Thalassemia là bệnh lý thiếu máu tán huyết di truyền đơn gen. Kỹ thuật chẩn đoán đột biến di truyền đơn gen giai đoạn phôi tiền làm tổ (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders - PGT-M) là kỹ thuật phân tích di truyền phôi nhằm giảm nguy cơ mắc bệnh di truyền trên thai nhi ở các cặp vợ chồng mang gen bệnh. Bài viết trình bày đánh giá hiệu quả có thai khi thực hiện chuyển phôi được thực hiện PGT-M để loại các phôi mang đột biến gen gây bệnh thalassemia.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học XÉT NGHIỆM PHƠI TIỀN LÀM TỔ ĐỂ CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN DI TRUYỀN ĐƠN GEN GÂY THALASSEMIA Nguyễn Thị Cẩm Nhung1, Đặng Thị Huyền Trang1, Lưu Thị Minh Tâm1, Phan Thị Kim Anh1, Nguyễn Cao Trí2, Hồ Mạnh Tường1,2, Vương Thị Ngọc Lan3 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Thalassemia bệnh lý thiếu máu tán huyết di truyền đơn gen Kỹ thuật chẩn đoán đột biến di truyền đơn gen giai đoạn phôi tiền làm tổ (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders - PGT-M) kỹ thuật phân tích di truyền phơi nhằm giảm nguy mắc bệnh di truyền thai nhi cặp vợ chồng mang gen bệnh Mục tiêu: Đánh giá hiệu có thai thực chuyển phôi thực PGT-M để loại phôi mang đột biến gen gây bệnh thalassemia Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu loạt ca thực đơn vị hỗ trợ sinh sản bệnh viện Mỹ Đức Tất trường hợp có thực chuyển phôi làm PGT-M để loại phôi mang đột biến gen gây bệnh Thalassemia từ 5/2016 đến 07/2021 nhận vào nghiên cứu Kết cục tỷ lệ trẻ sinh sống Kết quả: Có 69 cặp vợ chồng với tổng số phôi 254 thực PGT-M để loại trừ đột biến gây Thalassemia Có 44 cặp vợ chồng có phơi khơng mang gen đột biến gây Thalassemia Chuyển phôi thực cho 44 người vợ Tỷ lệ làm tổ phôi tỷ lệ sinh sống 81,8% 43,3% Kết luận: PGT-M kỹ thuật hữu ích để ngăn ngừa bệnh thalassemia hệ người mang gen bệnh Từ khóa: α-Thalassemia, β-Thalassemia, Sàng lọc di truyền tiền làm tổ (PGT-A), xét nghiệm di truyền tiền làm tổ để chẩn đoán bất thường đơn gen (PGT-M) ABSTRACT PREIMPLANTATION GENETIC TESTING FOR MONOGENIC DISORDERS (PGT-M) FOR THALASSEMIA DISEASE Nguyen Thi Cam Nhung, Dang Thi Huyen Trang, Luu Thi Minh Tam, Phan Thi Kim Anh, Nguyen Cao Tri, Ho Manh Tuong, Vuong Thi Ngoc Lan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 26 - No - 2022: 34-41 Background: Thalassemia is a hereditary disease of the blood of humans resulting in anemia Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders (PGT-M) is a technique used to detect the gene mutation causing this disease in the embryos By using PGT-M, the risk of genetic disorders in the newborn of couples who are carriers of thalassemia is eliminated Objectives: To evaluate the outcomes of embryo transfer of embryos tested with PGT-M in couples being carrier of Thalassemia gene mutation Methods: A retrospective cohort study was conducted at IVFMD, My Duc Hospital All couples having PGT-M treatment due to carriers of Thalassemia gene mutation from May 2016 to July 2021 were included in Đơn Vị Hỗ Trợ Sinh Sản, Bệnh viện Đa Khoa Mỹ Đức Trung Tâm Nghiên Cứu HOPE, Bệnh viện Đa Khoa Mỹ Đức 3Bộ môn Phụ Sản, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS Nguyễn Thị Cẩm Nhung ĐT: 0941537939 34 Email: nhungntc@myduchospital.vn Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 the study Primary outcome was take-home baby rate Results: A total of 69 couples who underwent IVF cycle with PGT-M treatment were enrolled Biopsy was performed on 254 embryos Using combined PGT-M and Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGTA) methods, a total of 44 women had unaffected embryos and were able to transfer embryo The implantation rate and live birth rate were 81.8% and 43.3%, respectively Conclusion: PGT-M is a useful technology to prevent thalassemia disease in the offspring of recessive carriers Keywords: α-Thalassemia, β-Thalassemia, preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A), preimplantation genetic testing for monogenic disorders (PGT-M) sinh lý việc cung cấp oxy hệ thống ĐẶT VẤN ĐỀ tuần hoàn thai nhi(3) Thiếu máu tán huyết di truyền (Thalassemia) bệnh lý huyết học đơn gen, di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến giới Thalassemia có đặc trưng biểu giảm khơng có chuỗi globin hemoglobin (Hb) ảnh hưởng đến khoảng 4,8% dân số giới với di chứng nặng nề thể nặng tiềm ẩn truyền qua nhiều hệ(1) Bệnh lý di truyền phân bố phổ biến khu vực Địa Trung Hải Đông Nam Á, giới phát nghiên cứu từ năm 1925 Mỗi năm có khoảng 300000 – 500000 trẻ sinh bị bệnh thalassemia mức độ nặng giới Tỷ lệ người lành mang gen bệnh (carrier - người mang gen khơng có biểu bệnh lý nguồn di truyền gen bệnh cho hệ sau) thalassemia châu Á 1:20(2) Phân tử hemoglobin (Hb) phân tử tetramer bao gồm hai tiểu đơn vị α hai tiểu đơn vị không α, giống cấu trúc có kích thước Trong trẻ sơ sinh, phân tử Hb bao gồm chủ yếu hai chuỗi α globin hai chuỗi globin, người trưởng thành 95% phân tử Hb tuần hoàn bao gồm hai chuỗi αglobin hai chuỗi β-globin, chuỗi chứa nhân heme có nhiệm vụ vận chuyển cung cấp oxy cho mô, quan thể Sự khác biệt tiểu đơn vị tiểu đơn vị β người trưởng thành chứa alanin glycine vị trí 136, hai axit amin trung tính, khơng phân cực Sự khác biệt làm thay đổi cấu trúc protein, dẫn đến số khác biệt Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Thalassemia chia làm hai loại α-thalassemia β-thalassemia dựa việc thiếu tiểu đơn vị đặc hiệu Gen nhiễm sắc thể số 16 chịu trách nhiệm cho tổng hợp tiểu đơn vị α nên cặp NST 16 có alen chi phối tổng hợp α-globin Các thể lâm sàng αthalassemia phụ thuộc vào tổn thương 1, 2, alen Đột biến α-thalassemia gồm dạng đoạn khơng đoạn; có khoảng 35 đột biến đoạn 40 đột biến không đoạn ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng bệnh(4) Tại Việt Nam, nghiên cứu tác giả Nguyễn Khắc Hân Hoan (2013) cho thấy 98,7% bệnh α-thalassemia loại alen đột biến gây ra: -,, và ước tính có khoảng 2,5% dân số nước ta mang gen bệnh Số lượng chuỗi α-globin tạo biểu người mang gen nặng Cụ thể, biểu từ triệu chứng đến thiếu máu nhẹ phát có bệnh lý kèm, có dấu hiệu vàng da, gan lách to chí nặng thể phù thai chết sinh chết non Trong đó, gen nhiễm sắc thể số 11 kiểm soát sản sinh tiểu đơn vị β Đột biến gen β-globin xếp thành nhóm: gây hồn tồn chuỗi β-globin (βO) làm giảm số lượng chuỗi globin (β+) Các dạng đột biến β-globin chủ yếu đột biến điểm ảnh hưởng mức độ: đột biến mức độ phiên mã, đột biến chu trình liên quan RNA, đột biến dịch mã(5) Tuỳ theo số lượng gen β đột biến có biểu bệnh khác từ nhẹ 35 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học đến nặng như: phù thai từ bụng mẹ, thiếu máu nặng trẻ chưa đến tuổi, trẻ dễ nhiễm trùng, suy tim, … Tại Việt Nam có đột biến gây 95% trường hợp β-thalassemia gồm: CD17(A>T), -CD41/42(-TTCT), -28(A>G), CD71/72(A+), IVSI-1(G>T), IVSI-5(G>C), IVSII654(C>T) CD26 (GAG>AAG) với tỷ lệ mang gen 1,5%(6) nhân có mang gen bệnh lý Thalassemia có kết bước đầu Tuy nhiên, chưa có báo cáo kết với kết cục dài hạn kỹ thuật Chúng thực nghiên cứu với mục tiêu đánh giá kết có thai thực chuyển phơi thực PGT-M phụ nữ mang gen bệnh thalassemia Hiện nay, truyền máu phương pháp sử dụng phổ biến để điều trị bệnh thalassemia, nhiên, lượng sắt dư thừa trình truyền máu gây số vấn đề tim rối loạn nhịp tim, nhồi máu tim hay tử vong suy tim Ngoài ra, bệnh thalassemia thể nặng chữa khỏi liệu pháp tế bào gốc thực có phù hợp với kháng nguyên bạch cầu việc điều trị gây nhiều gánh nặng kinh tế Các biện pháp khám sàng lọc trước sinh giảm nguy sinh mang bệnh thalassemia Tuy nhiên, kết sàng lọc trước sinh ảnh hưởng đến thai nhi dẫn đến bỏ thai, gây ảnh hưởng tâm lý nặng nề cho gia đình Đối tƣợng nghiên cứu Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ kỹ thuật sử dụng để phân tích đặc tính di truyền phơi giúp giảm nguy mắc bệnh di truyền thai nhi cặp vợ chồng mang gen bệnh Ưu điểm PGT so với phương pháp chẩn đốn trước sinh thơng thường tránh việc chấm dứt thai kỳ Do đó, lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm (TTTON) lựa chọn tầm soát phát gen gây bệnh từ giai đoạn phôi tiền làm tổ TTTON góp phần tạo nên vật liệu di truyền cung cấp cho PGT-M, tế bào phơi sinh thiết Điều trị TTTON kết hợp sinh thiết phơi trường hợp hai vợ chồng có mang đột biến Thalassemia giúp giảm nguy đứa trẻ đời mang bệnh lý tương tự việc chấm dứt thai kỳ bất thường thiếu máu nặng Tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản bệnh viện Mỹ Đức, từ năm 2016, kỹ thuật sinh thiết phôi phối hợp với xét nghiệm di truyền tiền làm tổ cho nhóm đối tượng bệnh 36 ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Cặp vợ chồng muộn mang gen bệnh thalassemia Nghiên cứu thực Đơn vị Hỗ trợ sinh sản IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức, TP.HCM, thu nhận trường hợp CPT từ tháng 05/2016 đến tháng 07/2021 Tiêu chuẩn nhận Vợ chồng mang đột biến gen gây bệnh Thalassemia Thực thụ tinh ống nghiệm PGT-M Tiêu chuẩn loại Có bất thường tử cung tử cung dị dạng, dính buồng tử cung Xin nỗn Thực ni trưởng thành nỗn Phƣơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Báo cáo loạt ca hồi cứu Cỡ mẫu cách chọn mẫu Chọn toàn trường hợp thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu thời gian nghiên cứu Phương pháp tiến hành Sàng lọc cặp vợ chồng mang đột biến gen gây Thalassemia: Các cặp vợ chồng sàng lọc thường quy nguy bệnh thalassemia thơng qua huyết đồ Nếu có nghi ngờ, hai vợ chồng xác định phương pháp giải trình tự gen lab di truyền Tư vấn nghiên cứu lấy đồng thuận tham gia nghiên cứu: Nếu kết phân tích di truyền cho thấy hai vợ chồng mang gen bệnh thalassemia, cặp vợ chồng tư vấn nguy lợi ích kỹ thuật PGT-M Nếu Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Nghiên cứu Y học đồng ý tham gia, hai vợ chồng mời ký đồng thuận bắt đầu trình điều trị Điều trị thụ tinh ống nghiệm để tạo phôi ngày 5: Người vợ kích thích buồng trứng phác đồ ngắn (phác đồ GnRH đối vận) Khi có nang noãn từ 17mm trở lên, người vợ tiêm thuốc khởi động trưởng thành noãn Chọc hút noãn thực vào 36 sau Nỗn sau chọc hút nuôi cấy khoảng 2-3 tiến hành cho thụ tinh với tinh trùng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn Phơi ni cấy tới giai đoạn phôi nang, khoảng ngày sau ngày chọc hút nỗn Sinh thiết phơi nang để lấy vật liệu cho thực PGT-M: Phôi nang tiến hành sinh thiết, sử dụng hệ thống laser với kim chuyên dụng lấy khoảng từ đến tế bào ni phơi (Trophectoderm - TE) để phân tích di truyền Phôi sau sinh thiết đông lạnh riêng dụng cụ trữ có mã số kí hiệu phôi Các tế bào nuôi phôi gửi tới lab di truyền để phân tích Phân tích di truyền phôi: Tại trung tâm di truyền, tế bào nuôi phôi khuếch đại gen (Whole Genome Amplification – WGA) kit Picoplex WGA (Takara Bio, Hoa Kỳ) Sản phẩm WGA phân tích bước hệ thống NextSeq NGS, Illumina, Hoa Kỳ để xác định tình trạng bất thường số lượng hay cấu trúc NST Sau liệu tiếp tục phân tích bước chẩn đốn bất thường đơn gen phơi ngun bội tầm sốt bước Kết trả cho bác sĩ lâm sàng ghi rõ di truyền phôi đề xuất thứ tự ưu tiên chuyển phôi Chuyển phôi thực PGT-M: Trong chu kỳ kinh tiếp theo, bệnh nhân chuẩn bị niêm mạc tử cung để chuyển phôi trữ nội tiết ngoại sinh (estradiol valerate kết hợp micronized progesterone) Vào ngày chuyển phôi, phôi không mang gen bệnh rã đông chuyển vào buồng tử cung hướng dẫn siêu âm Hai tuần sau chuyển phôi, bệnh Chuyên Đề Sản Khoa – Nhi Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 nhân thử thai Nếu kết dương tính, bệnh nhân hẹn siêu âm sau tuần Hỗ trợ hồng thể trì đến tuần thứ thai kỳ Sau đó, thai phụ theo dõi thường quy phòng khám Sản, Bệnh Viện Mỹ Đức sinh Kết cục nghiên cứu Kết cục nghiên cứu tỷ lệ sinh sống sau chu kỳ chuyển phôi Các kết cục phụ bao gồm: tỷ lệ phôi lệch bội, tỷ lệ phôi không mang gen bệnh, tỷ lệ phôi mang gen bệnh thể dị hợp tử, tỷ lệ beta hCG dương tính, tỷ lệ thai lâm sàng, tỷ lệ đa thai, tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ sẩy thai, tỷ lệ thai dị tật bẩm sinh Quản lý phân tích số liệu Các số liệu phân tích gồm thơng số phơi học thường quy thơng số di truyền mẫu phơi: số nỗn chọc hút, số noãn trưởng thành, số noãn thụ tinh, số phôi nang, số phôi tốt ngày 5/6, số phôi trữ lạnh, tỷ lệ phôi nguyên bội, tỷ lệ phôi lệch bội, tỷ lệ phôi bất thường cấu trúc NST, tỷ lệ phôi khảm, tỷ lệ phôi mang đột biến đồng hợp tử lặn, tỷ lệ phôi không mang đột biến đồng hợp tử lặn, tỷ lệ sẩy thai lâm sàng, tỷ lệ trẻ sinh sống Các số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn hay dạng phần trăm Sự khác biệt giá trị trung bình kiểm định Student’s t-test cho liệu theo luật phân phối chuẩn, giá trị phần trăm kiểm định khác biệt Chi-square test, khác biệt có ý nghĩa thống kê xác định P