(LUẬN văn THẠC sĩ) phân tích đặc điểm phân tử của canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THANH VIỆT Nguyễn Thanh Việt SINH HỌC THỰC NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHĨ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 download by : skknchat@gmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thanh Việt PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHĨ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS Thân Văn Thái Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Hoàng Dũng Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử Canine Parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính chó Thành phố Hồ Chí Minh” kết sự nghiên cứu nghiêm túc, được tiến hành dựa sự cố gắng học hỏi thân sự hướng dẫn nhiệt tình thầy TS Thân Văn Thái thầy TS Nguyễn Hoàng Dũng Tôi xin cam đoan số liệu, kết nghiên cứu kết luận luận văn hồn tồn trung thực Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Người cam đoan (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Thanh Việt download by : skknchat@gmail.com năm 2021 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hoàn thành luận văn, tôi nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu quý thầy cơ, anh chị bạn Với lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, thầy cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ chia sẻ tri thức tâm huyết mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Thân Văn Thái, Trường Đại học PHENIKAA; TS Nguyễn Hoàng Dũng, Viện Sinh học Nhiệt Đới,Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo toàn thể anh chị, bạn Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt anh chị Viện Khoa học môi trường nơi tôi công tác tận tình hướng dẫn bảo, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian thực tập Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, bạn tập thể lớp BIO2019B, người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trình học tập nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn TP HCM, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thanh Việt download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 10 1.1 Tổng quan về Canine parvovirus 10 1.2 Phân loại Canine parvovirus 11 1.3 Cấu trúc genome CPVs 11 1.4 Phương thức lây nhiễm CPVs 13 1.5 Đặc điểm sinh bệnh học CPVs 13 1.6 Phương pháp phòng điều trị bệnh 15 1.7 Các phương pháp thường dùng chẩn đoán bệnh CPVs gây 16 1.8 Các nghiên cứu nước về lưu hành CPVs 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Thời gian địa điểm thực 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Đối tượng nghiên cứu 23 2.4 Vật liệu nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu 23 2.4.2 Cách lấy mẫu bảo quản mẫu 23 2.5.1 Chẩn đoán CPVs Kít xét nghiệm nhanh 24 2.5.2 Phương pháp PCR 25 2.5.2.1 Tách chiết DNA 25 2.5.2.2 Thực phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) 25 2.5.3 Giải trình tự gen 27 2.5.4 Phân tích trình tự gene 28 2.5.5 Xây dựng phân tích phát sinh lồi 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết thu nhận mẫu 29 3.2 Kết PCR phát CPVs mẫu bệnh phẩm 30 3.3 Kết PCR khuyếch đại gen VP2 31 download by : skknchat@gmail.com 3.4 Kết PCR genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu 32 3.5 Kết giải trình tự gen VP2 33 3.6 Kết giải trình tự genome hồn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu 33 3.8 Kết phân tích so sánh trình tự amino acid (aa) VP2 protein 35 3.9 Kết phân tích phát sinh loài 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN CỦA TÁC GIẢ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 62 download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT CPV Canine parvovirus FPV Feline panleukopenia virus PCR Polymerase Chain Reaction NS1 Non-structural protein NS2 Non-structural protein ORF Open reading frame ssDNA Single-stranded DNA dsDNA Double-stranded DNA Ori origin of replication RCR rolling-circle replication PIF Parvovirus initiation factor SF3 superfamily ATP Adenosine triphosphat DNA Deoxyribonucleic acid TfR Transferrin receptor HI Hemagglutination Inhibition ddNTP dideoxynucleotide CL cell lysis PBS Phosphate-buffered saline WB1 washing buffer WB2 washing buffer EB elution buffer TAE Tris-acetate-EDTA Arg Arginine Lys Lysine Asn Asparagine download by : skknchat@gmail.com Glu Axit glutamic Gly Glycine Ile Isoleucine Leu Leucine Met Methionine Phe Phenylalanin Pro Proline Ser Serine Thr Threonine Tyr Tyrosine Val Valine download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng PCR………………………………… 25 Bảng 2.2 Primers sử dụng phản ứng PCR………………………………… 26 Bảng 2.3 Các cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự genome CPV………26 Bảng 2.4 Nhiệt độ thời gian phản ứng PCR…………………………… 27 Bảng 3.1 Kết thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy nghiên cứu này………29 Bảng 3.2 Kết sau điều trị có bị nhiễm CPV…………………………… 29 Bảng 3.3 Kết PCR phát CPVs mẫu thí nghiệm………………… 30 Bảng 3.4 Trình tự nucleotide amino acid gene VP2 mẫu CPVs sử dụng nghiên cứu này………………………………………………………….37 download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa CPVs theo thời gian………………………………….10 Hình 1.2 Cấu trúc Canine parvovirus ……………………………………… 11 Hình 1.3 Sơ đồ minh họa genome chủng CPV (mã số NC_001539) …………12 Hình 1.4 Kết chẩn đốn nhanh kháng nguyên CPVs………………………….16 Hình 2.1 Thu thập mẫu ……………………………………………………………24 Hình 2.2 Chẩn đốn nhanh kháng ngun CPVs ………………………………….24 Hình 2.3 Sơ đồ minh họa genome vị trí cặp mồi……………………………27 Hình 3.1 Kết PCR chẩn đốn CPVs ………………………………………… 30 Hình 3.2 Kết PCR khuếch đại trình tự đầy đủ gen VP2 ………………………31 Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu này…………………………………………………………………………… 32 Hình 3.4 Kết so sánh tương đồng trình tự hệ thống BLAST NCBI …… 33 Hình 3.5 So sánh trình tự genome chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập Trung Quốc ……………………………….34 Hình 3.6 Cây phát sinh lồi dựa gene VP2 nghiên cứu ……………39 Hình 3.7 Cây phát sinh loài dựa gene VP1 nghiên cứu ……………41 Hình 3.8 Cây phát sinh lồi dựa gene NS1 nghiên cứu ……………42 Hình 3.9 Cây phát sinh loài dựa gene NS2 nghiên cứu …………………43 Hình 3.10 Cây phát sinh lồi dựa vùng mã hóa genome nghiên cứu này………………………………………………………………………………….44 download by : skknchat@gmail.com 60 [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] phố Bến Tre, TNU Journal of Science and Technology, 197(04), pp 95-100 Chinchkar, S.R., Subramanian B.M., Rao N.H., Rangarajan P.N., Thiagarajan D., Srinivasan V.A., 2006, Analysis of VP2 gene sequences of canine 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Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54, tr 136 [45] Shackelton L.A., Parrish C.R., Truyen U., Holmes E.C., 2005, High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus, Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(2), pp 379384 [46] Soma T., Taharaguchi S., Ohinata T., Ishii H., Hara M., 2013, Analysis of the VP2 protein gene of canine parvovirus strains from affected dogs in Japan, Research in veterinary science, 94(2), pp 368-371 [47] Li C., Tang J., Chen Z., Li Q., Huang Z., Wang Q., Liu G., 2018., Genetic characterization of the complete genome of a mutant canine parvovirus isolated in China, Archives of virology, 163(2), pp 521-525 [48] Mira F., Purpari G., Lorusso E., Di Bella S., Gucciardi F., Desario C., Guercio, A., 2018, Introduction of Asian canine parvovirus in Europe through dog importation, Transboundary and emerging diseases, 65(1), pp 16-21 [49] Ogbu K.I., Mira F., Purpari G., Nwosuh C., Loria G.R., Schirò G., Guercio A., 2020, Nearly full‐length genome characterization of canine parvovirus strains circulating in Nigeria, Transboundary and emerging diseases, 67(2), pp 635647 [50] Wang D., Yuan W., Davis I., Parrish C.R., 1998, Nonstructural protein-2 and the replication of canine parvovirus, Virology, 240(2), pp 273-281 [51] Carter B.J., Tattersall P.J., 1987, Parvoviridae In Perspectives in Medical Virology 3, pp 325-334 [52] Reed A.P., Jones E.V., Miller T.J., 1988, Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus, Journal of virology, 62(1), pp 266-276 [53] Prittie, J 2004, Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management, and prevention, Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 14(3), pp167-176 download by : skknchat@gmail.com 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự gen VP2 Trình tự gen mã hóa protein cấu trúc VP2 chủng CPV-2c năm 2019 >CPV2-2c/Canine/HCM2019-01/VietNam/2019 ATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGT CTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAATTTAAATTT TTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTGCATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATA GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTA ACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATG AGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCA CCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCA GCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTACTTTCAATG GGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATG TTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATT TTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAACAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTG CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAA ACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGT CTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATG GTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATA TATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAG ATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATGTTTAATACTTATGGTCCTT TAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCA AGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCACCTAATTTAACA AATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTA TTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTA TGTACCAAGTAATATTGGAGGCATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA >CPV2-2c/Canine/HCM2019-02/VietNam/2019 ATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGT CTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAATTTAAATTT TTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTGCATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATA GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTA ACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATG AGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCA CCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCA GCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTACTTTCAATG GGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATG TTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATT TTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAACAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTG CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAA ACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGT CTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATG 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GAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTA ACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATG AGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCA CCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCA GCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTACTTTCAATG GGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATG TTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATT TTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAACAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTG CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAA ACACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGT CTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATG GTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATA 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Mục đích đề tài Phân tích đặc điểm phân tử Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính chó Thành. .. Thanh Việt PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHĨ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH:... cứu Canine parvovirus mẫu phân tiêu chảy cấp tính chó thu thập số phòng khám Thú y Tp Hồ Chí Minh 2.4 Vật liệu nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu Mẫu bệnh phẩm mẫu phân tiêu chảy cấp tính

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