2.2.4.1. Chuẩn bị
y Khử trùng và ủ hạt lúa
Chọn hạt lúa đều nhau, chắc, khơng vết mốc. Ngâm hạt trong nước máy 24giờ. Rửa bằng nước máy nhiều lần. Rửa bằng xà phịng lỗng. Rửa lại bằng nước máy nhiều lần. Lau hạt bằng bơng gịn thấm nước. Rửa lại bằng nước máy. Sau đĩ thực hiện trong điều kiện vơ trùng : rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 2 lần.
Khử mẫu bằng alcool 70o, lắc 3 - 5phút, loại bỏ cồn. Khử mẫu tiếp bằng Javel
pha lỗng với nước cất vơ trùng theo tỷ lệ (1 : 1), thêm 2 - 3 giọt Tween 80, lắc liên tục trong 30phút. Rửa lại bằng nước cất vơ trùng cho đến khi sạch mẫu. Cho hạt vào phịng ẩm (đĩa petri chứa giấy thấm vơ trùng được tẩm ướt bằng nước cất
vơ trùng). Ủ ở 30oC đến khi hạt nảy mầm khoảng 1cm (khoảng 3 ngày).
y Chuẩn bị dịch nuơi cấy vi khuẩn
Cấy dịch vi khuẩn đã được hoạt hĩa 24giờ vào mơi trường Dobereiner, ủ
30oC. 48giờ thu dịch sinh khối. Đồng thời xác định mật độ tế bào trong dịch nuơi
cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên mơi trường Dobereiner thạch đĩa theo cơng thức :
Mi (CFU/ml) = Ai * Di / V
Ghi chú : Mi : mật độ tế bào trong 1 ml dịch nuơi cấy Ai : số khuẩn lạc trung bình trên đĩa
Di : độ pha lỗng
V : dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Dùng 10ml dịch nuơi cấy vi khuẩn ủ cho 30 hạt lúa nảy mầm. Đối chứng là hạt được ngâm trong mơi trường MT3. Tại các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12giờ cấy
các hạt lúa được ủ vào mơi trường MS và nuơi với điều kiện ánh sáng 2000lux,
nhiệt độ 25oC.
Sau 7 ngày tiến hành đo chiều cao cây mạ ở các lơ thí nghiệm.
2.2.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngồi ruộng : ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngồi ruộng :
y Cây mạ trong ống nghiệm
Mục đích của thí nghiệm trong ống nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn trên cây mạ.
Cấy vi khuẩn vào mơi trường MT3, ủ 30oC. Đồng thời khử trùng và ủ hạt
lúa. Sau 2 ngày, khi cĩ rễ và thân mầm, vi khuẩn được 48giờ, tiến hành đếm số lượng tế bào trước khi cho hạt mầm nhiễm dịch vi khuẩn. Sau khi ngâm được 3giờ (thời gian thích hợp để nhiễm dịch vi khuẩn đạt hiệu quả), cấy hạt mầm vào ống nghiệm chứa mơi trường MS.
Kích thước ống nghiệm : φ25
Lượng mơi trường trong mỗi ống nghiệm : 15ml Giống lúa : OM4495
Mật độ : 1 cây/ ống nghiệm (15 cây/1 lơ)
Địa điểm thí nghiệm : tủ lưới ở Phịng Thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên được trang bị hệ thống đèn neon chiếu sáng 18giờ/ ngày, độ
chiếu sáng 2000lux, nhiệt độ 25oC.
Thí nghiệm cĩ 5 lơ. Các lơ thí nghiệm :
Lơ 1 : mơi trường MS vơ đạm, hạt mầm khơng nhiễm vi khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lơ 3 : mơi trường MS ¼ đạm, hạt mầm nhiễm vi khuẩn.
Lơ 4 : mơi trường MS ½ đạm, hạt mầm nhiễm vi khuẩn.
Lơ 5 : mơi trường MS nguyên đạm, hạt mầm khơng nhiễm vi khuẩn.
àChỉ tiêu theo dõi :
- Chiều dài lá (mm) - Trọng lượng khơ cây mạ (mg)
- Chiều dài rễ (mm) - Tổng số rễ
- Hàm lượng đạm tổng số (mg N / 1kg mẫu) bằng phương pháp Kjeldahl.
à Xử lý số liệu : phần mềm EXCEL 2003 và MSTATC. Số liệu là trung bình cộng của 15 cây, 3 lần lặp lại.
y Cây lúa trong chậu
Mục đích của thí nghiệm trong chậu là triển khai rộng các thí nghiệm trong ống nghiệm trong điều kiện tự nhiên cĩ tác động nhiều yếu tố về đất đai và thời tiết, đồng thời theo dõi được các giai đoạn sau thời kỳ cây mạ.
Chúng tơi tiến hành phân lập mẫu đất trước và sau khi gieo trồng để xác định sự hiện diện chủng khảo sát tồn tại trong đất.
Cấy vi khuẩn vào mơi trường MT3, ủ 30oC. Đồng thời khử trùng và ủ hạt
lúa. Sau 2 ngày, khi cĩ rễ và thân mầm, vi khuẩn được 48giờ tuổi, tiến hành đếm số lượng tế bào trước khi cho hạt mầm nhiễm dịch nuơi cấy vi khuẩn. Sau khi ngâm được 3giờ (thời gian thích hợp để nhiễm dịch nuơi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả), cấy hạt mầm vào chậu đất đặt ở vườn trường.
Chậu đất : hình trụ đứng, đáy hình trịn, đường kính đáy 30cm, chiều cao 20cm.
Lượng đất trong mỗi chậu : 15kg ; Chiều cao cột đất : 17cm Giống lúa : OM4495
Địa điểm thí nghiệm : Vườn Thí nghiệm Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TpHCM.
Ngày gieo: 15 tháng 11 năm 2004. Thí nghiệm được theo dõi đến lúc thu hoạch .
Thí nghiệm cĩ 2 lơ. Các lơ thí nghiệm :
Lơ 1 : đất được bĩn ½ đạm, hạt mầm khơng nhiễm vi khuẩn.
Lơ 2 : đất được bĩn ½ đạm, hạt mầm nhiễm vi khuẩn.
àChỉ tiêu theo dõi :
- Chiều dài lá (cm) - Trọng lượng hạt chắc (g)
- Tỷ lệ đẻ nhánh (nhánh) - Trọng lượng hạt lép (g)
- Số bơng (bơng) - Số lượng hạt chắc (hạt)
- Số lượng hạt lép (hạt)
à Xử lý số liệu : phần mềm EXCEL 2003 và MSTATC. Số liệu là trung bình cộng của 30 cây, 3 lần lặp lại.
y Cây lúa ngồi ruộng
Kết quả của thí nghiệm trong chậu cho chúng ta biết được rằng vi khuẩn cĩ ảnh hưởng lên cây mạ, từ đĩ tiến hành thí nghiệm ngồi đồng.
Mục đích của thí nghiệm ngồi ruộng là triển khai rộng các thí nghiệm trong chậu trong điều kiện tự nhiên cĩ tác động nhiều yếu tố về đất đai và thời tiết.
Chúng tơi tiến hành phân lập mẫu đất trước và sau khi gieo trồng để xác định sự hiện diện chủng khảo sát tồn tại trong đất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy vi khuẩn vào mơi trường MT3, ủ 30oC. Đồng thời khử trùng và ủ hạt
lúa. Sau 2 ngày, khi cĩ rễ và thân mầm, vi khuẩn được 48giờ tuổi, tiến hành đếm số lượng tế bào trước khi cho hạt mầm nhiễm dịch nuơi cấy vi khuẩn. Sau khi
Đc 4 5 1 2 3 26m 2m 2m 16m 32m
ngâm được 3giờ (thời gian thích hợp để nhiễm dịch nuơi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả), cấy hạt mầm vào các ơ ruộng thí nghiệm.
Thí nghiệm cĩ 6 lơ, 3 lần lặp lại thuộc 3 ruộng khác nhau. Mỗi lơ cĩ diện
tích 4m2 (2m × 2m) được bố trí trên cùng thửa ruộng (theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5 và 6). Ba lơ 1, 2, 3 liền nhau. Lơ 1 cách lơ 3 là 4m. Lơ 1 cách lơ 4 là 16m. Lơ 1 cách lơ 5 là 26m. Lơ 6 (đối chứng) cách lơ 5 là 32m. (Sơ đồ 2.1).
Sơ đồ 2.1. Các lơ thí nghiệm ngồi ruộng
Điều kiện canh tác theo tập quán nơng dân : lúa sạ khơ nên khơng bĩn lĩt, lượng phân chỉ tập trung bĩn thúc và nuơi địng.
Lúa 10 ngày xịt thuốc Nomeni và Whips.
Bĩn thúc 1 : 15 ngày sau khi sạ bĩn 50kg urê/ha.
Bĩn thúc 2 : 25 ngày sau khi sạ bĩn 50kg urê/ha và 50kg/ha DAP (20 – 20 – 15).
Bĩn nuơi địng : 35 ngày sau khi sạ bĩn 50kg urê/ha và 50kg KCl/ha. Lúa 45 ngày phun thuốc Trizone và Pensuper.
Lúa 60 ngày phun thuốc Anvil. Lúa 80 ngày phun thuốc Til.
Trong đĩ chỉ lơ 1 cĩ nhiễm Azospirillum. Các lơ 2, 3, 4, 5 và 6 khơng
nhiễm Azospirillum. Tuy nhiên, khi bĩn phân lần đầu, giảm ½ lượng phân ở các
lơ 1, 2, 3, 4 và 5 so với lơ 6 (lơ 6 sạ 40g urê/ 4m2 trong lúc đĩ chỉ dùng 20g
urê/4m2 đối với 5 lơ cịn lại). Giống lúa : OM4495
Địa điểm thí nghiệm : huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang.
Ngày sạ : 6 tháng 11 năm 2004. Thí nghiệm được theo dõi đến lúc thu hoạch .
àChỉ tiêu theo dõi :
- Chiều dài lá (cm) - Trọng lượng hạt chắc (g)
- Tỷ lệ đẻ nhánh (nhánh) - Trọng lượng hạt lép (g)
- Số bơng (bơng) - Số lượng hạt chắc (hạt)
- Năng suất (g/m2) - Số lượng hạt lép (hạt)
Cơng thức tính năng suất lúa :
Năng suất lúa/m2 = số bơng/m2 × số hạt/bơng × tỷ lệ hạt chắc
× trọng lượng hạt.
àPhương pháp theo dõi :
Chọn 5 cây theo đường chéo gĩc mỗi lơ thí nghiệm, dùng cọc cắm cố định theo dõi chiều dài lá, tỷ lệ đẻ nhánh. Số liệu là trung bình cộng của 5 cây và của 3 lần lặp lại.
Khi thu hoạch, đếm số bơng và số hạt, cân trọng lượng hạt là trung bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của 3 ơ, mỗi ơ cĩ diện tích 0,25m × 0,5m trong cùng 1 lơ thí nghiệm và của 3 lần
lặp lại.
àXử lý số liệu : phần mềm EXCEL 2003 và MSTATC.
2.2.5. Chế phẩm “phân vi sinh” 2.2.5.1. Chuẩn bị
Chuẩn bị vi khuẩn
à Theo dõi thời gian sinh trưởng
Mục đích chọn thời gian thu sinh khối nhiều, vi khuẩn sinh trưởng mạnh,
tiến hành cấy giống đã hoạt hĩa vào 50ml mơi trường MT3. Ủ ở 30oC và quan sát
sự sinh trưởng của giống trong 96giờ. Sau mỗi 12giờ xác định trị số mật độ quang và đếm tế bào sống gián tiếp thơng qua sự phát triển của khuẩn lạc. Lập bảng kết quả theo dõi sự sinh trưởng của giống bằng trị số mật độ quang theo thời gian nuơi cấy.
à Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng
Các lồi vi khuẩn cĩ quan hệ khơng giống nhau đối với nhiệt độ. Đối với mỗi lồi vi khuẩn cĩ ba giới hạn nhiệt độ : nhiệt độ thấp nhất, nhiệt độ cao nhất và nhiệt độ thích hợp nhất.
Tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường MT3 ở các nhiệt độ 18, 25,
30, 35, 40, 45, 50oC. Sau 48giờ lấy mẫu đo trị số mật độ quang (OD610nm). Nếu
nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn sẽ làm tăng độ đục mơi trường và thay đổi màu chỉ thị từ xanh lá cây sang xanh dương.
à Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng
Nồng độ ion hydro [H+] cĩ quan hệ chặt chẽ với sự phát triển của vi sinh
vật. Mỗi lồi vi sinh vật cĩ 3 giới hạn pH khác nhau : pH thấp nhất, pH thích hợp nhất và pH cao nhất.
Cấy vi khuẩn vào mơi trường MT3 với các giá trị pH khác nhau. Nếu pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn sẽ làm tăng độ đục mơi trường và thay đổi màu chỉ thị : pH trung tính mơi trường màu xanh lá cây, pH acid mơi trường màu vàng, pH kiềm mơi trường màu xanh dương.
Cấy vi khuẩn vào MT3 cĩ giá trị pH từ 4 đến 9 ở 30oC. Sau 48 giờ lấy mẫu
Chuẩn bị chế phẩm “phân vi sinh”
Chuẩn bị than bùn : than bùn được phơi khơ, sàng tách rác và tạp chất cơ
học, nghiền mịn [15].
Tạo độ ẩm thích hợp : theo dõi sự sinh trưởng của Azospirillum trên than
bùn đã hoạt hĩa bởi NH3 theo các độ ẩm khác nhau : 30% (1,5% NH3) , 40% (2%
NH3), 50% (2,5% NH3), 60% (3% NH3) thơng qua việc đếm khuẩn lạc khi vừa bổ
sung vi khuẩn vào than bùn đã được amon hĩa và sau 3 ngày nuơi cấy [15].
Xử lý với NH3 : Chọn độ ẩm cĩ số lượng vi sinh vật sau 3 ngày nuơi cấy
cao nhất cho từng vi khuẩn để tiếp tục khảo sát các tỷ lệ NH3 : 1,5% ; 1,8% ;
2,1% ; 2,4% ; 2,7%. Cũng tiến hành theo dõi mật độ tế bào như cách trên và chọn
ra tỷ lệ NH3 thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn khảo sát [15]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thêm dinh dưỡng : bổ sung mơi trường nuơi cấy Dobereiner thay vì bổ sung nước cất.
Bổ sung vi khuẩn Azospirillum vào than bùn đã được hấp khử trùng với độ
ẩm và NH3 thích hợp cho sự phát triển của từng chủng. Ủ ở nhiệt độ thích hợp
trong 3 ngày.
Sấy khơ ở 37 - 40oC.
2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày : trong chậu và rau cải ngắn ngày :
y Cây lúa trong chậu
Chúng tơi tiến hành phân lập mẫu đất trước và sau khi gieo trồng để xác định sự hiện diện chủng khảo sát tồn tại trong đất.
Chuẩn bị chế phẩm “phân vi sinh” và hạt mầm. Đất được trộn với chế phẩm và cấy hạt nảy mầm vào.
Chậu đất : hình trụ đứng, đáy hình trịn, đường kính đáy 30cm, chiều cao 20cm.
Lượng đất trong mỗi chậu : 15kg ; Chiều cao cột đất : 17cm được trộn với 10g chế phẩm.
Giống lúa : OM4495
Mật độ : 3 cây/chậu (30 cây/1 lơ)
Địa điểm thí nghiệm : Vườn Thí nghiệm Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TPHCM
Ngày gieo : 24 tháng 5 năm 2005. Thí nghiệm được theo dõi đến lúc thu hoạch .
àCác lơ thí nghiệm :
- Lơ 1 : “chế phẩm “ chủng khảo sát - Lơ 2 : than bùn hoạt hĩa
àChỉ tiêu theo dõi :
- Chiều dài lá (cm) - Trọng lượng hạt chắc (gram)
- Tỷ lệ đẻ nhánh (nhánh) - Trọng lượng hạt lép (gram)
- Số bơng (bơng) - Số lượng hạt chắc (hạt)
- Số lượng hạt lép (hạt)
à Xử lý số liệu : phần mềm EXCEL 2003 và MSTATC. Số liệu là trung bình cộng của 30 cây.
y Cải thìa
Chúng tơi tiến hành phân lập mẫu đất trước và sau khi gieo trồng để xác định sự hiện diện chủng khảo sát tồn tại trong đất. Đất trước khi thí nghiệm được trồng xà lách.
Chuẩn bị chế phẩm “phân vi sinh” và cây con. Đất được trộn với chế phẩm và cấy hạt nảy mầm vào.
Thí nghiệm cĩ 2 lơ, 3 lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm là trung bình cộng của 5 cây và của 3 lần lặp lại.
Diện tích mỗi lơ thí nghiệm : 1m2 (1m × 1m).
Địa điểm thí nghiệm : vườn rau ở quận Tân Bình – Thành phố Hồ Chí Minh.
Đối tượng : cải thìa con. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngày gieo : 15 tháng 6 năm 2005. Thí nghiệm được theo dõi đến lúc thu hoạch .
Các lơ thí nghiệm :
Lơ 1 : 50g “chế phẩm” chủng khảo sát. Lơ 2 : 50g than bùn hoạt hĩa.
àChỉ tiêu theo dõi
- Chiều cao cây (cm). - Trọng lượng cây (g).
- Số lá (lá). - Năng suất (g/m2).
àPhương pháp theo dõi
Chọn 5 cây theo đường chéo gĩc mỗi lơ thí nghiệm, dùng cọc cắm cố định theo dõi chiều cao cây, số lá, trọng lượng cây.
àPhương pháp xử lý số liệu
Số liệu được tính trung bình cộng kết quả của các lần lặp lại. Số liệu được xử lý với phần mềm EXCEL 2003 và MSTATC.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ
3.1. Phân lập
Đất và rễ sau khi phân lập trên mơi trường NFb rắn cĩ bổ sung congo đỏ thu được nhiều dạng khuẩn lạc khác nhau về màu sắc được thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1. Phân lập
Azospirillum từ đất vùng rễ lúa
Ở hình 3.1 cho thấy trên mơi trường cĩ 2 dạng khuẩn lạc cĩ màu sắc khác nhau, một dạng cĩ màu trắng và một dạng cĩ màu đỏ. Dạng màu đỏ cĩ thể là
khuẩn lạc của vi khuẩn Azospirillum.
Sau đĩ trích những khuẩn lạc cĩ dạng màu đỏ và tiến hành làm thuần.
Kết quả chọn được 5 dạng khuẩn lạc được ký hiệu A1, A2, A3, A4 và A5.
Nuơi cấy các chủng trên mơi trường cĩ congo đỏ 5 ngày. Qua khảo sát thơ đại, kết quả được ghi nhận ở hình 3.2 và bảng 3.1.
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuơi cấy trên mơi trường NFb rắn cĩ bổ sung congo đỏ
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên mơi trường NFb rắn cĩ bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuơi cấy Đặc điểm khuẩn lạc Chủng Hình dạng Kích thước (mm) Màu sắc Bề mặt khuẩn lạc Mép khuẩn lạc
A1 cầu, hơi lồi 0,66-0,71 đỏ nhạt trơn, bĩng, ướt, cấu tạo nhung, tạo 3 vịng đồng
tâm, ở giữa khuẩn lạc nhơ lên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhẵn
A2 trịn khơng
đều, lồi
1,1-1,5 đỏ đậm trơn, bĩng, nhày, tạo 5 vịng đồng tâm, ở giữa
khuẩn lạc nhơ cao
răng cưa
A3
cầu, lồi 0,63-1,05 đỏ đậm trơn, bĩng, nhày, tạo 4 vịng đồng tâm, ở giữa
khuẩn lạc nhơ cao
răng cưa
A4
cầu, hơi lồi 0,48-0,63 đỏ nhạt trơn, bĩng, ướt, tạo 2 vịng đồng tâm, ở giữa khuẩn
lạc nhơ lên
nhẵn
A5 trịn, hơi lồi 0,2-0,3 đỏ nhạt trơn, bĩng, ướt, tạo 3 vịng đồng tâm, ở giữa khuẩn
lạc nhơ lên
Qua bảng 3.1 và hình 3.2 nhận thấy trong cùng điều kiện nuơi cấy các dạng khuẩn lạc được chọn đều cĩ sự khác biệt về hình dạng, độ đậm nhạt về