Hóa học – Sinh học – Môi trường T T Lượng, , N X Bình, “Tối ưu quy trình tách chiết saponin từ quả bồ hòn ” 316 TỐI ƯU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT SAPONIN TỪ QUẢ BỒ HÒN Tạ Thị Lượng 1,2 , Lưu Hồng Sơn 1 , Nguyễn Mai Hiên 1 , Vi Đại Lâm 1 , Trịnh Thị Chung 1 , Trần Văn Chí 1 , Đinh Thị Kim Hoa 1 , Nguyễn Thị Tình 1 , Ngô Xuân Bình 1 Tóm tắt Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố loại dung môi, nhiệt độ, thời gian tách chiết, tỷ lệ dung môinguyên liệu, ảnh hưởng tới quá trình tách chiết saponin. TỐI ƯU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT SAPONIN TỪ QUẢ BỒ HÒN Tạ Thị Lượng1,2, Lưu Hồng Sơn1 , Nguyễn Mai Hiên1 , Vi Đại Lâm1 , Trịnh Thị Chung1 , Trần Văn Chí1 , Đinh Thị Kim Hoa1 , Nguyễn Thị Tình1 , Ngô Xuân Bình1 Tóm tắt: Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố loại dung môi, nhiệt độ, thời gian tách chiết, tỷ lệ dung môinguyên liệu, ảnh hưởng tới quá trình tách chiết saponin từ quả bồ hòn cho kết quả tương ứng: H2O, 80C, 30 phút, 101 (mlg). Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ, tỷ lệ dung môi nguyên liệu, thời gian tách chiết là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình chiết tách. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box Behnken đã tìm được điều kiện tối ưu quá trình tách chiết saponin từ quả bồ hòn như sau: nhiệt độ 79,28 ºC, thời gian tách chiết 30,70 phút, tỷ lệ dung môinguyên liệu là 9,831 (mlg), khi đó hàm lượng saponin là 17,7983g100g. Kết quả thực nghiệm cho kết quả có độ tương thích cao với mô hình. Từ khóa: Công nghệ sinh học; Box Behnken; Bồ hòn. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bồ hòn có tên khoa học: Sapindus mukorossi Gaertn hay vô hoạn thụ; Bòn hòn; Mộc hoạn tử; Mác hón (Tày); Co hón (Thái); Mầy quyến ngần (Dao). Cây gỗ to, cao 5 – 10m hoặc cao hơn, rụng lá vào mùa khô. Cây được trồng ở khắp các tỉnh miền Bắc nước ta như tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Hà Tây, Phú Thọ, Hà Giang, Tuyên Quang 2, 4. Saponin trong quả bồ hòn có công thức cấu tạo là C52H84O11.2H2O, khi thủy phân cho genin là hederagenin và đường là L arabinose, DI – glucose, L – rthamnose, và D – xylose. C22H84O11. Các saponin có trong bồ hòn như saponin A. B, C, D, E, E1, X, Y, Y2,… là những saponin có hoạt tính bề mặt mạnh. Do tính chất hoạt động bề mặt của chúng, saponin là chất tạo bọt tuyệt vời, tạo thành các bọt rất ổn định. Chính vì vậy, người ta dùng quả bồ hòn để làm nước rửa bát, đũa, quần áo. Sự hiện diện của saponin đã được nghiên cứu và báo cáo ở hơn 100 họ thực vật. Các nghiên cứu gần đây đã tìm ra những lợi ích của saponin như: kiểm soát mức cholesterol trong máu, sức khoẻ xương, ung thư và xây dựng hệ miễn dịch. Ngoài ra,
Hóa học – Sinh học – Mơi trường TỐI ƯU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT SAPONIN TỪ QUẢ BỒ HỊN Tạ Thị Lượng1,2*, Lưu Hồng Sơn1, Nguyễn Mai Hiên1, Vi Đại Lâm1, Trịnh Thị Chung1, Trần Văn Chí1, Đinh Thị Kim Hoa1, Nguyễn Thị Tình1, Ngơ Xn Bình1 Tóm tắt: Mục đích nghiên cứu khảo sát đơn yếu tố loại dung môi, nhiệt độ, thời gian tách chiết, tỷ lệ dung mơi/ngun liệu, ảnh hưởng tới q trình tách chiết saponin từ bồ cho kết tương ứng: H2O, 80C, 30 phút, 10/1 (ml/g) Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách, nhận thấy nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian tách chiết yếu tố ảnh hưởng mạnh đến trình chiết tách Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken tìm điều kiện tối ưu trình tách chiết saponin từ bồ sau: nhiệt độ 79,28 ºC, thời gian tách chiết 30,70 phút, tỷ lệ dung mơi/ngun liệu 9,83/1 (ml/g), hàm lượng saponin 17,7983g/100g Kết thực nghiệm cho kết có độ tương thích cao với mơ hình Từ khóa: Cơng nghệ sinh học; Box - Behnken; Bồ ĐẶT VẤN ĐỀ Bồ hịn có tên khoa học: Sapindus mukorossi Gaertn hay vơ hoạn thụ; Bịn hịn; Mộc hoạn tử; Mác hón (Tày); Co hón (Thái); Mầy quyến ngần (Dao) Cây gỗ to, cao – 10m cao hơn, rụng vào mùa khô Cây trồng khắp tỉnh miền Bắc nước ta tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Hà Tây, Phú Thọ, Hà Giang, Tuyên Quang [2, 4] Saponin bồ hịn có cơng thức cấu tạo C52H84O11.2H2O, thủy phân cho genin hederagenin đường L- arabinose, DI – glucose, L – rthamnose, D – xylose C22H84O11 Các saponin có bồ hịn saponin A B, C, D, E, E1, X, Y, Y2,… saponin có hoạt tính bề mặt mạnh Do tính chất hoạt động bề mặt chúng, saponin chất tạo bọt tuyệt vời, tạo thành bọt ổn định Chính vậy, người ta dùng bồ để làm nước rửa bát, đũa, quần áo Sự diện saponin nghiên cứu báo cáo 100 họ thực vật Các nghiên cứu gần tìm lợi ích saponin như: kiểm soát mức cholesterol máu, sức khoẻ xương, ung thư xây dựng hệ miễn dịch Ngoài ra, saponin hợp chất có đặc tính chất tẩy rửa chúng có chứa thành phần hịa tan nước chất béo [1, 3, 5] Tuy nhiên, chưa có cơng bố khoa học tối ưu hóa tách chiết saponin từ bồ hịn Vì vậy, nghiên cứu hướng đầy triển vọng NỘI DUNG CẦN GIẢI QUYẾT 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Quả bồ thu mua xã La Hiên, huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên định danh kết luận loài phần vỏ sử dụng để phân tích Nguyên liệu rửa sạch, sau đem sấy nhiệt độ 60°C đến độ ẩm 10% Tiến hành bảo quản túi PE đặt hộp nhựa kín, lưu trữ nhiệt độ phịng, tránh ánh sáng ẩm 2.2 Hóa chất sử dụng Bảng Hóa chất sử dụng thí nghiệm STT Hóa chất Nơi sản xuất Ethanol 96% Việt Nam n- butanol 99% Việt Nam Ete dầu hỏa ( petroleum ether 30 - 60) Himedia, Ấn Độ Methanol 99,5% Himedia, Ấn Độ 316 T T Lượng, …, N X Bình, “Tối ưu quy trình tách chiết saponin từ bồ hịn.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ 2.3 Phương pháp định lượng saponin từ bồ Bột nguyên liệu chiết với ete dầu hỏa để loại chất béo, sau chiết saponin MeOH: H2O = 4:1 Sau loại MeOH áp suất giảm Hịa cặn nước để có dung dịch 10 % lắc với n- butanol Tách lớp n- butanol bốc dung môi áp suất giảm đến cặn, để bình hút ẩm, cân đến khối lượng không đổi Thực thao tác chiết, cân lấy trung bình lần suy lượng saponin tồn phần ngun liệu Cơng thức tính hàm lượng saponin tồn phần [5]: S= x 100% Trong đó: - S hàm lượng saponin (%); - a khối lượng saponin toàn phần (g); - M khối lượng nguyên liệu (g) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập thống kê xử lý theo phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box - Behnken với ba biến ba cấp độ Các số liệu xử lý phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat- Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA Số liệu nghiên cứu xử lý phần mềm xử lý số liệu SPSS 20 MƠ PHỎNG, TÍNH TỐN, THẢO LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu lựa chọn dung mơi thích hợp Có nhiều dung mơi sử dụng cho trình tách chiết nước, ethanol, metanol, ete dầu hỏa,… Để đánh giá hiệu trích ly saponin bồ hịn Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng dung môi H2O, CH3OH, C2H5OH Kết trình bày bảng Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng saponin Công thức (CT) Dung môi Hàm lượng Saponin (g/100g) H2 O 15,01a CH3OH 15,14a C2H5OH 15,22a Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Qua bảng ta thấy tách chiết dung môi C2H5OH cho hàm lượng 15,22g cao Tuy nhiên, phương pháp cho hàm lượng saponin khơng có sai khác giá trị trung bình Theo Nguyễn Thị Ngọc Thúy cộng cho kết tương tự, sử dụng dung môi H2O [3] Vì vậy, chúng tơi lựa chọn dung mơi H2O dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc dễ áp dụng cho sản xuất quy mô công nghiệp 3.2 Kết nghiên cứu nhiệt độ tách chiết thích hợp Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng lớn tới hàm lượng saponin thu sau trình chiết Cứ tăng lên 10C tốc độ phản ứng tăng từ 2-4 lần Tuy nhiên, tăng nhiệt độ cao gây ảnh hưởng đến trạng thái, cấu trúc saponin Ngược lại, nhiệt độ thấp thời gian chiết kéo dài, khơng chiết kiệt chất Vì vậy, cần tìm giá trị nhiệt độ chiết phù hợp Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng sử dụng nhiệt độ 70, 80, 90 100C Kết trình bày bảng Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 317 Hóa học – Sinh học – Môi trường Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng saponin Công thức Nhiệt độ chiết (C) Hàm lượng saponin (g/100g) CT1 70 14,03b CT2 80 15,08a CT3 90 15,05a CT4 100 14,12b Ghi chú: chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Qua bảng ta thấy hàm lượng saponin dịch chiết tăng nhanh nhiệt độ từ 70C đến 80C, hàm lượng saponin tăng từ 14,03g lên 15,08g Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ lên 90C hàm lượng có xu hướng giảm Hàm lượng cao thu nhiệt độ 80C Nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy cộng cho nhiệt độ tách chiết saponin củ tam thất 40C, kết khác phương pháp sử dụng sóng siêu âm, vật liệu nghiên cứu khác [6] Vì vậy, chúng tơi chọn nhiệt độ thích hợp cho q trình chiết 80C Kết sử dụng cho thí nghiệm 3.3 Kết nghiên cứu thời gian chiết thích hợp Thời gian yếu tố ảnh hưởng lớn ảnh hưởng đến hàm lượng saponin Nếu thời gian chiết kéo dài hàm lượng saponin giảm mà cịn làm tăng lượng tạp chất q trình chiết Nhưng thời gian chiết ngắn khơng đủ cho hàm lượng saponin hòa tan hết gây tổn thất lớn Do vậy, cần phải xác định thời gian chiết tối ưu Thí nghiệm với cơng thức thời gian chiết 25, 30, 35 40 phút Kết trình bày bảng Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết Công thức Thời gian (phút) Hàm lượng saponin (g/100g) CT1 25 14,03a CT2 30 15,09a CT3 35 15,08a CT4 40 14,01b Ghi chú: chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Qua bảng 4, ta thấy thời gian có ảnh hưởng tới hàm lượng saponin chiết từ bồ Hàm lượng saponin tăng nhanh thời gian từ 25 phút đến 35 phút, hàm lượng saponin tăng từ 14,03g lên 15,09g Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian chiết hàm lượng có xu hướng giảm Hàm lượng cao thu thời gian 30 phút Nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy cộng cho kết thời gian tách chiết [6]; nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Thúy cho thời gian chiết 40 phút [3], khác nghiên cứu vật liệu, phương pháp nghiên cứu khác Vì vậy, chúng tơi chọn thời gian thích hợp cho q trình tách chiết 30 phút Kết đựợc sử dụng cho thí nghiệm 318 T T Lượng, …, N X Bình, “Tối ưu quy trình tách chiết saponin từ bồ hịn.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ 3.4 Kết nghiên cứu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp Hàm lượng dung mơi hay nhiều ảnh hưởng tới chất cần trích ly hiệu suất q trình trích ly Nếu lượng dung mơi khơng đủ cho q trình hịa tan hợp chất, chiết rút cấu tử ngồi mơi trường làm đủ ướt nguyên liệu Nếu dùng lượng dung mơi lớn gây lãng phí, tốn dung mơi, chi phí cao Thí nghiệm tiến hành để khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi đến hàm lượng saponin thu tìm tỷ lệ tốt cho q trình trích ly Kết trình bày bảng 5: Bảng Kết ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu chiết đến hàm lượng saponin Công thức Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g) Hàm lượng saponin (g/100g) CT1 5/1 15,10b CT2 10/1 17,91a CT3 15/1 17,92a Ghi chú: chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Qua bảng ta thấy tỷ lệ dung mơi/ngun liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng saponin chiết từ bồ Hàm lượng saponin dịch chiết tăng lên tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tăng Từ tỷ lệ 5/1 đến 15/1, hàm lượng saponin tăng từ 15,11g lên 17,92g Hàm lượng saponin tỉ lệ 10/1 15/1 khơng có sai khác Theo Nguyễn Thị Ngọc Thúy cộng cho tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 30/1 (v/w), khác vật liệu nghiên cứu đinh lăng sử dụng enzym [3] Vì vậy, chúng tơi chọn tỷ lệ dung mơi/ngun liệu thích hợp 10/1 (v/w) để tiết kiệm chi phí Kết sử dụng cho thí nghiệm 3.5 Kết tối ưu hóa điều kiện tách chiết Sử dụng phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box- Behnken với ba biến ba cấp độ Các số liệu thu từ dịch chiết bồ xử lý phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA dùng để đánh giá cao thu Tiến hành giải toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi” Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định giá trị ba yếu tố mà hàm lượng saponin cao Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy số liệu thực nghiệm, thu mô hình đa thức bậc hai thể hàm lượng saponin: 2 Y=+17,73 – 0,45* A + 0,44*B – 0,43*C + 0,62*A*B-0,83*A*C – 0,17*B*C - 1,15*A -1,29* B - 4,80* C Trong đó, Y hàm lượng saponin dịch chiết dự báo thu Bảng Kết ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Saponin từ bồ Biến thực Hàm lượng Saponin (g/100g) Nhiệt độ (C) Thời gian( phút) Dung môi/ Nguyên liệu(ml/g) 75 25 10 15,42 85 25 10 14,15 75 35 10 15,18 85 35 10 16,41 TN Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 319 Hóa học – Sinh học – Mơi trường 75 30 12,30 85 30 12,19 75 30 15 13,02 85 30 15 9,61 80 25 11,49 10 80 35 12,59 11 80 25 15 11,03 12 80 35 15 11,45 13 80 30 10 17,51 14 80 30 10 17,48 15 80 30 10 17,91 16 80 30 10 17,86 17 80 30 10 17,88 Để đánh giá mơ hình, chúng tơi sử dụng phân tích ANOVA Kết phân tích ANOVA thể qua bảng sau: Bảng Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình saponin từ bồ Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p 125,42 13,94 56,19 < 0,0001 A-nhiệt độ 1,58 1,58 6,39 0,0394 B- thời gian 1,57 1,57 6,32 0,0402 C- dm/nl 1,50 1 6,03 0,0437 AB 1,56 1,56 6,30 0,0404 AC 2,72 2,27 10,98 0,0129 BC Model 0,12 0,12 0,47 0,0516 5,56 5,56 22,41 0,0021 B 7,00 7,00 28,21 0,0011 C 96,97 96,97 390,97