Hĩa chất
Thuốc nhuộm tiên mao : thuốc nhuộm Nishizawa Kaghen [2]. Các hĩa chất sử dụng trong phương pháp Kjeldahl [13].
Thuốc thử sự hiện diện nitrite trong mơi trường : thuốc thử tinh bột – iode. Thuốc thử khả năng sinh tổng hợp IAA : thuốc thử Salkowski [26].
Mơi trường
- Mơi trường phân lập và làm thuần
∗ Mơi trường vơ đạm NFb (nitrogen - fixing broth) (MT1) [21]
Thành phần mơi trường (g/l)
D,L malic acid 5,0
K2HPO4 0,5
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0,1 Bromothymol blue (0.5%) trong KOH 0.2M 2ml
Dung dịch vitamin(1) 1ml Dung dịch khống vi lượng(2) 2ml 1,64% dung dịch FeEDTA 4ml KOH 4,5 Agar 0,0175 - 0,5% pH 6,5
(1)Trong 100ml, dung dịch vitamin chứa :
Biotin 10mg
Pyridoxol-HCl 20mg
Hồ tan trong chậu nước 100oC
(2) Trong 1lít, dung dịch khống vi lượng chứa :
CuSO4.5H2O 40mg
ZnSO4.7H2O 0,12g
H3BO3 1,4g
Na2MoO4 1,0g
MnSO4.H2O 1,175g
∗ Mơi trường NFb rắn cĩ bổ sung congo đỏ (MT2)
Mơi trường này cĩ thành phần cơ bản là mơi trường đặc (15g agar/l) NFb cĩ bổ sung 15ml dung dịch đỏ congo 0,25% và cao nấm men 50mg/lít mơi trường.
- Mơi trường nuơi cấy
Mơi trường Dobereiner và cộng sự (1976) (g/l) (MT3) [7]
Acid malic 5,0
KH2PO4 0,4
NaCl 0,1 CaCl2 .7H2O 0,02 FeCl3.6H2O 0,01 Na2MoO4 0,002 Bromothymol blue (0,5%) 2ml KOH 4,0 Agar 1,75 pH 6,8
- Mơi trường vơ đạm thử khả năng sử dụng nguồn carbon [23]
Mơi trường bán lỏng NFb thay acid malic bằng các hợp chất làm nguồn carbon : glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin.
- Mơi trường dịch thể thử khả năng sử dụng nguồn carbon Mơi trường Andrade (MT4) [2]
Dung dịch chỉ thị màu : hịa 0,5g fuchsin acid vào 100ml nước cất, thêm
16,4ml NaOH 1N, khử trùng 5phút ở 110oC.
Mơi trường cơ bản (g/l)
Pepton 10
NaCl 5
Đường 5
pH 7,6
Dung dịch đường, mơi trường cơ bản và dung dịch chỉ thị màu được khử trùng riêng biệt. Mỗi bình đựng 100ml mơi trường cơ bản, sau khi khử trùng bổ sung thêm 1ml dung dịch chỉ thị màu và 0,5g nguồn đường. Phân phối mơi trường vào các ống nghiệm vơ trùng, mỗi ống 3 - 5ml (trong cĩ chứa ống Durham). Mơi trường trước khi cấy cĩ màu vàng cỏ sáng (gần như trong suốt). Nếu cĩ màu hồng nhạt thì phải điều chỉnh lại bằng NaOH vơ trùng.
- Mơi trường nuơi cấy thử khả năng khử nitrate (MT5)
Sử dụng mơi trường cao thịt – pepton bổ sung 0,2% KNO3 [5]
Mơi trường cao thịt – pepton (g/l)
Cao thịt 3
Pepton 10
NaCl 5
pH 6,0
- Mơi trường nuơi cấy khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Azospirillum : Mơi trường Dobereiner
- Mơi trường trồng lúa trong ống nghiệm
Mơi trường MS (Murashige & Skoog) (MT6) [14]
Khống đa lượng Hàm lượng sau cùng (mg/l)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2 440
MgSO4.7H2O 370
KH2PO4 170
Khống vi lượng Hàm lượng sau cùng (mg/l)
H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.4H2O 8,6 KI 0,83 NaMoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025
FeSO4.7H2O 27,8
Na2EDTA 37,3
Vitamin MS Hàm lượng sau cùng (mg/l)
Glysin 2 Thiamin HCl 0,1 Acid nicotinic 0,5 Pyrodoxin 0,5 Agar 7 - 8g/l pH 5,8 2.1.3. Vật liệu thí nghiệm Giống
Giống vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ đất trồng lúa ở An Giang.
Giống lúa sử dụng trong các thí nghiệm là giống OM4495.
Giống cải thìa do cơng ty TNHH-TMSX-Hạt giống Hưng Nơng-Số 49-Bình Tây-P1-Q6-TPHCM cung cấp.
Đất
Lúa trong chậu và ngồi ruộng được trồng trên đất đê bao thuộc huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang.
Đất trồng rau thuộc loại đất xám bạc màu, thành phần cơ giới nhẹ, cát nhiều thuộc quận Tân Bình, Tp Hồ Chí Minh.
Than bùn
Than bùn dùng trong nghiên cứu được khai thác ở huyện Tri Tơn, tỉnh An Giang.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập 2.2.1. Phân lập
Mơi trường sử dụng để phân lập là mơi trường NFb bán lỏng (MT1). Tất
và khi phát triển chúng hình thành một lớp váng mỏng phía dưới bề mặt mơi
trường. Mơi trường NFb rắn (MT2) dùng để nhận diện khuẩn lạc của Azospirillum
trên đĩa petri : Azospirillum sẽ tạo khuẩn lạc đỏ tươi hoặc đỏ đậm do chúng cĩ
khả năng hấp thu congo đỏ, trong khi đĩ các vi sinh vật đất khác khơng cĩ khả năng hấp thu congo đỏ nên khuẩn lạc khơng cĩ màu đỏ.
Tiến trình phân lập [21] :
Nghiền đất vùng rễ, hịa với nước cất vơ trùng.
Ống nghiệm nhỏ (khoảng 10ml) chứa 5ml NFb bán lỏng vơ đạm cho nhiễm với huyền phù đất vùng rễ.
Sau khi ủ 30oC 3 ngày, cĩ sự hình thành váng mỏng. Sử dụng lớp váng này
để phân lập bằng cách trải dịch vi khuẩn trên mơi trường NFb rắn (MT2). Ủ 3 ngày nhận thấy trên mơi trường xuất hiện 2 dạng khuẩn lạc cĩ màu sắc khác nhau : trắng và đỏ. Những khuẩn lạc màu đỏ cĩ thể là khuẩn lạc của vi khuẩn
Azospirillum.
Thuần khiết giống
Các dạng khuẩn lạc màu đỏ vừa phân lập sẽ tiếp tục được làm thuần : Huyền phù tế bào vi khuẩn trong nước muối sinh lý vơ trùng và trải dịch
pha lỗng lên đĩa petri mơi trường, ủ ở 30oC trong 3 ngày.
Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc đỏ đặc trưng và tiếp tục cấy ria trên mơi trường đến khi biểu hiện một dạng khuẩn lạc đồng nhất. Để xác định giống thuần khiết khi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi qua hình dạng của vi khuẩn và nhuộm Gram.
Chọn khuẩn lạc từ giống thuần khiết, cấy ria trên ống thạch nghiêng chứa
mơi trường Dobereiner, ủ ở 30oC. Sau 3 ngày khi khuẩn lạc phát triển đầy ống
thạch, đem cất giữ trong tủ lạnh 10oC để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
định kỳ mỗi tháng một lần hoặc bảo quản giống trong dung dịch glycerine 40% (phương pháp lạnh đơng).
2.2.2. Tuyển chọn chủng Azospirillum cĩ khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt IAA tốt
Khả năng cố định đạm vi khuẩn
Xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldahl.
Chủng vi khuẩn được nuơi cấy trong các bình cĩ chứa 100ml mơi trường vơ đạm - Dobereiner. Sau 7 ngày lấy dịch nuơi cấy vơ cơ hĩa và xác định đạm tổng số. Lượng đạm xác định được chính là lượng đạm do vi khuẩn cố định được sau 7 ngày nuơi cấy.
Khả năng sinh IAA của vi khuẩn
IAA hay cịn gọi là β-indole acetic acid hay indole-3-acetic acid thuộc
nhĩm auxin.
Tryptophan là một amino acid cĩ thể bị oxy hĩa bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indole. Sản phẩm trung gian chính của phản ứng oxy hĩa tryptophan là indole pyruvic acid - IPA. Phân tử này sau đĩ bị biến đổi theo hướng loại bỏ nhĩm amin thành indole hoặc theo hướng loại nhĩm carboxyl thành skatol. Tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhĩm amin thành indole.
Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tơi chọn phương pháp hĩa học để phát hiện IAA
thơng qua thuốc thử Salkowski (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3).
Vi khuẩn được cấy trên mơi trường Dobereiner rắn cĩ bổ sung 0,01%
tryptophan. Đặt giấy lọc vơ trùng lên trên vết cấy. Ủ ở 30oC. Sau 3 ngày, lấy
giấy lọc ra đặt lên giấy lọc khác đã bão hịa trong thuốc thử Salkowski.
Thành phần thuốc thử Salkowski:
FeCl3 0,5M 15ml
H2SO4 98% 300ml
Nước cất 500ml
Thuốc thử sau khi pha xong cần bảo quản trong bình màu tối.
Xem kết quả sau 30phút. Vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ hiện màu hồng với thuốc thử. Đối chứng 1 : giấy lọc đặt trên đĩa mơi trường khơng cĩ vi khuẩn, đối chứng 2 : IAA chuẩn nồng độ 1000ppm.
yĐịnh lượng
- Dựng đồ thị chuẩn
Cân chính xác 25000μg IAA chuẩn hịa tan với 100ml nước cất được dung
dịch cĩ nồng độ 250μg/l (dung dịch ban đầu). Lấy 1 - 13ml dịch ban đầu cho vào
bình định mức 100. Lần lượt các bình được bổ sung nước cất đến 100ml. Như vậy
các bình chứa dung dịch cĩ nồng độ thay đổi từ 2,5μg/ml đến 32,5μg/ml. Ở mỗi
nồng độ lấy 2ml và thêm vào đĩ 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8 ml thuốc thử). So màu ở bước sĩng 530nm. Đọc chỉ số OD và dựng đường chuẩn.
-Định lượng IAA trong dịch nuơi cấy vi khuẩn
Cấy vi sinh vật trên mơi trường Dobereiner cĩ bổ sung 0,01% tryptophan,
lắc liên tục 120vịng/phút ở 30oC. Qua mỗi ngày đem dịch ly tâm 3500vịng/phút
trong 20phút để thu lấy dịch trong. Lấy 2ml dịch trong cho vào 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8ml thuốc thử Salkowski), so màu
chiếu vào đồ thị chuẩn để xác định lượng IAA sinh ra trong quá trình nuơi cấy.
Hàm lượng IAA tính theo đơn vị μgIAA/ml.
2.2.3. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa của chủng được chọn chọn
Đặc điểm hình thái: yQuan sát đại thể
Chuẩn bị các đĩa petri chứa mơi trường Dobereiner cĩ độ dày 5mm. Sau
khi làm khơ bề mặt thạch cấy vi khuẩn. Nuơi cấy ở 30oC. Quan sát khuẩn lạc sau
5 ngày.
yQuan sát vi thể àHình dạng :
Cấy vi khuẩn từ mơi trường thạch nghiêng (mơi trường Dobereiner) vào ống nghiệm chứa 5ml mơi trường Dobereiner bán lỏng. Nuơi cấy trên máy lắc
với tốc độ 130vịng/phút ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dạng và đo kích thước tế
bào vi khuẩn sau 24giờ nuơi cấy dưới kính hiển vi thơng qua tiêu bản nhuộm đơn.
àNhuộm Gram
Dựa vào khả năng bắt màu với các thuốc nhuộm tím kết tinh và iode, tất cả các vi khuẩn được chia thành 2 nhĩm lớn. Nhĩm giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iode khi xử lý bằng alcool là những vi khuẩn Gram dương, nhĩm khơng cĩ khả năng giữ được phức chất này và bị mất màu khi xử lý bằng alcool là những vi khuẩn Gram âm.
Dùng que cấy lấy một ít nước cất vơ trùng đặt lên phiến kính. Từ mơi trường đặc dùng que cấy khử trùng để nguội, lấy vi khuẩn Gram dương -
Staphylococcus, làm huyền trọc vi trùng vào giọt nước trên phiến kính, bắt đầu ở bìa giọt nước để cĩ huyền trọc vừa đủ đậm đặc. Dùng que cấy lấy vi khuẩn đang
khảo sát hịa trộn vào vi khuẩn trong giọt nước trên phiến kính. Dàn mỏng thành
vết bơi. Cố định nhẹ trên ngọn lửa. Tiến hành nhuộm tiêu bản.
àKhả năng di động
Vi khuẩn được nuơi cấy trên mơi trường dịch thể 18giờ. Hịa dịch vi khuẩn vào ống nước muối sinh lý vơ trùng. Sau 30phút làm tiêu bản giọt treo để xem khả năng di động của vi khuẩn. Tiến hành nhuộm tiên mao theo phương pháp Nishizawa Kaghen [2] để xác định vi khuẩn đơn mao hay đa mao.
Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa
yQuan hệ với oxy :
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10ml mơi trường Dobereiner thạch đứng.
Dùng que cấy thẳng cấy thẳng từ trên mặt thạch vào ống mơi trường ngập đến 2/3
ống. Ủ 30oC. Sau 72giờ đọc kết quả : vi khuẩn hiếu khí bắt buộc chỉ phát triển
trên bề mặt, vi khuẩn kỵ khí bắt buộc chỉ phát triển dọc theo đường cấy, vi khuẩn hiếu khí tùy ý thì phát triển trên bề mặt lẫn dọc theo đường cấy.
yKhả năng sử dụng một số nguồn carbon
Khả năng đồng hĩa và lên men các nguồn thức ăn carbon ở các loại vi khuẩn khác nhau là khơng giống nhau. Người ta coi đĩ là một trong những đặc tính quan trọng được sử dụng khi định danh vi khuẩn. Cơ sở của quá trình này là nuơi cấy vi khuẩn trên các mơi trường chứa nguồn carbon khác nhau, xác định sự phát triển của vi khuẩn qua sự đổi màu của mơi trường với sự hiện diện của chất chỉ thị màu.
àKhả năng sử dụng nguồn carbon trên mơi trường vơ đạm
Cấy vi khuẩnvào mơi trường dịch thể vơ đạm - NFb với D,L- malat được
thay bằng glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Sau 48giờ nuơi cấy quan sát sự đổi màu của chỉ thị pH - Bromothymol blue trong mơi trường và tiến hành đo trị số mật độ quang. Vi khuẩn phát triển làm acid hĩa mơi trường
(pH<6), mơi trường sẽ chuyển từ màu xanh lá cây sang vàng. Ngược lại, vi khuẩn
phát triển làm kiềm hĩa mơi trường (pH>7,6), mơi trường sẽ chuyển từ màu xanh
lá cây sang màu xanh dương.
à Khả năng sử dụng nguồn carbon trên mơi trường dịch thể Andrade
Cấy vi khuẩnvào mơi trường dịch thể Andrade với các loại đường được
thay đổi là glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Quan sát sự đổi màu của chỉ thị fuchsin acid bổ sung vào mơi trường sau 48giờ nuơi cấy. Nếu vi khuẩn cĩ khả năng phát triển trên mơi trường này sẽ làm mơi trường chuyển từ màu vàng sang màu hồng do cĩ sự acid hĩa mơi trường làm đổi màu của chất chỉ thị.
yKhả năng khử nitrate
Việc khử nitrate thành nitrite xảy ra ở các vi sinh vật sản sinh enzyme nitratereductase và sử dụng nitrate để làm nguồn thức ăn nitơ. Đơi khi cĩ trường hợp khử nitrate đến nitrogen phân tử.
Khả năng khử nitrate được thấy rõ trong mơi trường cao thịt – pepton bổ
sung 0,2% KNO3 (MT5). Trong mơi trường cao thịt - pepton với 0,2% KNO3, nếu
vi khuẩn cĩ khả năng khử nitrate thành nitrite thì chúng sẽ làm đục mơi trường. Nitrite sẽ được phát hiện bằng phản ứng tinh bột - iode với nitrite (phản ứng tạo màu xanh lam). Nếu vi khuẩn cĩ khả năng khử nitrate tới nitơ phân tử thì sẽ làm đục mơi trường và cĩ bọt khí trong ống Durham.
Phân bố mơi trường MT5 vào các ống nghiệm cĩ chứa các ống Durham, hấp khử trùng 1atm/15 phút. Cấy vi khuẩn nghiên cứu vào mơi trường. Nuơi cấy 4 ngày. Quan sát khả năng khử nitrate thành nitrite. Nếu phản ứng với tinh bột - iode, tiếp tục theo dõi đến 8 ngày xem vi khuẩn cĩ khử nitrite đến nitrogen phân tử.
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn 2.2.4.1. Chuẩn bị 2.2.4.1. Chuẩn bị
y Khử trùng và ủ hạt lúa
Chọn hạt lúa đều nhau, chắc, khơng vết mốc. Ngâm hạt trong nước máy 24giờ. Rửa bằng nước máy nhiều lần. Rửa bằng xà phịng lỗng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Lau hạt bằng bơng gịn thấm nước. Rửa lại bằng nước máy. Sau đĩ thực hiện trong điều kiện vơ trùng : rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 2 lần.
Khử mẫu bằng alcool 70o, lắc 3 - 5phút, loại bỏ cồn. Khử mẫu tiếp bằng Javel
pha lỗng với nước cất vơ trùng theo tỷ lệ (1 : 1), thêm 2 - 3 giọt Tween 80, lắc liên tục trong 30phút. Rửa lại bằng nước cất vơ trùng cho đến khi sạch mẫu. Cho hạt vào phịng ẩm (đĩa petri chứa giấy thấm vơ trùng được tẩm ướt bằng nước cất
vơ trùng). Ủ ở 30oC đến khi hạt nảy mầm khoảng 1cm (khoảng 3 ngày).
y Chuẩn bị dịch nuơi cấy vi khuẩn
Cấy dịch vi khuẩn đã được hoạt hĩa 24giờ vào mơi trường Dobereiner, ủ
30oC. 48giờ thu dịch sinh khối. Đồng thời xác định mật độ tế bào trong dịch nuơi
cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên mơi trường Dobereiner thạch đĩa theo cơng thức :
Mi (CFU/ml) = Ai * Di / V
Ghi chú : Mi : mật độ tế bào trong 1 ml dịch nuơi cấy Ai : số khuẩn lạc trung bình trên đĩa
Di : độ pha lỗng
V : dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Dùng 10ml dịch nuơi cấy vi khuẩn ủ cho 30 hạt lúa nảy mầm. Đối chứng là hạt được ngâm trong mơi trường MT3. Tại các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12giờ cấy
các hạt lúa được ủ vào mơi trường MS và nuơi với điều kiện ánh sáng 2000lux,
nhiệt độ 25oC.
Sau 7 ngày tiến hành đo chiều cao cây mạ ở các lơ thí nghiệm.
2.2.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngồi ruộng : ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngồi ruộng :