Tất cả các chủng Azospirillum phân lập được đều cĩ khả năng cố định
đạm khá hiệu quả, khi sống tự do cũng như khi tồn tại trong quan hệ tổ hợp với thực vật. Khả năng cố định nitơ khơng khí được đánh giá bằng phản ứng khử
acetylen, đã phát hiện thấy sự gia tăng nitơ tổng số ở thân và hạt do nhiễm
Azospirillum.Vì thế đã coi cố định nitơ như là cơ chế chủ yếu và đầu tiên của các
hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật của Azospirillum. Mặc dầu sự cố định
nitơ khơng khí được diễn tả bằng phản ứng khử acetylen, nhưng chính xác hơn cả
là những dẫn liệu thu được khi sử dụng kỹ thuật hấp thu và pha lỗng 15N đã xác
định được sự gia tăng hoạt tính nitrogenase ở rễ nhiễm khuẩn, kết quả đĩ phù hợp với sự gia tăng tổng lượng nitơ ở cây chủ nhiễm khuẩn. Kết quả nhiễm
Azospirillum vào lúa mì và bắp cho thấy trong tồn bộ lượng nitơ của cây thì chỉ cĩ 18% là do cố định từ khơng khí, và trong tồn bộ lượng nitơ cố định cây chủ hấp thu được chừng 5% mà thơi. Tuy nhiên, chỉ một lượng nhỏ như thế cũng đủ để lý giải cho sự gia tăng hàm lượng nitơ tổng số ở cây chủ và do đĩ lượng nitơ của phân bĩn dù cĩ cao đến mức ức chế hoạt tính nitrogenase cũng khơng ảnh hưởng đến tăng sản dương tính ở cây chủ khi được nhiễm khuẩn [17].
1.3.4.2. Aûnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên sinh trưởng và phát triển ở thực vật [17]
Trong quá trình sinh trưởng nhiều lồi Azospirillum sản sinh ra các hormon
ngoại tiết cĩ tác dụng điều hịa sinh trưởng ở thực vật như indole-3-pyruvic acid
và indole-3-acetaldehyde là IAA ở A.lipoferum. Cĩ bằng chứng cho sự tồn tại con
đường tạo IAM ở A.brasilense, đĩ là sự hiện diện của indole-3-ethanol, indole-3-
methanol (IM) và indole-3-lactate (ILA) trong mơi trường nuơi cấy A.brasilense.
Hiệu quả của hormon ngoại tiết đến cây trồng hồn tồn phụ thuộc vào nồng độ sử dụng. Nồng độ sử dụng quá thấp thì ít cĩ hiệu quả. Nồng độ thấp (khoảng vài ppm đến vài chục ppm) sẽ gây hiệu quả kích thích sinh trưởng (tăng chiều cao, tăng sinh khối). Nồng độ sử dụng ở mức cao (hàng nghìn ppm) sẽ gây ức chế sinh trưởng. Nồng độ rất cao (trên chục nghìn ppm) sẽ gây nên sự hủy diệt bộ phận của tồn cây [18].
Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật cũng ảnh hưởng mạnh đến khả
năng khử acetylen của Azospirillum. Bằng chứng cho thấy khi xử lý các chất điều
hịa sinh trưởng (cả tổng hợp nhân tạo lẫn tách chiết từ dịch nuơi cấy vi khuẩn), hình thái và sự phát triển của rễ được khơi phục hồn tồn giống như khi xử lý
Azospirillum. Cụ thể là tạo ra những thay đổi về chiều dài rễ, rễ tạo ra nhiều lơng hút hơn, tăng tốc độ phân bào và biệt hĩa mơ tạo vùng sinh trưởng của rễ. Các
chủng cha mẹ Azospirillum và các thể đột biến tạo IAA ngoại tiết trong dịch nuơi
cấy ảnh hưởng mạnh đến phát triển hình thái của rễ, trong khi các thể đột biến mất khả năng tạo IAA ngoại tiết thì khơng cĩ khả năng làm thay đổi hình thái
của rễ. Nhiễm Azospirillum đã cải thiện sự cân bằng hormon ở các cá thể lúa mì
đột biến mất khả năng tạo hormon. Gần đây phát hiện được một lượng đáng kể
IAA và IBA ở rễ ngơ do nhiễm Azospirillum, trong khi ở rễ ngơ khơng nhiễm thì
hồn tồn khơng cĩ.
1.3.4.3. Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng khống của thực vật [17] thực vật [17]
Ngồi sự tăng hoặc giảm các chỉ số sinh trưởng và phát triển của rễ, vi
khuẩn Azospirillum cịn ảnh hưởng đến thay đổi các chỉ số về lá. Sự thay đổi cĩ
liên quan trực tiếp đến sự hấp thu NO3-, NH4+, PO43-, K+, Rb+ và Fe2+. Đĩ là nguyên nhân của sự gia tăng hàm lượng chất khơ do tích lũy khống chất ở thân và lá. Người ta cho rằng việc tăng cường khống chất được coi là nguyên nhân
tăng thể tích và trọng lượng khơ của rễ [24]. Thực vậy, nhiễm khuẩn Azospirillum
làm cho lượng ion trong đất tăng lên và do đĩ giúp cây khắc phục được tình trạng
nghèo chất dinh dưỡng. Chính điều đĩ giải thích vì sao khi xử lý Azospirillum nif-
cây vẫn hấp thu rất hiệu quả nitơ mặc dù trong đất cĩ rất ít. Chính vì thế, dù lượng nitơ bĩn vào đất cĩ thấp hơn nhu cầu vẫn đảm bảo được sản lượng thu hoạch ổn định. Vài nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt tính tiếp nhận proton
liên quan trực tiếp đến sự cân bằng ion ở rễ. Xử lý Azospirillum đã làm cho hoạt tính thu nhận proton ở rễ lúa mì tăng lên một cách rõ rệt.
Nhiễm khuẩn Azospirillum cịn cải thiện được chế độ nước ở cây. Các cây
cao lương được nhiễm khuẩn chịu hạn tốt hơn do tích lũy được nhiều nước ở lá. Tiềm năng giữ nước tăng cao hơn đồng thời nhiệt độ tán lá cũng thấp hơn so với
cây đối chứng khơng nhiễm Azospirillum.
1.3.4.4. Quan hệ giữa nitratereductase của cây chủ và vi khuẩn
Azospirillum [17]
Hiện nay cĩ nhiều giả thuyết cho rằng nitratereductase (NR) của vi khuẩn là nguyên nhân khởi đầu tạo nên sự tích lũy nhiều nitơ ở cây chủ do nhiễm
Azospirillum : cho nhiễm Azospirillum NR+ vào rễ cây làm cho hoạt tính của
enzyme này ở lá giảm hẳn và ngược lại, nhiễm Azospirillum NR- làm cho hoạt
tính của enzyme này ở lá tăng hơn so với nhĩm Azospirillum NR+. Kết quả thử
nghiệm xử lý Azospirillum brasilense sp 245 bố mẹ NR+ và thể đột biến của nĩ là
NR- đã xác nhận thể đột biến cĩ hiệu ứng tăng sản ít hơn rất nhiều so với chủng
bố mẹ NR+. Điều đĩ cũng chứng tỏ cố định nitơ khơng phải là cơ chế duy nhất
giúp cho cây tăng sản bởi vì cả chủng bố mẹ lẫn chủng đột biến đều cĩ khả năng cố định nitơ khơng khí. Cĩ lẽ chủng bố mẹ giúp cây trồng khử nitrate ngay rễ và
do đĩ giảm được sự chuyển nitrate lên lá. Trong khi chủng đột biến NR- khơng cĩ
khả năng làm được điều đĩ nên nitrate tiếp tục được di chuyển lên lá.
1.4 Phân vi sinh vật [7]
1.4.1 Định nghĩa
Phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật sống, cĩ ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất cĩ hoạt tính kích thích sinh trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nơng sản, tăng độ màu mỡ cho đất. Các
chủng vi sinh vật này khơng ảnh hưởng xấu đến người, vật nuơi, mơi trường sinh thái và chất lượng nơng sản (Theo “Quy định tạm thời về chất lượng phân bĩn vi sinh vật cho cây trồng” ban hành kèm theo quyết định số 161/QĐ-TĐC ngày 04- 03-1995 của Bộ Khoa học Cơng nghệ và Mơi trường).
Phân vi sinh vật gồm hai thành phần : thành phần hoạt động và chất mang. Thành phần hoạt động là sinh khối các loại vi sinh vật cĩ ích, tạo nên tác dụng của loại phân này với cây trồng và đất đai. Thành phần chính này khơng thể nhìn thấy bằng mắt thường. Cịn chất mang là vật liệu dùng để cố định vi sinh vật. Chúng tạo nên hình thái của sản phẩm, dễ nhận thấy và phân biệt được, nhưng chỉ đĩng vai trị như những chiếc xe tải chuyên chở sinh khối vi sinh vật từ nơi sản xuất đến nơi áp dụng.
1.4.2 Phân loại
Cĩ nhiều cách phân loại phân vi sinh vật. Theo chức năng sử dụng người ta cĩ thể cĩ các loại sau :
- Phân bĩn vi sinh vật cố định đạm : tên thương phẩm là phân đạm vi sinh.
- Phân bĩn vi sinh vật phân giải các hợp chất phospho khĩ tan : tên thương
phẩm là phân lân vi sinh.
- Phân bĩn vi sinh vật phân giải cellulose.
- Phân bĩn vi sinh vật quang hợp.
Các loại phân này chỉ mang tính lý thuyết vì trên thực tế hầu hết các loại phân vi sinh đều sử dụng một hỗn hợp nhiều loại vi sinh vật cĩ nhiều chức năng khác nhau.
Chế phẩm phân vi sinh thường dùng các loại chất mang như : than bùn, đất với bụi xơ dừa hay bột đậu nành, trộn đất với than củi, vermiculite, mùn cưa bị phân hủy, phân trộn trấu, mùn vỏ cà phê… Các chất mang cĩ thể hấp khử trùng hay khơng từ đĩ người ta cĩ thể chia thành hai loại :
- Phân bĩn vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng.
- Phân bĩn vi sinh vật trên nền chất mang khơng thanh trùng.
1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật
Việc sử dụng các loại phân vi sinh vật trong nơng, lâm nghiệp đều hướng tới các mục tiêu sau :
- Giảm nhu cầu sử dụng các hĩa chất tổng hợp dùng trong trồng trọt, đặc
biệt là các loại phân bĩn vơ cơ và các loại thuốc bảo vệ thực vật, tạo điều kiện chuyển nền nơng nghiệp hĩa học sang nền nơng nghiệp hữu cơ.
- Nâng cao chất lượng mơi trường và bảo vệ các nguồn lợi tự nhiên của hệ
sinh thái.
- Nâng cao khả năng sử dụng các nguồn lợi cĩ sẵn trong thiên nhiên, của
các loại phế phụ phẩm nơng nghiệp sẵn cĩ trong từng địa phương.
- Bảo đảm chất lượng và độ an tồn của các loại nơng sản.
1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn
Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn cố định đạm. Quá trình sản xuất chế phẩm phân vi sinh vật hầu hết đều được thực hiện theo các bước cơ bản sau :
Giữ giống và nhân giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn cĩ ý nghĩa vơ cùng quan trọng trong cả quá trình sản xuất. Các chủng vi khuẩn dùng để sản xuất đều cĩ những đặc tính hữu ích như : khả năng cố định đạm, sức cạnh tranh, dễ nuơi cấy để thu sinh khối…
Quá trình giữ giống địi hỏi phải đảm bảo duy trì độ thuần khiết về các đặc tính trên. Thường người ta giữ các chủng vi khuẩn này ở dạng đơng khơ.
Việc nhân giống vi khuẩn thực hiện bằng các biện pháp khác nhau, nhưng đều dựa trên nguyên tắc tăng sinh khối vi khuẩn để cung cấp cho sản xuất (lên men thu sinh khối). Biện pháp nhân giống phổ biến hiện nay là cấy trong bình
nĩn dung tích 200 - 300ml đặt lên các thiết bị lắc cĩ tần số 100 - 300dao động/phút để cung cấp khơng khí cho vi khuẩn phát triển. Phần lớn các quá trình sản xuất đều sử dụng mơi trường thu sinh khối để nhân giống.
Mơi trường nhân sinh khối trong quá trình sản xuất phân vi sinh
Mơi trường sản xuất phải bao gồm đầy đủ các chất dinh dưỡng tối ưu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình tạo sinh khối như : nguồn carbon, nitơ, pH, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinh trưởng … Mỗi loại vi khuẩn yêu cầu một nguồn dinh dưỡng khác nhau. Do vậy phải căn cứ vào các đặc tính sinh lý của chúng mà thành lập mơi trường nhân sinh khối để sản xuất cho thích hợp và cĩ giá thành thấp.
Một đặc điểm đáng lưu ý là các vi khuẩn cố định đạm cĩ ít nhiều bị ảnh hưởng trong quá trình nuơi cấy trên mơi trường tổng hợp. Các chất đạm vơ cơ đẩy mạnh quá trình phát triển của vi khuẩn tạo nên một lượng sinh khối phù hợp với yêu cầu sản xuất nhưng khả năng hình thành nốt sần và hoạt tính khử acetylen của chúng ít nhiều bị giảm. Cịn trong các mơi trường khơng cĩ đạm hầu hết các vi khuẩn này phát triển yếu. Điều này trong thực tế thường xảy ra, khi tiến hành nhiễm chế phẩm đạm vi sinh thì lượng phân bĩn cho cây đã được thay thế, nhưng lại cho kết quả âm tính, mà sự tăng sản do nhiễm chế phẩm cĩ khi xảy ra trong điều kiện lượng phân đạm được bĩn rất cao đến mức cĩ thể ảnh hưởng xấu đến số lượng vi khuẩn trong vùng rễ.
pH và sự điều chỉnh pH trước khi nuơi cấy vi khuẩn cũng ảnh hưởng nhiều
đến quá trình tạo sinh khối. Trong quá trình thu sinh khối Azospirillum để sản
xuất phân vi sinh cố định đạm trên mơi trường acid hữu cơ, dịch nuơi cấy trở nên
kiềm ở cuối quá trình. Khi pH≥ 9, loại vi khuẩn này sẽ khơng cĩ khả năng tồn tại.
Do đĩ, trong quá trình nuơi cấy cần bổ sung đệm pH giúp cho quá trình đạt hiệu quả tốt hơn.
Thanh trùng mơi trường nhân sinh khối
Quá trình này nhằm loại bỏ hết các vi sinh vật lạ, khơng cĩ lợi trước khi cấy giống vi khuẩn cố định đạm để lên men thu sinh khối. Việc thanh trùng được thực hiện bằng hơi nước cĩ áp suất 1atm/30 phút. Trong nuơi cấy quy mơ lớn hoặc nuơi cấy trên mơi trường rắn, thời gian thanh trùng mơi trường sản xuất dài hơn và phụ thuộc vào mơi trường sản xuất.
Nhân sinh khối
Người ta cĩ thể sử dụng máy lắc cĩ tần số dao động khoảng 100 - 500dao động/phút để thu sinh khối vi khuẩn trong các bình thủy tinh nhỏ (250 - 500ml) chứa mơi trường lên men. Người ta sử dụng các thiết bị lên men, sục khí qua mơi trường nuơi cấy vi khuẩn để thu sinh khối của chúng. Phương pháp này cho năng suất cao hơn, tiết kiệm năng lượng, sử dụng nhân cơng nhiều hơn biện pháp trên, nhưng yêu cầu trình độ thao tác thành thục, chế độ cơng nghệ được dày cơng nghiên cứu và thực hiện nghiêm túc, phù hợp với từng loại vi khuẩn. Nếu khơng, loại hình nuơi cấy này rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật lạ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật cố định đạm.
Ngồi ra, cịn cĩ phương pháp nhân sinh khối trong mơi trường rắn. Ở phương pháp này địi hỏi thành phần, kích thước các phần tử của mơi trường thích hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Loại hình lên men này tuy đơn giản, cĩ thời gian tàng trữ chế phẩm lâu, nhất là những loại mơi trường đã được thanh trùng nhưng rất tốn cơng lao động và diện tích nhà xưởng, sản phẩm cho chất lượng khơng đồng đều và yêu cầu một lượng giống ban đầu khá lớn.
Chất mang là những chất làm nhiệm vụ duy trì sự sống của vi khuẩn cố định đạm trong thời gian tàng trữ, vận chuyển chúng đến nơi áp dụng. Chúng là thành phần quan trọng để tạo nên các loại phân vi sinh khác nhau.
Chất mang được trộn thêm dịch vi khuẩn đã được lên men đạt yêu cầu để tạo ra sản phẩm là phân vi sinh vật. Cĩ nhiều loại chất mang khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện của từng địa phương. Nhưng chúng đều phải cĩ đầy đủ các yếu tố sau :
- Cĩ độ hấp thụ cao, dễ chế biến.
- Khơng độc đối với vi sinh vật dùng để chế tạo phân vi sinh vật.
- Dễ thanh trùng.
- Cĩ sẵn ở địa phương và cĩ giá thành rẻ.
Tạo và đĩng gĩi sản phẩm
Sau khi hồn thành giai đoạn nhân sinh khối (đối với biện pháp thu sinh khối trên nền chất mang khơng thanh trùng) các sản phẩm lên men được nén thành dạng viên, dạng bột, … (đối với biện pháp thu sinh khối trên mơi trường rắn cĩ thanh trùng) chuyển một cách vơ trùng sang các túi đựng sản phẩm ; hoặc trộn dịch lên men vào chất mang (trong điều kiện vơ trùng), để lên men hỗn hợp trong thời gian ngắn, sau đĩ đĩng gĩi sản phẩm. Tùy theo điều kiện nuơi cấy khác nhau mà ta sử dụng phương thức đĩng gĩi khác nhau. Tuy nhiên cần phải thực hiện giai đoạn này một cách nghiêm ngặt để bảo đảm chất lượng sản phẩm.
Bảo quản sản phẩm
Trong điều kiện nước ta, phân vi sinh rất khĩ bảo quản trong điều kiện tự nhiên. Nhiệt độ cao làm cho độ sống sĩt của vi khuẩn giảm xuống. Với nhiệt độ
mơi trường từ 25 - 35oC phân vi sinh chỉ cĩ thời hạn bảo quản trong khoảng 3 - 4