khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH ĐÀO KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG TRÊN VÀI DẠNG CÂY TRỒNG NGẮN NGÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – 2005 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến : TS. Trònh Thò Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Quý thầy cô Khoa Sinh nói chung và Bộ môn Vi sinh nói riêng của Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn. Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Vi sinh, Sinh lý Thực vật, Sinh hóa, Sinh học Phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm. Gia đình ông Võ Văn Giúp và ông Nguyễn Ngọc Yên đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm thực tiễn. Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh An Giang, Ban Giám hiệu Trường Trung học Phổ thông Nguyễn Khuyến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học. Và thật hạnh phúc biết bao khi trong cuộc sống, trong lao động và học tập luôn có sự chăm sóc, động viên, giúp đỡ của người thân, bạn bè. Tôi luôn biết ơn vì những tấm chân tình đó và gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân yêu của tôi – gia đình và bạn bè trong suốt thời gian qua. Nguyễn Thanh Đào MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viếr tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Danh mục các đồ thò MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 4 1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng 4 1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây 4 1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng 4 1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố đònh đạm 7 1.1.2.1 Cố đònh đạm hóa học 7 1.1.2.2 Cố đònh đạm sinh học 9 1.2 Vi sinh vật cố đònh đạm và cơ chế của quá trình cố đònh đạm sinh học 10 1.2.1 Các loài vi sinh vật cố đònh đạm 10 1.2.1.1 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống tự do 10 1.2.1.2 Vi khuẩn cố đònh nitơ cộng sinh 10 1.2.1.3 Vi khuẩn cố đònh nitơ sống trên rễ hay trong rễ một số loài cỏ nhiệt đới 11 1.2.1.4 Đạm do vi sinh vật cố đònh được 11 1.2.2 Cơ chế của quá trình cố đònh đạm 11 1.3 Vi khuẩn Azospirillum 14 1.3.1 Đặc tính hình thái 14 1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất 17 1.3.3 Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 18 1.3.3.1 Ảnh hưởng nhiễm khuẩn đến sự phát triển bộ rễ 18 1.3.3.2 Sự hình thành khuẩn lạc Azospirillum ở rễ 19 1.3.4 Các cơ chế hoạt động của Azospirillum giúp tăng trưởng thực vật 21 1.3.4.1 Sự cố đònh nitơ không khí của Azospirillum 21 1.3.4.2 Ảnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên sinh trưởng và phát triển ở thực vật 22 1.3.4.3 Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật 23 1.3.4.4 Quan hệ giữa nitratreductase của cây chủ và vi khuẩn Azospirillum 24 1.4 Phân vi sinh vật 24 1.4.1 Đònh nghóa 24 1.4.2 Phân loại 25 1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật 26 1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn 26 1.4.5 Phân vi sinh từ Azospirillum 30 Chương 2 - VẬT LIỆU-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu 35 2.1.1 Thiết bò và dụng cụ 35 2.1.2 Hóa chất và môi trường 35 2.1.3 Vật liệu thí nghiệm 39 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phân lập 40 2.2.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh IAA tốt 41 2.2.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng được chọn 43 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn 46 2.2.4.1 Chuẩn bò 46 2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 47 2.2.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 52 2.2.5.1 Chuẩn bò 52 2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 54 Chương 3 – KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 57 3.1 Phân lập 58 3.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh IAA tốt 61 3.2.1 Khả năng cố đònh đạm của 5 chủng A 1 , A 2 , A 3 , A 4 và A 5 61 3.2.2 Khả năng sinh IAA của 5 chủng A 1 , A 2 , A 3 , A 4 và A 5 62 3.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng A 2 và A 3 65 3.3.1 Đặc điểm hình thái 65 3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 66 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn 69 3.4.1 Thời gian thích hợp nhiễm dòch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả 69 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dòch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 71 3.4.2.1. Cây mạ trong ống nghiệm 71 3.4.2.2. Cây lúa trong chậu 76 3.4.2.3. Cây lúa ngoài ruộng 78 3.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 88 3.5.1 Chuẩn bò 88 3.5.1.1. Dòch nuôi cấy vi khuẩn 88 3.5.1.2. Chế phẩm “phân vi sinh” 95 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 97 3.5.2.1 Lúa trong chậu 97 3.5.2.2 Cải thìa 99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuôi cấy 60 Bảng 3.2. Hàm lượng đạm của 5 chủng trong môi trường Dobereiner dòch thể 61 Bảng 3.3. Hàm lượng IAA trong dòch nuôi cấy (μg/ ml) theo thời gian 64 Bảng 3.4. Chiều cao trung bình cây lúa (mm) sau 7 ngày theo thời gian ngâm hạt 70 Bảng 3.5. Giá trò trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A 2 73 Bảng 3.6. Giá trò trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A 3 74 Bảng 3.7. Giá trò trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 77 Bảng 3.8. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A 2 80 Bảng 3.9. Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A 3. 81 Bảng 3.10. Số nhánh trung bình của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của chủng A 2 và A 3 83 Bảng 3.11 . Ảnh hưởng A 2 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 85 Bảng 3.12. Ảnh hưởng A 3 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 86 Bảng 3.13. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A 2 theo thời gian 88 Bảng 3.14. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A 3 theo thời gian 89 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào giá trò OD 610nm 91 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào giá trò OD 610nm 93 Bảng 3.17. Mật độ tế bào A 2 và A 3 trong 1 gram chế phẩm theo thời gian với sự thay đổi độ ẩm 95 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của NH 3 lên sự gia tăng số lượng tế bào 96 Bảng 3.19. Sự biến đổi mật độ tế bào A 2 và A 3 theo thời gian 96 Bảng 3.20. Giá trò trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 98 Bảng 3.21. Số lá trung bình của cây cải thìa (lá/cây) 100 Bảng 3.22. Chiều cao trung bình của cây cải thìa (cm/cây) 102 Bảng 3.23. Giá trò trung bình các lượng giá cây cải thìa vào thời điểm thu hoạch 104 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Phân lập Azospirillum từ đất vùng rễ lúa 58 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ 59 Hình 3.3. Đònh tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski 62 Hình 3.4. Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng nuôi cấy 5 ngày 65 Hình 3.5. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể - NFb của chủng A 2 và A 3 67 Hình 3.6. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dòch thể Andrade của chủng A 2 và A 3 68 Hình 3.7. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn (cây mạ 7 ngày tuổi trên môi trường MS) 72 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào chỉ thò màu bromothymol blue 92 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào chỉ thò màu bromothymol blue 94 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thò 3.1. Đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và OD 530nm 63 Đồ thò 3.2. Hàm lượng IAA trong dòch nuôi cấy (μg/ml) theo thời gian 64 Đồ thò 3.3. Hiệu quả của thời gian ngâm hạt mầm thông qua chiều cao cây (mm) sau 7 ngày trồng lúa trong ống nghiệm 71 Đồ thò 3.4. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn trên chiều cao cây lúa ngoài ruộng (cm/cây) của chủng A 2 và A 3 ……………………………… 79 Đồ thò 3.5. Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn đến khả năng phân nhánh của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của chủng A 2 và A 3……… 82 Đồ thò 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A 2 theo thời gian 89 Đồ thò 3.7. Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A 3 theo thời gian 90 Đồ thò 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào giá trò OD 610nm 91 Đồ thò 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A 2 và A 3 dựa vào giá trò OD 610nm ………………………………………………93 Đồ thò 3.10. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” đến số lượng lá cải thìa 101 Đồ thò 3.11. Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên chiều cao cây cải thìa (cm/cây) 103 [...]... lập và tuyển chọn Azospirillum có khả năng cố đònh đạm và sinh IAA tốt - Tìm hiểu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa - Bước đầu tạo chế phẩm “phân vi sinh” bằng cách cố đònh trên chất mang là than bùn - Sơ bộ ứng dụng chế phẩâm “phân vi sinh” trên cây trồng ngắn ngày (lúa nước và cải thìa) trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tiễn với quy mô nhỏ 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Vai trò của đạm và. .. vùng đất chuyên canh trồng lúa có số lượng Azospirillum cao hơn những vùng đất luân canh lúa màu rất nhiều [9] Ở nước ta theo kết quả nghiên cứu của một vài tác giả, thì số lượng Azospirillum ở trong đất trồng lúa đồng bằng sông Hồng là khá cao Nhìn chung mật độ tế bào Azospirillum trong các chân đất là từ vài chục đến vài vạn tế bào/gam đất khô, trong đất không ngập nước thì số lượng Azospirillum thấp... [23] Các khuẩn lạc của Azospirillum tạo màu hồng nhạt hay màu hồng đậm trên môi trường thạch khoai tây [11], [23] Nhiệt độ tối ưu các loài Azospirillum vào khoảng 34 - 37oC Một vài chủng phát triển tốt ở pH 7, một vài 14 chủng khác thì phát triển tốt trên môi trường acid Chúng cố đònh nitơ trong không khí trong điều kiện vi hiếu khí Vài chủng có thể khử NO3- thành NO2- hoặc N2O và N2 [23] Nguồn carbon... vai trò của đất ngập nước đối với sự khu trú của Azospirillum [9] Điều đáng chú ý là số lượng Azospirillum ở vùng rễ lúa luôn lớn hơn nhiều so với số lượng trong đất, sự chênh lệch này có thể đạt tới vài trăm lần Mật độ vi 17 khuẩn cao ở rễ thể hiện mối tương quan hội sinh khá chặt chẽ giữa nhóm vi khuẩn này và rễ cây lúa nước [9] 1.3.3 Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển của thực... khuẩn nêu trên không cho phép khẳng đònh là cần nhiễm bao nhiêu vi khuẩn Azospirillum cho một hạt hay một cây để nhận phản ứng tăng sản dương tính Đối với lúa nước, mật độ vi khuẩn trong dung dòch xử lý 106tế bào/ml có ảnh hưởng dương tính đến chiều cao và trọng lượng khô cây mạ [17] Ảnh hưởng dương tính do nhiễm khuẩn còn thể hiện qua các chỉ số phát triển rễ, kể cả sự tăng trưởng chiều dài, đặc biệt... Azospirillum irakense Azospirillum halopraeferens Azospirillum 0,8-1,0 1,0 -1,2 brasilense Azospirillum - Bề rộng tế bào (µm) amazonense Đặc điểm Azospirillum Bảng 1.1 Các đặc điểm phân loại của các loài Azospirillum [23] 0,7-1,4 0,6-0,9 1,0 -1,5 - - - - + + + + + - Vài tiên mao mọc ra hai - + + + 30-33oC 37oC - Sự sắp xếp của tiên mao trên tế bào trong môi trường dòch thể + Một đến ba tiên mao ở một. .. khuẩn khác Trong suốt ba ngày đầu, các khuẩn lạc tập trung chủ yếu ở vùng đầu non của lông rễ Vài chủng Azospirillum xâm nhiễm vào vài loại cây trồng như lúa mì, lúa miến, bắp Sự xâm nhiễm đó làm thay đổi hình thái rễ [27] 19 Azospirillum có thể bám trên bề mặt rễ hoặc xâm nhập vào bên trong rễ để hình thành các tập đoàn với vô số hợp phần là các tế bào đơn Các khuẩn lạc này ẩn vào phía trong lớp nhầy... và chuyển vào cây lượng nitơ cố đònh bởi vi khuẩn (Renie, 1980) + Vi khuẩn tiết ra các hormon thực vật (Tiên và cộng sự, 1979) + Sự kích thích đưa các chất dinh dưỡng vào cây (Lin và cộng sự, 1985) Một vài nghiên cứu của một số tác giả, thì các chủng Azospirillum ngoài khả năng cố đònh nitơ, còn có khả năng sinh ra chất kích thích sinh rễ đó là indole -3- acetic acid (IAA) Cây mạ có xử lý Azospirillum. .. nhân khởi đầu tạo nên sự tích lũy nhiều nitơ ở cây chủ do nhiễm Azospirillum : cho nhiễm Azospirillum NR+ vào rễ cây làm cho hoạt tính của enzyme này ở lá giảm hẳn và ngược lại, nhiễm Azospirillum NR- làm cho hoạt tính của enzyme này ở lá tăng hơn so với nhóm Azospirillum NR+ Kết quả thử nghiệm xử lý Azospirillum brasilense sp 245 bố mẹ NR+ và thể đột biến của nó là NR- đã xác nhận thể đột biến có hiệu... trưởng của rễ, tăng số lượng và chiều dài của rễ phụ và do đó làm tăng thể tích rễ, tăng trọng lượng rễ, làm xuất hiện sớm và tăng số lượng các lông hút, tăng diện tích tiếp xúc của các lông rễ, thay đổi sự sắp xếp các tế bào chóp rễ [17] Cắt ngang rễ của cây bắp và câp lúa mì bò nhiễm khuẩn thấy các tế bào ở những rễ này sắp xếp một cách bất bình thường, ở lớp ngoài vùng vỏ Đặc biệt là các hoạt động của . DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THANH ĐÀO KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VÀ ẢNH HƯỞNG. khuẩn Azospirillum 14 1.3.1 Đặc tính hình thái 14 1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất 17 1.3.3 Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và