thực vật [17]
Ngồi sự tăng hoặc giảm các chỉ số sinh trưởng và phát triển của rễ, vi
khuẩn Azospirillum cịn ảnh hưởng đến thay đổi các chỉ số về lá. Sự thay đổi cĩ
liên quan trực tiếp đến sự hấp thu NO3-, NH4+, PO43-, K+, Rb+ và Fe2+. Đĩ là nguyên nhân của sự gia tăng hàm lượng chất khơ do tích lũy khống chất ở thân và lá. Người ta cho rằng việc tăng cường khống chất được coi là nguyên nhân
tăng thể tích và trọng lượng khơ của rễ [24]. Thực vậy, nhiễm khuẩn Azospirillum
làm cho lượng ion trong đất tăng lên và do đĩ giúp cây khắc phục được tình trạng
nghèo chất dinh dưỡng. Chính điều đĩ giải thích vì sao khi xử lý Azospirillum nif-
cây vẫn hấp thu rất hiệu quả nitơ mặc dù trong đất cĩ rất ít. Chính vì thế, dù lượng nitơ bĩn vào đất cĩ thấp hơn nhu cầu vẫn đảm bảo được sản lượng thu hoạch ổn định. Vài nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt tính tiếp nhận proton
liên quan trực tiếp đến sự cân bằng ion ở rễ. Xử lý Azospirillum đã làm cho hoạt tính thu nhận proton ở rễ lúa mì tăng lên một cách rõ rệt.
Nhiễm khuẩn Azospirillum cịn cải thiện được chế độ nước ở cây. Các cây
cao lương được nhiễm khuẩn chịu hạn tốt hơn do tích lũy được nhiều nước ở lá. Tiềm năng giữ nước tăng cao hơn đồng thời nhiệt độ tán lá cũng thấp hơn so với
cây đối chứng khơng nhiễm Azospirillum.
1.3.4.4. Quan hệ giữa nitratereductase của cây chủ và vi khuẩn
Azospirillum [17]
Hiện nay cĩ nhiều giả thuyết cho rằng nitratereductase (NR) của vi khuẩn là nguyên nhân khởi đầu tạo nên sự tích lũy nhiều nitơ ở cây chủ do nhiễm
Azospirillum : cho nhiễm Azospirillum NR+ vào rễ cây làm cho hoạt tính của
enzyme này ở lá giảm hẳn và ngược lại, nhiễm Azospirillum NR- làm cho hoạt
tính của enzyme này ở lá tăng hơn so với nhĩm Azospirillum NR+. Kết quả thử
nghiệm xử lý Azospirillum brasilense sp 245 bố mẹ NR+ và thể đột biến của nĩ là
NR- đã xác nhận thể đột biến cĩ hiệu ứng tăng sản ít hơn rất nhiều so với chủng
bố mẹ NR+. Điều đĩ cũng chứng tỏ cố định nitơ khơng phải là cơ chế duy nhất
giúp cho cây tăng sản bởi vì cả chủng bố mẹ lẫn chủng đột biến đều cĩ khả năng cố định nitơ khơng khí. Cĩ lẽ chủng bố mẹ giúp cây trồng khử nitrate ngay rễ và
do đĩ giảm được sự chuyển nitrate lên lá. Trong khi chủng đột biến NR- khơng cĩ
khả năng làm được điều đĩ nên nitrate tiếp tục được di chuyển lên lá.
1.4 Phân vi sinh vật [7]
1.4.1 Định nghĩa
Phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật sống, cĩ ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất cĩ hoạt tính kích thích sinh trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nơng sản, tăng độ màu mỡ cho đất. Các
chủng vi sinh vật này khơng ảnh hưởng xấu đến người, vật nuơi, mơi trường sinh thái và chất lượng nơng sản (Theo “Quy định tạm thời về chất lượng phân bĩn vi sinh vật cho cây trồng” ban hành kèm theo quyết định số 161/QĐ-TĐC ngày 04- 03-1995 của Bộ Khoa học Cơng nghệ và Mơi trường).
Phân vi sinh vật gồm hai thành phần : thành phần hoạt động và chất mang. Thành phần hoạt động là sinh khối các loại vi sinh vật cĩ ích, tạo nên tác dụng của loại phân này với cây trồng và đất đai. Thành phần chính này khơng thể nhìn thấy bằng mắt thường. Cịn chất mang là vật liệu dùng để cố định vi sinh vật. Chúng tạo nên hình thái của sản phẩm, dễ nhận thấy và phân biệt được, nhưng chỉ đĩng vai trị như những chiếc xe tải chuyên chở sinh khối vi sinh vật từ nơi sản xuất đến nơi áp dụng.
1.4.2 Phân loại
Cĩ nhiều cách phân loại phân vi sinh vật. Theo chức năng sử dụng người ta cĩ thể cĩ các loại sau :
- Phân bĩn vi sinh vật cố định đạm : tên thương phẩm là phân đạm vi sinh.
- Phân bĩn vi sinh vật phân giải các hợp chất phospho khĩ tan : tên thương
phẩm là phân lân vi sinh.
- Phân bĩn vi sinh vật phân giải cellulose.
- Phân bĩn vi sinh vật quang hợp.
Các loại phân này chỉ mang tính lý thuyết vì trên thực tế hầu hết các loại phân vi sinh đều sử dụng một hỗn hợp nhiều loại vi sinh vật cĩ nhiều chức năng khác nhau.
Chế phẩm phân vi sinh thường dùng các loại chất mang như : than bùn, đất với bụi xơ dừa hay bột đậu nành, trộn đất với than củi, vermiculite, mùn cưa bị phân hủy, phân trộn trấu, mùn vỏ cà phê… Các chất mang cĩ thể hấp khử trùng hay khơng từ đĩ người ta cĩ thể chia thành hai loại :
- Phân bĩn vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng.
- Phân bĩn vi sinh vật trên nền chất mang khơng thanh trùng.
1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật
Việc sử dụng các loại phân vi sinh vật trong nơng, lâm nghiệp đều hướng tới các mục tiêu sau :
- Giảm nhu cầu sử dụng các hĩa chất tổng hợp dùng trong trồng trọt, đặc
biệt là các loại phân bĩn vơ cơ và các loại thuốc bảo vệ thực vật, tạo điều kiện chuyển nền nơng nghiệp hĩa học sang nền nơng nghiệp hữu cơ.
- Nâng cao chất lượng mơi trường và bảo vệ các nguồn lợi tự nhiên của hệ
sinh thái.
- Nâng cao khả năng sử dụng các nguồn lợi cĩ sẵn trong thiên nhiên, của
các loại phế phụ phẩm nơng nghiệp sẵn cĩ trong từng địa phương.
- Bảo đảm chất lượng và độ an tồn của các loại nơng sản.
1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn
Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn cố định đạm. Quá trình sản xuất chế phẩm phân vi sinh vật hầu hết đều được thực hiện theo các bước cơ bản sau :
Giữ giống và nhân giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn cĩ ý nghĩa vơ cùng quan trọng trong cả quá trình sản xuất. Các chủng vi khuẩn dùng để sản xuất đều cĩ những đặc tính hữu ích như : khả năng cố định đạm, sức cạnh tranh, dễ nuơi cấy để thu sinh khối…
Quá trình giữ giống địi hỏi phải đảm bảo duy trì độ thuần khiết về các đặc tính trên. Thường người ta giữ các chủng vi khuẩn này ở dạng đơng khơ.
Việc nhân giống vi khuẩn thực hiện bằng các biện pháp khác nhau, nhưng đều dựa trên nguyên tắc tăng sinh khối vi khuẩn để cung cấp cho sản xuất (lên men thu sinh khối). Biện pháp nhân giống phổ biến hiện nay là cấy trong bình
nĩn dung tích 200 - 300ml đặt lên các thiết bị lắc cĩ tần số 100 - 300dao động/phút để cung cấp khơng khí cho vi khuẩn phát triển. Phần lớn các quá trình sản xuất đều sử dụng mơi trường thu sinh khối để nhân giống.
Mơi trường nhân sinh khối trong quá trình sản xuất phân vi sinh
Mơi trường sản xuất phải bao gồm đầy đủ các chất dinh dưỡng tối ưu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình tạo sinh khối như : nguồn carbon, nitơ, pH, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinh trưởng … Mỗi loại vi khuẩn yêu cầu một nguồn dinh dưỡng khác nhau. Do vậy phải căn cứ vào các đặc tính sinh lý của chúng mà thành lập mơi trường nhân sinh khối để sản xuất cho thích hợp và cĩ giá thành thấp.
Một đặc điểm đáng lưu ý là các vi khuẩn cố định đạm cĩ ít nhiều bị ảnh hưởng trong quá trình nuơi cấy trên mơi trường tổng hợp. Các chất đạm vơ cơ đẩy mạnh quá trình phát triển của vi khuẩn tạo nên một lượng sinh khối phù hợp với yêu cầu sản xuất nhưng khả năng hình thành nốt sần và hoạt tính khử acetylen của chúng ít nhiều bị giảm. Cịn trong các mơi trường khơng cĩ đạm hầu hết các vi khuẩn này phát triển yếu. Điều này trong thực tế thường xảy ra, khi tiến hành nhiễm chế phẩm đạm vi sinh thì lượng phân bĩn cho cây đã được thay thế, nhưng lại cho kết quả âm tính, mà sự tăng sản do nhiễm chế phẩm cĩ khi xảy ra trong điều kiện lượng phân đạm được bĩn rất cao đến mức cĩ thể ảnh hưởng xấu đến số lượng vi khuẩn trong vùng rễ.
pH và sự điều chỉnh pH trước khi nuơi cấy vi khuẩn cũng ảnh hưởng nhiều
đến quá trình tạo sinh khối. Trong quá trình thu sinh khối Azospirillum để sản
xuất phân vi sinh cố định đạm trên mơi trường acid hữu cơ, dịch nuơi cấy trở nên
kiềm ở cuối quá trình. Khi pH≥ 9, loại vi khuẩn này sẽ khơng cĩ khả năng tồn tại.
Do đĩ, trong quá trình nuơi cấy cần bổ sung đệm pH giúp cho quá trình đạt hiệu quả tốt hơn.
Thanh trùng mơi trường nhân sinh khối
Quá trình này nhằm loại bỏ hết các vi sinh vật lạ, khơng cĩ lợi trước khi cấy giống vi khuẩn cố định đạm để lên men thu sinh khối. Việc thanh trùng được thực hiện bằng hơi nước cĩ áp suất 1atm/30 phút. Trong nuơi cấy quy mơ lớn hoặc nuơi cấy trên mơi trường rắn, thời gian thanh trùng mơi trường sản xuất dài hơn và phụ thuộc vào mơi trường sản xuất.
Nhân sinh khối
Người ta cĩ thể sử dụng máy lắc cĩ tần số dao động khoảng 100 - 500dao động/phút để thu sinh khối vi khuẩn trong các bình thủy tinh nhỏ (250 - 500ml) chứa mơi trường lên men. Người ta sử dụng các thiết bị lên men, sục khí qua mơi trường nuơi cấy vi khuẩn để thu sinh khối của chúng. Phương pháp này cho năng suất cao hơn, tiết kiệm năng lượng, sử dụng nhân cơng nhiều hơn biện pháp trên, nhưng yêu cầu trình độ thao tác thành thục, chế độ cơng nghệ được dày cơng nghiên cứu và thực hiện nghiêm túc, phù hợp với từng loại vi khuẩn. Nếu khơng, loại hình nuơi cấy này rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật lạ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật cố định đạm.
Ngồi ra, cịn cĩ phương pháp nhân sinh khối trong mơi trường rắn. Ở phương pháp này địi hỏi thành phần, kích thước các phần tử của mơi trường thích hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Loại hình lên men này tuy đơn giản, cĩ thời gian tàng trữ chế phẩm lâu, nhất là những loại mơi trường đã được thanh trùng nhưng rất tốn cơng lao động và diện tích nhà xưởng, sản phẩm cho chất lượng khơng đồng đều và yêu cầu một lượng giống ban đầu khá lớn.
Chất mang là những chất làm nhiệm vụ duy trì sự sống của vi khuẩn cố định đạm trong thời gian tàng trữ, vận chuyển chúng đến nơi áp dụng. Chúng là thành phần quan trọng để tạo nên các loại phân vi sinh khác nhau.
Chất mang được trộn thêm dịch vi khuẩn đã được lên men đạt yêu cầu để tạo ra sản phẩm là phân vi sinh vật. Cĩ nhiều loại chất mang khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện của từng địa phương. Nhưng chúng đều phải cĩ đầy đủ các yếu tố sau :
- Cĩ độ hấp thụ cao, dễ chế biến.
- Khơng độc đối với vi sinh vật dùng để chế tạo phân vi sinh vật.
- Dễ thanh trùng.
- Cĩ sẵn ở địa phương và cĩ giá thành rẻ.
Tạo và đĩng gĩi sản phẩm
Sau khi hồn thành giai đoạn nhân sinh khối (đối với biện pháp thu sinh khối trên nền chất mang khơng thanh trùng) các sản phẩm lên men được nén thành dạng viên, dạng bột, … (đối với biện pháp thu sinh khối trên mơi trường rắn cĩ thanh trùng) chuyển một cách vơ trùng sang các túi đựng sản phẩm ; hoặc trộn dịch lên men vào chất mang (trong điều kiện vơ trùng), để lên men hỗn hợp trong thời gian ngắn, sau đĩ đĩng gĩi sản phẩm. Tùy theo điều kiện nuơi cấy khác nhau mà ta sử dụng phương thức đĩng gĩi khác nhau. Tuy nhiên cần phải thực hiện giai đoạn này một cách nghiêm ngặt để bảo đảm chất lượng sản phẩm.
Bảo quản sản phẩm
Trong điều kiện nước ta, phân vi sinh rất khĩ bảo quản trong điều kiện tự nhiên. Nhiệt độ cao làm cho độ sống sĩt của vi khuẩn giảm xuống. Với nhiệt độ
mơi trường từ 25 - 35oC phân vi sinh chỉ cĩ thời hạn bảo quản trong khoảng 3 - 4
trước các nhà nghiên cứu và những người sản xuất vì khi mật độ vi khuẩn giảm
xuống 103 - 104 tế bào/g phân thì các loại phân này khơng cịn giá trị sử dụng.
Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh từ vi khuẩn
Mơi trường sản xuất
Giống vi khuẩn Thanh trùng
Nhân giống cấp 1 Cấy giống
Chất mang Lên men thu sinh khối vi khuẩn
Thanh trùng Phối trộn, tạo sản phẩm
Sử dụng
Kiểm tra
Bảo quản
1.4.5 Phân vi sinh từ Azospirillum
Mục tiêu quan trọng nhất trong nghiên cứu Azospirillum là tìm cách ứng
dụng chế phẩm thương mại chứa nĩ trong trồng trọt (đối với các nước đang phát triển và phát triển). Cĩ rất ít các cơng trình nghiên cứu đề cập đến các kỹ thuật trồng trọt, điển hình là việc sử dụng nơng dược cĩ ảnh hưởng gì đến việc nhiễm
Sau khi xác định được tổ hợp “vi khuẩn – thực vật” cĩ triển vọng nhất thì việc ứng dụng trong sản xuất cĩ thu được kết quả dương tính hay khơng cần phải làm sáng tỏ ngay một số khía cạnh : vi khuẩn cĩ tiếp cận được với rễ hay khơng khi hệ rễ quá lớn chiếm một khơng gian đáng kể trong đất ; thời điểm chính xác mà cây cần được nhiễm vi khuẩn, kỹ thuật nhiễm vi khuẩn phải thực dụng, kinh tế và dễ thực hiện, sản phẩm sử dụng phải cĩ mật độ giống đủ để cạnh tranh trong tự nhiên và cĩ sức sống lâu bền [17].
Các chế phẩm được tạo ra phải đáp ứng các yêu cầu : khơ, đa dạng, đơn giản sử dụng, đồng nhất, bị phân giải sinh học do các vi sinh vật đất, khơng gây độc, vi khuẩn phải khơng tạp nhiễm, giải phĩng chậm, tồn tại được trong một thời gian dài và cĩ thể tiến hành sản xuất ở quy mơ lớn [17].
à Chế phẩm Rizolu [1]
Quy trình sản xuất chế phẩm do Nguyễn Thị Phương Chi, Nguyễn Ngọc
Dũng, Hà Thị Hồng Thanh đề xuất 1995. Cấy dịch nuơi vi khuẩn Azospirillum
vào mơi trường xốp than bùn với tỷ lệ 1 : 80 (ml/g). Sau 7 ngày nuơi ủ, chế phẩm
đạt 109tế bào/gram, cĩ thể bảo quản 6 tháng ở nhiệt độ phịng. Phương pháp sử
dụng chế phẩm : sử dụng 45g/sào mạ cấy. Xử lý qua 2 bước : trộn vào mầm lúa ngay trước khi gieo và hồ vào rễ mạ trước khi cấy.
à Chế phẩm Azogin [7]
Để sản xuất chế phẩm này người ta sử dụng mơi trường Dobereiner cải
tiến. Mơi trường được phân vào bình nĩn cĩ dung tích từ 250 - 500 ml ở mức 1/3
thể tích bình. Thanh trùng bằng hơi nước ở áp suất 1 atm/30 phút. Lượng giống cấy vào chiếm 1 - 5% thể tích mơi trường. Sau 48 - 72giờ nuơi cấy trên máy lắc cĩ tần số 120 - 200vịng/phút hoặc trong các thùng lên men được cấp 1 - 2lít
khơng khí cho mỗi lít mơi trường, nhiệt độ nuơi cấy 30 - 47oC, mật độ vi khuẩn cĩ
rồi chuyển một cách vơ trùng vào chung một bồn chứa. Từ đây chúng tiêm vào các chất mang đã được thanh trùng trước để tạo sản phẩm. Mỗi hecta gieo trồng sử dụng 500 - 800gram sản phẩm. Chất mang được sử dụng trong quy trình này là than bùn trộn với chất hữu cơ theo tỷ lệ 1 : 1, nghiền mịn qua rây 0,1mm, các túi