IAA tốt
Khả năng cố định đạm vi khuẩn
Xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldahl.
Chủng vi khuẩn được nuơi cấy trong các bình cĩ chứa 100ml mơi trường vơ đạm - Dobereiner. Sau 7 ngày lấy dịch nuơi cấy vơ cơ hĩa và xác định đạm tổng số. Lượng đạm xác định được chính là lượng đạm do vi khuẩn cố định được sau 7 ngày nuơi cấy.
Khả năng sinh IAA của vi khuẩn
IAA hay cịn gọi là β-indole acetic acid hay indole-3-acetic acid thuộc
nhĩm auxin.
Tryptophan là một amino acid cĩ thể bị oxy hĩa bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indole. Sản phẩm trung gian chính của phản ứng oxy hĩa tryptophan là indole pyruvic acid - IPA. Phân tử này sau đĩ bị biến đổi theo hướng loại bỏ nhĩm amin thành indole hoặc theo hướng loại nhĩm carboxyl thành skatol. Tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhĩm amin thành indole.
Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tơi chọn phương pháp hĩa học để phát hiện IAA
thơng qua thuốc thử Salkowski (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3).
Vi khuẩn được cấy trên mơi trường Dobereiner rắn cĩ bổ sung 0,01%
tryptophan. Đặt giấy lọc vơ trùng lên trên vết cấy. Ủ ở 30oC. Sau 3 ngày, lấy
giấy lọc ra đặt lên giấy lọc khác đã bão hịa trong thuốc thử Salkowski.
Thành phần thuốc thử Salkowski:
FeCl3 0,5M 15ml
H2SO4 98% 300ml
Nước cất 500ml
Thuốc thử sau khi pha xong cần bảo quản trong bình màu tối.
Xem kết quả sau 30phút. Vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ hiện màu hồng với thuốc thử. Đối chứng 1 : giấy lọc đặt trên đĩa mơi trường khơng cĩ vi khuẩn, đối chứng 2 : IAA chuẩn nồng độ 1000ppm.
yĐịnh lượng
- Dựng đồ thị chuẩn
Cân chính xác 25000μg IAA chuẩn hịa tan với 100ml nước cất được dung
dịch cĩ nồng độ 250μg/l (dung dịch ban đầu). Lấy 1 - 13ml dịch ban đầu cho vào
bình định mức 100. Lần lượt các bình được bổ sung nước cất đến 100ml. Như vậy
các bình chứa dung dịch cĩ nồng độ thay đổi từ 2,5μg/ml đến 32,5μg/ml. Ở mỗi
nồng độ lấy 2ml và thêm vào đĩ 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8 ml thuốc thử). So màu ở bước sĩng 530nm. Đọc chỉ số OD và dựng đường chuẩn.
-Định lượng IAA trong dịch nuơi cấy vi khuẩn
Cấy vi sinh vật trên mơi trường Dobereiner cĩ bổ sung 0,01% tryptophan,
lắc liên tục 120vịng/phút ở 30oC. Qua mỗi ngày đem dịch ly tâm 3500vịng/phút
trong 20phút để thu lấy dịch trong. Lấy 2ml dịch trong cho vào 8ml thuốc thử Salkowski (dịch đối chứng là 2ml nước cất và 8ml thuốc thử Salkowski), so màu
chiếu vào đồ thị chuẩn để xác định lượng IAA sinh ra trong quá trình nuơi cấy.
Hàm lượng IAA tính theo đơn vị μgIAA/ml.