Thiết bị Hóa chất
- Tủ sấy, Cân điện tử
- Dụng cụ chứa: hũ thũy tinh, becher - Bếp điện
- Bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck)
- Ống nghiệm
- Ống đong các loại, pipet các loại, ống bóp cao su
- Bông thủy tinh (có thể thay thế bằng bông gòn thông thường)
- Máy cô quay BUCHI (Đức) - Bể siêu âm
- Đèn UV 2 bước sóng
- Methanol (MeOH) - Aceton
- n - Butanol
- Acid acetic (CH3COOH) - Nước cất
- Ethyl acetate, chloroform - Acid sulfuric, Acid clohydric
- Diethyl ether
3.3. Phương pháp nghiên cứu3.3.1. Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 3.3.1. Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
3.3.1.1. Xác định độ tinh khiết nguyên liệu
Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Dùng chén cân có nắp mài làm bì, sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi rồi cân bì. Cân khoảng 1 g dược liệu cho vào bì, đem sấy ở 105oC trong tủ sấy dưới áp suất thường trong 4 giờ. Làm nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút rồi cân ngay. Sấy tiếp và cân sau mỗi 2 giờ, lặp lại đến khi khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,5 mg). Quy trình được lặp lại 3 lần. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: 100% a b a X Trong đó: X: độ ẩm mẫu (%).
a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g). b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g).
18
Xác định độ tro toàn phần của nguyên liệu
Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không. Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu cho vào chén cân, trải đều mẫu dưới đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói. Đưa vào lò nung và nung ở nhiệt độ 550oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Làm nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. Đặt chén đựng tro vào lò nung tiếp và lại tiếp tục cân sau 2 giờ nữa. Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro chênh lệch không quá 0,5 mg. Quy trình được lặp lại 3 lần. Tro toàn phần được tính theo công thức:
100% h) (c c h a X Trong đó A: Độ tro toàn phần (%). a: Khối lượng chén có tro (g). b: Khối lượng chén không tro (g). c: Khối lượng mẫu (g).
h: Độ ẩm của mẫu (%)
Xác định độ tro không tan trong acid clohydric của nguyên liệu
Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 25 ml acid hydrocloric 2 M. Đun sôi cẩn thận 10 phút rồi để nguội. Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không tro. Rửa (cả tro và lọc) bằng nước cất nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ). Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt rồi nung ở 550oC trong 2 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng không đổi. Quy trình được lặp lại 3 lần. Tro không tan trong acid được tính theo công thức:
100% A) (c c b a X
19
Trong đó:
X: tro không tan trong acid của dược liệu (%). a: khối lượng chén có mẫu (g).
b: khối lượng chén không (g). c: khối lượng mẫu dùng (g). A: độ ẩm của mẫu (%).
3.3.1.2. Định tính xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu
Định tính xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu bằng phương pháp hóa học
Chiết 1 g bột dược liệu với cồn 80% bằng cách đun hồi lưu trong 30 phút rồi lọc. Cô bốc hơi dịch lọc cho đến cắn. Dùng cắn đề làm thử nghiệm tính tạo bọt và phản ứng Liebermann - Burchard.
Phản ứng tạo bọt bằng cách hòa tan cắn vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, sau đó thêm nước cho đủ 10 ml, lắc mạnh dứt khoát theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả.
Phản ứng Liebermann - Burchard, hòa tan cắn trong 1 ml anhydride acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc xuống đáy ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi mặt ngăn cách giữa hai lớp có màu từ nâu đỏ tới đỏ tím.
Định tính xác định hợp chất saponin trong nguyên liệu bằng sắc ký lớp mỏng
Điều kiện sắc ký:
Bản mỏng Silicagel tráng sẵn 60F254 Merck
Dịch chấm sắc ký: lấy 1 mg cắn n-Butanol của nguyên liệu và cao chiết cồn hòa tan trong 1 ml methanol làm dịch chấm.
Dung môi khai triển: CH2Cl3 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2)
20
Chấm riêng biệt lên cùng 1 bản mỏng các dung dịch thử. Sau khi triển khai xong, lấy bản mỏng ra để khô. Phun thuốc thử 10% H2SO4 trong cồn, sấy ở nhiệt độ 105oC đến khí xuất hiện vết. Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường.
3.3.1.3. Định lượng hợp chất saponin toàn phần trong nguyên liệu bằng phương pháp cân pháp cân
Cân chính xác khoảng 5 g nguyên liệu, chiết kiệt hoạt chất (dịch chiết không còn vết màu tím sau sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn trên bản sắc ký) bằng phương pháp chiết siêu âm với cồn 80%. Dịch chiết đem cô lấy cắn rồi hòa với 10 ml nước, dịch nước lắc với diethyl ether (đến khi hết màu) thu lấy pha nước. Dịch nước lắc với n-Butanol bão hòa nước. Rửa dịch n-Butanol bằng nước cất 3 lần rồi cô bốc hơi pha n-Butanol thu được. Tập trung dịch n-Butanol cô đến cắn. Sấy khô cắn n-Butanol ở 1050C đến khối lượng không đổi và cân (Quy trình được lặp lại 3 lần). Hàm lượng saponin theo dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức:
d) (M M 100 A X Trong đó:
X: Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%). A: khối lượng cắn saponin thu được (g).
d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%). M: khối lượng dược liệu đem chiết (g).
3.3.2. Chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ thân rễ 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam phía Bắc và phía Nam
3.3.2.1. Chiết xuất cao tổng phương pháp chiết ngấm kiệt
Chiết ngấm kiệt 1300 g nguyên liệu phía Bắc với 17,5 lít dung môi cồn 80%. Cách tiến hành: Làm ẩm nguyên liệu với 500 ml cồn 80% sau đó cho nguyên liệu vào bình ngấm kiệt, thêm 2 lít cồn 80% ngâm trong 24 giờ, thêm dung môi và rút dịch chiết với tốc độ dòng 30 ml/phút cho đến khi kiệt hoạt chất (dịch chiết không còn vết màu tím sau sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn trên bản sắc ký). Dịch chiết đem cô quay ở 70oC thu được cao tổng.
21
3.3.2.2. Chiết các cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng
Cân chính xác khoảng 200 g cao toàn phần đem hòa với nước. Dịch nước thu được lắc với diethyl ether (đến khi dịch diethyl ether hết màu) .Tập trung dịch ether cô quay giảm áp ở 45oC thu được cao diethyl ether. Dịch nước lắc tiếp với athyl acetate đến khi dịch acetate không con xuất hiện vết màu xanh đen sau khi phun thuốc thử FeCl3 5% trong cồn trên bản sắc ký. Dịch ethyl acetate dêm đi cô quay ở 60oC thu được cao ethyl acetate. Dịch nước tiếp tục lắc với n-Butanol bão hòa nước đến khi dịch chiết không còn vết màu tím sau sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn trên bản sắc ký. Cô quay dịch n-Butanol thu được ở 80oC thu được cao n-Butanol. Dịch nước cuối cùng được cô quay ở 80oC thu được cao nước.
3.3.3. Tiêu chuẩn hóa cao tổng
3.3.3.1. Xác định độ tinh khiết cao tổng
Xác định đọ tinh khiết cao của tổng bao gồm xác định độ ẩm và xác định độ tro toàn phần thực hiện tương tự theo phương pháp được trình bày ở mục 3.3.1.1
3.3.3.2. Định tính xác định hợp chất saponin trong cao tổng
Thực hiện tương tự theo phương pháp được trình bày ở mục 3.3.1.2
3.3.3.3. Định lượng saponin toàn phần trong cao tổng bằng phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao, hòa với 20 ml nước, dịch nước được lắc với diethyl ether đến khi hết màu. Dịch nước lắc với n-Butanol bão hòa nước, rửa dịch n-Butanol bằng nước cất 3 lần. Tập trung dịch n-Butanol cô đến cắn. Sấy khô cắn n-Butanol ở 1050C đến khối lượng không đổi và cân. Quy trình được lặp lại 3 lần. Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần có trong cao được tính theo công thức:
d) (M M 100 A X Trong đó:
X: Hàm lượng saponin toàn phần trong cao (%). A: khối lượng cắn saponin thu được (g).
d: độ ẩm của cao (%). M: khối lượng cao (g).
22
Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tiêu chuẩn hóa nguyên liệu
4.1.1. Kết quả độ tinh khiết trong nguyên liệu 4.1.1.1. Độ ẩm nguyên liệu 4.1.1.1. Độ ẩm nguyên liệu
Bảng 4.1 Kết quả độ ẩm nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 7,42 11,19
2 7,35 11,25
3 7,27 11,24
Độ ẩm trung bình 7,35 ± 0,0075 11,22 ± 0,03
Độ ẩm trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 7,35% với SD =0,075 và RSD = 0,001. Độ ẩm trung bình của nguyên liệu phía Nam là 11,22% với SD = 0,03 và RSD = 0,27. Độ ẩm của nguyên liệu phía Bắc thấp hơn so với nguyên liệu phía Nam và trong giới hạn cho phép tiêu chuẩn dành cho dược liệu (<13%) cho phép theo DĐVN IV.
4.1.1.2. Độ tro toàn phần nguyên liệu
Bảng 4.2 Kết quả độ tro toàn phần trong nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 3,46 3,09
2 3,48 3,29
3 3,57 3,21
Độ tro trung bình 3,50 ± 0,059 3,23 ± 0,1
Độ tro trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 3,5%, với SD = 0,059 và RSD = 0,018. Độ tro trung bình của nguyên liệu phía Nam là 3,23%, với SD = 0,1 và RSD = 0,031.Độ tro toàn phần trung bình của 2 loài thấp, trong cao phía Nam có độ tro toàn phần trung bình thấp hơn so với phía Bắc.
23
4.1.1.3. Độ tro không tan trong acid clohydrid trong nguyên liệu
Bảng 4.3 Kết quả độ tro không tan trong acid clohydrid nguyên liệu Lần lặp lại Độ ẩm nguyên liệu
phía Bắc (%)
Độ âm nguyên liệu phía Nam (%)
1 0,70 0,36
2 0,58 0,38
3 0,63 0,36
Độ ẩm trung bình 0,64 ± 0,06 0,37 ± 0,01
Độ tro không tan trong acid hydrochloric trung bình của nguyên liệu phía Bắc là 0,64% với SD = 0,06 và RSD = 0.09 . Độ tro không tan trong acid hydrochloric trung bình của nguyên liệu phía Nam là 0,37% với SD = 0,01 và RSD = 0,03. Độ tro không tan trong acid clohydrid trung bình của cao phía Nam thấp hơn cao phía Bắc.
4.1.2. Kết quả định tính xác định sự hiện diện của saponin trong nguyên liệu 4.1.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
Hình 4.1 Phản ứng Liebermann - Burchard.
A: Bảy lá một hoa phía Bắc B: Bảy lá một hoa phía Nam Ống 1: ống trắng, Ống 2: có mẫu
Phản ứng Liebermann - Burchard xuất hiện vòng ngăn cách giữa 2 lớp có màu nâu đỏ nên cũng kết luận phản ứng dương tính chứng tỏ rằng có sự hiện diện saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa.
1 2 1 2
24
Hình 4.2 Phản ứng tạo bọt.
1: Bảy lá một hoa phía Bắc , 2: Bảy lá một hoa phía Nam Ống A: ống trắng, Ống B: có mẫu
Phản ứng tạo bọt xuất hiện lớp bọt bền trên 30 phút nên kết luận phản ứng dương tính chứng tỏ rằng có sự hiện diện saponin trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa.
4.1.2.2 Định tính saponin trong nguyên liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng
Hình 4.3 Sắc ký lớp mỏng định tính saponin trong nguyên liệu.
A: hệ CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) (8 : 2), B: hệ n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2) 1 : Nguyên liệu phía Bắc, 2 : Nguyên liệu phía Nam
Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH - AcOH (8 : 1: 1) có xuất hiện các vết màu tím có giá trị Rf tương đồng là 0,62 và 0,52. Quan sát sắc ký đồ hệ dung môi hệ n-BuOH - AcOH - H2O (7 : 1: 2) có xuất hiện các vết màu tím có giá trị tương đồng Rf = 0,35 và Rf = 0,52 trong nguyên liệu của 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và
Rf = 0,35 Rf = 0,52 A B A B Rf = 0,62 A B A 1 2 Rf = 0,62 Rf = 0,52 1 2 1 2
25
phía Nam. Chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong nguyên liêu 2 loài Bảy lá một hoa phía Bắc và phía Nam. Tuy nhiên trong nguyên liệu của loài Bảy lá một hoa phía Bắc có sự xuất hiện của vệt tím với Rf = 0,625 nên có sự khác biệt giữa thành phần saponin trong 2 loài này.
4.1.3. Định lượng hợp chất saponin toàn phần trong nguyên liệu bằng phương pháp cân
Bảng 4.4 Hàm lượng saponin trong nguyên liệu Lần lặp lại
Hàm lượng saponin trong nguyên liệu
phía Bắc (%)
Hàm lượng saponin trong nguyên liệu
phía Nam (%) 1 6,70 6,89 2 6,79 6,82 3 6,64 7,05 Hàm lượng saponin trung bình 6,71 ± 0,045 6,92 ± 0,12
Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung bình có trong nguyên liệu phía Bắc là 6,71% với SD = 0,045 và RSD = 0,006.
Hàm lượng hợp chất saponin toàn phần trung bình có trong nguyên liệu phía Nam là 6,92% với SD = 0,12 và RSD = 0,017.
Hàm lượng saponin toàn phần trung bình trong nguyên liệu phía Bắc thấp hơn 0,21% so với hàm lượng saponin toàn phần trung bình ở phía Nam.
4.2 Kết quả chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ Bảy lá một hoa phía Bắc và Bảy lá một hoa phía Nam Bảy lá một hoa phía Nam
Từ 1300 g dược liệu Bảy lá một hoa phía Bắc ban đầu, bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với 17,5 lít dung môi cồn 80% thu được 250 g cao tổng. Cao tổng phía Nam được trung tâm Sâm và dược liệu tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
26
Bảng 4.5 Kết quả chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn Khối lượng cao
phía Bắc (g)
Khối lượng nguyên liệu phía Nam (g)
Cao tổng 150 150
Cao diethyl ether 2,5 2,7
Cao ethyl acetate 12,3 8,4
Cao n-Butanol 74,5 81
Cao nước 64,7 50,9
Tổng khối lượng cao phân đoạn 142 143
Kết quả cao khối lượng diethyl ether có khối lượng bé nhất, khối lượng cao n-Butanol là lớn nhất ở cả 2 loài Bảy lá một hoa. Hợp chất chủ yếu trong phân đoạn n-Butanol là saponin chứng tỏ rằng dược liệu có thành phần chủ yếu là saponin.
4.3. Kết quả tiêu chuẩn hóa cao tổng
4.3.1. Kết quả xác định độ tinh khiết cao tổng 4.3.1.1 Kết quả độ ẩm cao tổng 4.3.1.1 Kết quả độ ẩm cao tổng
Bảng 4.6 Kết quả độ cao tổng Lần lặp lại Độ ẩm cao phía
Bắc (%)
Độ âm cao phía Nam (%)
1 19,71 18,08
2 19,79 18,05
3 19,69 17,97
Độ ẩm trung bình 19,73 18,01
Độ ẩm trung bình của cao phía Bắc là 19,73% với SD = 0,053 và RSD = 0,003. Độ ẩm trung bình của cao phía Nam là 18% với SD = 0,057 và RSD = 0,003. Độ ẩm của 2 loài nằm trong giới hạn cho phép về cao đặc (<20%) theo quy định của DĐVN IV.
27
4.3.1.2. Kết quả độ tro toàn phần cao tổng
Bảng 4.7 Kết quả độ tro toàn phần trong cao tổng Lần lặp lại Độ tro cao phía
Bắc (%)
Độ tro cao phía Nam (%)
1 5,61 5,37
2 5,60 5,34
3 5,47 5,36
Độ tro trung bình 5,56 5,36
Độ tro trung bình của cao tổng Bảy lá một hoa phía Bắc là 5,56% với SD = 0,078 và RSD = 0,014.
Độ tro trung bình của cao tổng Bảy lá một hoa phía Nam là 5,36% với SD = 0,015 và RSD = 0,003.
4.3.2. Định tính xác định hợp chất saponin trong cao tổng
4.3.2.1. Định tính saponin trong cao tổng bằng phản ứng hóa học
Hình 4.4 Phản ứng Liebermann - Burchard.