định lượng hàm lượng saponin trong cao tổng
Bảng 4.8 Kết quả định lượng hàm lượng saponin trong cao tổng Lần lặp lại Hàm lượng saponin
trong cao phía Bắc (%)
Hàm lượng saponin trong cao phía Nam (%)
1 59,68 65,33
2 59,72 65,30
3 59,22 65,07
Hàm lượng
saponin trung bình 59,54 ± 0,28 65,23 ± 0,14
Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung bình có trong cao phía Bắc là 59,54% với SD = 0,28 và RSD = 0,005. Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung
C D
1 2 1 2
Rf = 0,625 Rf = 0.52
30
bình có trong cao phía Nam là 65,23% với SD = 0,14 và RSD = 0,002. Hàm lượng saponin trung bình của cao tổng phía Bắc thấp hơn 5,69% so với hàm lượng saponin trung bình trong cao tổng phía Nam.
31
Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Đã tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: xác định độ tinh khiết của nguyên liệu, độ ẩm trung bình của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 7,35% và 11,22%, độ tro trung bình toàn phần của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 3,50% và 3,23%, độ tro không tan trong acid clohydric trung bình lần lượt là 0,65% và 0,38%. Định tính bằng phương pháp hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng đều có sự hiện diện của hợp chất saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam. Hàm lượng saponin trong nguyên liệu của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 6,71% và 6,92%. Hàm lượng saponin trong nguyên liệu phía Nam cao hơn 0,21%so với cao tổng phía Bắc.
Đã tiêu chuẩn hóa cao tổng: xác định độ tinh khiết của nguyên liệu, độ ẩm trung bình của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 19,73% và 18%, độ tro trung bình toàn phần của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 5,56% và 5,36%.Định tính bằng phương pháp hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng đều có sự hiện diện của hợp chất saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam. Hàm lượng saponin trong cao của 2 Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam lần lượt là 59,54% và 65,23%. Hàm lượng saponin trong cao tổng phía Nam cao hơn 5,69% so với cao tổng phía Bắc.
5.2 Đề nghị
Khảo sát thành phần hóa học và định lượng các hợp chất hóa học của các loài Bảy lá một hoa khác ở Việt Nam.
Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng và các cao phân đoạn của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam.
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng gây độc của cao tổng và các cao phân đoạn lên các tế bào ung thư.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Ngô Văn Thu. 1990. Hóa học saponin. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 3 - 15. 2. Đỗ Duy Bích và ctv. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập II.
Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, trang 256 - 258.
3. Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất
bản Đại học Quốc gia, TP.HCM.
4. Viện dược liệu. 2003. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập I. NXB KH & KT, Hà Nội, 182 - 184.
5. Bộ Y Tế. 2009. Dược điển Việt Nam.
6. Bộ môn Dược liệu. 2012. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược, Tp. Hồ Chí Minh.
7. Đỗ Tất Lợi. 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Tp. Hồ Chí Minh.
8. Trần Hùng và ctv 2014. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y dược, Tp.Hồ Chí Minh.
9. Châu Thị Nhã Trúc, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận. 2015. Phân lập một số steroid từ loài bảy lá một hoa thu hái tại Kontum. Tạp chí Dược liệu, 20(2), tr.
82- 86.
10. Phạm Hoàng Hộ. 2000. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Trẻ.
Tiếng nước ngoài
11.Hisashi M., Yutana P., Toshio M., Akinobu K., Shinya K., Masayuki Y. 2003.
Protective Effects of Steroid Saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on Ethanol- or Indomethacin-Induced Gastric Mucosal Lesions in Rats: Structural Requirement for Activity and Mode of Action. Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 13, 1101 - 1106.
12.Gao Lin-Lin, Li Fu-Rong, Jiao Peng et al. 2011.Apoptosis of human ovarian
cancer cells induced by Paris chinensis dioscin via a Ca2+ -mediated
mitochondrion pathway. Asian. Pac. J. Cancer. Prev. 12(5), pp. 1361.
13.Wang Y. 2007. Master thesis,Tianjin University, p.19
14.LuLu Y., Wen Y. G., Yan J. Z., Yu W.. 2008. A new phenylpropanoid glycosides
from Paris polyphylla var. yunnanensis. Fitoterapia 79, pp.306-307.
15.Ting Z., Hai L., Xue T. L., De-ran X., Xiao Q. C., Qiang W.. 2009. Qualitative
and quantitative analysis of steroidal saponins in crude extracts from Paris polyphylla var. yunnanensis and P. polyphylla var. chinensis by high
33
performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 51, pp.114 - 124.
16.Li P. K., Yi X. L., Tolga E., Else D., He S. Y., Yang Z., Cheng Q. X., Chao L., Thomas E., Bai P. M. (2012). Polyhydroxylated Steroidal Glycosides from Paris